孟文靜，苑青艷，吳金梅，汪德剛*

(1.林州中農(nóng)穎泰生物肽有限公司，河南 林州，456550；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院， 鄭州，450011)

HPLC法測(cè)定枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸含量

孟文靜1，苑青艷1，吳金梅2，汪德剛2*

(1.林州中農(nóng)穎泰生物肽有限公司，河南 林州，456550；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院， 鄭州，450011)

為了建立枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸含量的高效液相色譜(HPLC)測(cè)定方法，選用色譜柱Agilent Ecilpse plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈-0.1%氨水(70∶30)磷酸調(diào)pH=8.0，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫25 ℃。齊墩果酸和熊果酸能達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度R>2.5，齊墩果酸在0.20～7.94 μg、熊果酸在0.21～8.49 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。試驗(yàn)證明該方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于枇杷葉藥材的質(zhì)量控制。

枇杷葉；齊墩果酸；熊果酸；高效液相色譜法

枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eiobotryajaponica(Thunb．)lindl. 的干燥葉，我國(guó)大部分地區(qū)均有栽培，主要分布于中南地區(qū)及陜西、安徽、甘肅、浙江、江蘇、江西、福建、四川、貴州、云南、臺(tái)灣等省區(qū)。全年均可采收，曬干，刷去毛，切絲，干燥，生用或蜜炙用。枇杷葉始載于《名醫(yī)別錄》，列為中品。其味苦，微寒，歸肺、胃經(jīng)。具有清肺止咳，和胃降逆之功效。主要用于治療肺熱咳喘痰稠；胃熱煩渴，嘔噦。枇杷葉的化學(xué)成分主要包括三萜酸類(lèi)，如熊果酸、齊墩果酸、烏蘇酸等；揮發(fā)油類(lèi)，新鮮葉含揮發(fā)油0.045%～0.108%，油中主成分為橙花椒醇(Nerolidol)、金合歡醇(Farnesol)、α、β-蒎烯等；黃酮類(lèi)；糖苷類(lèi)；以及皂苷、鞣質(zhì)及維生素B1等，枇杷葉具有止咳[1]、抗炎[2]、降血糖[3]、降脂[4]、護(hù)肝[5]等藥理活性。其中三萜酸類(lèi)在枇杷葉中含量高，藥理藥效研究也主要集中在三萜酸類(lèi)，2010版《中國(guó)獸藥典》[6]將枇杷葉三萜酸類(lèi)中的齊墩果酸和熊果酸的總含量作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。齊墩果酸和熊果酸常用的檢測(cè)方法為高效液相色譜法，參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了大量試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)目前的檢測(cè)方法存在分離度低、響應(yīng)值小、基線(xiàn)平穩(wěn)性差等方面的問(wèn)題。由此，經(jīng)過(guò)不斷摸索改進(jìn)流動(dòng)相的組成和比例，采用HPLC法建立了枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試劑

美國(guó)Waters e2695高效液相色譜儀；美國(guó)Waters 2489紫外檢測(cè)器；紫外分光光度計(jì)，美國(guó)PerkinElmer公司，型號(hào)LAMBDA 35；KQ3200E型超聲波清洗器；齊墩果酸對(duì)照品(供含量測(cè)定用，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，110709～201206)；熊果酸對(duì)照品(供含量測(cè)定用，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，110742～201421)；枇杷葉藥材(購(gòu)自河南禹州藥材市場(chǎng))；乙腈和甲醇均為色譜純(德國(guó)默克Merck)，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 用甲醇將齊墩果酸、熊果酸和兩種三萜酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至一定濃度，作為對(duì)照品溶液，用純甲醇作空白對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm對(duì)對(duì)照品進(jìn)行全掃描，齊墩果酸、熊果酸和兩種三萜酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品分別在210.39、211.85、210.50 nm波長(zhǎng)下有最大吸收，所以將210 nm定為最大吸收波長(zhǎng)。

2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent Ecilpse plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-0.1%氨水(70∶30)磷酸調(diào)pH=8.0，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫25 ℃。

2.3 對(duì)照品溶液及樣品制備

2.3.1 對(duì)照品溶液配制 精密稱(chēng)量10 mg齊墩果酸(含量為94.9%)和10 mg熊果酸(含量為93.8%)，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度線(xiàn)，搖勻，分別制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 取枇杷葉粉末1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，超聲萃取1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm的微孔濾膜，即得[6]。進(jìn)樣量為20 μL。

齊墩果酸保留時(shí)間19 min，理論塔板數(shù)14000；熊果酸保留時(shí)間20 min，理論塔板數(shù)15900，兩種成分的分離度為2.57，大于標(biāo)準(zhǔn)要求的1.5，達(dá)到了完全分離。

對(duì)照品及樣品的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

a：齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品；b：枇杷葉藥材圖1 齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品及枇杷葉藥材色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備 分別精密吸取上述兩種對(duì)照品溶液10、25、50、100、200、400 μL置1 mL容量瓶中，用甲醇定容，制成不同濃度的混標(biāo)。進(jìn)樣量20 μL，按上述色譜條件上機(jī)測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，以齊墩果酸和熊果酸的濃度為橫坐標(biāo)，經(jīng)線(xiàn)性回歸處理，得到齊墩果酸和熊果酸的回歸方程分別為：Y=17356X-42797(r=0.99992)；Y=12368X-32442(r=0.99991)，結(jié)果表明，齊墩果酸在0.20～7.94 μg、熊果酸在0.21～8.49 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取上述兩種對(duì)照品溶液各0.2 mL，置于1 mL容量瓶，制成混標(biāo)。精密吸取混標(biāo)20 μL，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，按照上述色譜條件測(cè)定峰面積。齊墩果酸和熊果酸的RSD分別為1.4%、0.5%。結(jié)果顯示，儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量20 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。齊墩果酸RSD=0.7%，熊果酸RSD=0.8%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取枇杷葉藥材1 g，共6份，按照制備供試品溶液制備方法制備供試品，按照色譜條件測(cè)定峰面積，齊墩果酸RSD=0.26%，熊果酸RSD=0.15%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好，

2.8 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的枇杷葉藥材，共6份，精密加入齊墩果酸對(duì)照品和熊果酸對(duì)照品溶液，按2.3.2項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，按照色譜條件測(cè)定峰面積，并計(jì)算加樣回收率。齊墩果酸RSD=1.72%，熊果酸RSD=1.86%，結(jié)果表明方法回收率良好，見(jiàn)表1。

表1 枇杷葉藥材齊墩果酸和熊果酸回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 耐用性試驗(yàn) 耐用性試驗(yàn)是指測(cè)定條件在有小的變動(dòng)情況下，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度。在對(duì)柱溫(±5℃)、流速(±20%)、流動(dòng)相比例(±5%)、流動(dòng)相pH(±0.5)、檢測(cè)波長(zhǎng)(±2 nm)和色譜柱的改變進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示色譜條件小幅度的改變對(duì)色譜峰的分離度、峰面積影響皆符合要求，僅部分條件下的保留時(shí)間發(fā)生了變化,見(jiàn)表2。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜條件考察 齊墩果酸和熊果酸為枇杷葉中含量較高的兩種三萜酸類(lèi)成分，因?yàn)閮煞N成分為結(jié)構(gòu)相似，性質(zhì)相近的同分異構(gòu)體，并且在植物中常以結(jié)合或游離的形式同時(shí)存在，所以分離存在一定的難度。齊墩果酸和熊果酸的最大吸收波長(zhǎng)均為210 nm，屬于末端吸收，測(cè)定時(shí)易有干擾物質(zhì)，兩種物質(zhì)出峰時(shí)間也相差很短，藥典規(guī)定完全分開(kāi)的兩個(gè)峰的分離度需大于1.5，因此選取適宜的流動(dòng)相種類(lèi)和比例非常重要。

在水相的選擇上，試驗(yàn)參照國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)、《中國(guó)獸藥典》和《中國(guó)藥典》[7]中對(duì)枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的高效液相檢測(cè)方法，采用不同比例、不同濃度的乙酸銨[8-9]、磷酸[10-12]、冰醋酸[13]、磷酸鹽緩沖液[14]等試劑及其組合體系作為水相進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)乙酸銨溶液作為水相雖可以改變峰形，提高分離度(R>1.5)，但由于乙酸銨在210 nm處存在紫外吸收，導(dǎo)致基線(xiàn)呈波浪狀，影響主成分檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用磷酸或冰乙酸溶液作為水相時(shí)，基線(xiàn)較平，但分離度低(R=1.2)。

在有機(jī)相的選擇上，采用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，基線(xiàn)較為平穩(wěn)，且響應(yīng)高，峰形尖銳對(duì)稱(chēng)，單獨(dú)采用甲醇或甲醇、乙腈按一定比例混合作為有機(jī)相時(shí)，出峰慢且響應(yīng)低，因此乙腈較適合作為兩物質(zhì)檢測(cè)的有機(jī)相。

在流動(dòng)相pH值的選擇上，研究發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中齊墩果酸和熊果酸高效液相檢測(cè)方法所采用的流動(dòng)相多為酸性，其pH值在2～6之間，酸性環(huán)境并不有利于齊墩果酸和熊果酸的分離，而在堿性條件下，兩種物質(zhì)呈離子狀態(tài)，分離效果好，所以試驗(yàn)采用濃度為0.1%的氨水作為水相，通過(guò)磷酸調(diào)節(jié)pH值至8.0，以延長(zhǎng)所用色譜柱的壽命，在此前提下選擇洗脫效果較強(qiáng)的乙腈作為有機(jī)相，不斷調(diào)整有機(jī)相和水相的比例，使枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的分離度達(dá)到規(guī)定要求。最終色譜條件確定以乙腈-0.1%氨水(70∶30)磷酸調(diào)pH=8.0作為流動(dòng)相，采用Agilent Eclipse plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫25 ℃。可以在25 min內(nèi)有效分離齊墩果酸和熊果酸，齊墩果酸和熊果酸的分離度達(dá)到2.5以上，并且基線(xiàn)平穩(wěn)，峰形較佳。

3.2 前處理?xiàng)l件考察 在對(duì)枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的前處理方法選擇上，主要對(duì)提取溶劑和提取方法進(jìn)行了研究。采用了不同濃度的甲醇、乙醇作為提取溶劑，分別采用超聲和加熱回流兩種方法處理，通過(guò)含量測(cè)定進(jìn)行比較，最終選擇100%的甲醇超聲1 h為前處理?xiàng)l件。由于色譜圖前端色素峰響應(yīng)值很高，導(dǎo)致后端的齊墩果酸和熊果酸峰相對(duì)偏低，因此考察了甲醇提取前采用石油醚超聲除雜對(duì)色譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)石油醚除雜后的色譜與未除雜色譜并無(wú)明顯差異，故而可以省去此步驟。

采用本方法檢測(cè)枇杷葉藥材中的齊墩果酸和熊果酸含量，操作簡(jiǎn)單，方法穩(wěn)定，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確?？梢詾殍凌巳~藥材及其相關(guān)制劑質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

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(編輯：陳希)

Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in Loquat Leaf by HPLC

MENG Wen-jing1,YUAN Qing-yan1,WU Jin-mei2,WANG De-gang2*

( 1.linzhouSinagriYingtaiBiotechCo.ltd,Henan,linzhou456550,China;2.HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou450011,China)

To establish an HPLC method for the determination of oleanolic acid and ursolic acid in loquat leaf. HPLC was carried out on Agilent Ecilpse plus C18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm) at 30 ℃ using acetonitile-0.1%ammonium water (70∶30, phosphoric acid pH to 8.0) as mobile phase with a flow rate of 0.8 mL/min and the UV detection wavelength was set at 210 nm. Oleanolic acid and ursolic acid can reach the baseline separation, degree of separation(R) was more than 2.5. Oleanolic acid was linear in the range of 0.20～7.94 μg. Ursolic acid was linear in the range of 0.21～8.49 μg. The method is simple, convenient, accurate, and can be used for the quality control of loquat leaf．

loquat leaf; oleanolic acid; ursolic acid; HPLC

孟文靜，碩士，從事中獸藥新制劑方面研究。

2016-08-11

A

1002-1280 (2016) 10-0036-04

S853.72