王東亮，聶巧，李宇琛，吳天興，卜仕金*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州 225009；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

犬血漿中特比萘芬的高效液相色譜檢測方法

王東亮1,2，聶巧1,2，李宇琛1,2，吳天興1,2，卜仕金1,2*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州 225009；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

建立并優(yōu)化一種簡單、快速、靈敏、高選擇性的HPLC方法測定犬血漿中特比萘芬血藥濃度，并考察方法的穩(wěn)定性。特比萘芬血漿樣品經(jīng)提取劑乙腈-異丙醇(用磷酸調(diào)pH至3.0)(40:60，V/V)液-液萃取后，提取液經(jīng)40 ℃氮氣吹干，用流動相復溶后離心過濾，取上清液20 μL進樣分析，對血樣處理后及標準溶液保存不同時間后的穩(wěn)定性進行了考察。色譜柱Agilent 5 HC-C18(2)柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相甲醇-0.1%磷酸水(59:41，V/V)；流速0.8 mL/min；紫外檢測波長223 nm；柱溫35 ℃。色譜峰分離良好，無干擾。特比萘芬最低檢測濃度為0.01 μg/mL，線性范圍是0.02 ～ 5 μg/mL，相關(guān)回歸方程:y=356.28x-2.0311(r2=0.99989)。低、中、高血漿質(zhì)控樣品日內(nèi)RSD均小于5%，日間RSD均小于7%，方法平均回收率分別為108.9%，100.4%，102.1%。血樣處理后8 h內(nèi)樣品能保持較好穩(wěn)定性，血樣處理后3次循環(huán)凍融能保持較好穩(wěn)定性。血樣處理后于-20 ℃條件下凍存能夠保持穩(wěn)定2個月，標準溶液有效保存期同樣為2個月。本研究建立的特比萘芬血樣濃度測定方法有較高的準確度和靈敏度，適用于候選化合物的體內(nèi)藥代動力學研究。

特比萘芬；血藥濃度測定；穩(wěn)定性；高效液相色譜法

鹽酸特比萘芬是第二代丙烯胺類廣譜抗真菌藥，能夠高選擇性地抑制真菌細胞中的角鯊烯環(huán)氧化酶，抑制真菌細胞膜的形成，從而達到殺菌和抑菌的雙重作用，尤其能夠有效地對抗入侵角質(zhì)化組織(如趾甲、毛發(fā)、皮膚)的絲狀真菌[1]，已在人醫(yī)臨床廣泛應用，而在動物方面的研究較少。犬貓局部真菌感染的治療通常傾向于口服藥物，事實上，如果能夠保證藥物良好的滲透性與釋放性，在局部給藥能夠達到更好的治療效果[2]。在歐美，鹽酸特比萘芬已經(jīng)研制出了指甲油、乳膏劑、片劑等劑型，用以口服和局部使用[3]。目前國內(nèi)外對鹽酸特比萘芬在血漿中的檢測方法正向著高選擇性、高靈敏度及整體多功能性研究，高效液相色譜法由于可靠性和準確性受到了極大的關(guān)注[4]。本試驗參照相關(guān)文獻，建立了更穩(wěn)定靈敏的特比萘芬血藥濃度HPLC測定方法，并考察了該方法在各種條件下的穩(wěn)定性，旨在為系統(tǒng)開展犬體內(nèi)特比萘芬藥代動力學研究奠定必要的方法學基礎。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括Agilent G1311C四元泵帶脫氣機，G1330B柱溫箱，G1315D檢測器及手動進樣器，Agilent OpenLAB CDS化學工作站，Agilent公司；色譜柱Agilent 5 HC-C18(2)(250×4.6 mm，5 μm)，Agilent公司；UPH-11-20T型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，成都超純科技有限公司；N-EVAPTM112型干浴氮吹儀，美國Organomation公司；電子分析水平，感量0.0001 g，德國塞多利斯天平公司；PB-10型PH計，德國塞多利斯天平公司；KS-250D超聲儀，寧波科生儀器廠；WH-1微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；5810-R型高速冷凍離心機，德國eppendorf股份公司。

1.2 藥品與試劑 甲醇為色譜純，購自美國TEDIA公司，磷酸為色譜純，購自德國CNW公司，乙腈、異丙醇為色譜純，購自國藥集團化學試劑有限公司。鹽酸特比萘芬對照品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.8%，批號100563-201402。

1.3 動物 成年健康比格犬，體重12 kg，購自四方動物科技有限公司。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品的配制 精密稱取鹽酸特比萘芬對照品(0.0280±0.0001) g，用甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，配成500 μg/mL的特比萘芬儲備液，-20 ℃凍存。

2.1.2 提取劑的配制 將色譜純乙腈和異丙醇按40∶60(V/V)的比例混勻，用磷酸調(diào)pH至3.0，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent 5 HC-C18(2)(250×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸水(59∶41，V/V)；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量20 μL；紫外檢測波長：λ=223 nm。

2.3 血漿樣品處理 準確吸取室溫下凍融后的血漿樣品200 μL置于2 mL指形管中，加入1 mL提取液渦旋振蕩3 min后，離心20 min(4 ℃，12000 r/min)，將上清液移至5 mL指形管中。殘渣加1 mL提取液渦旋振蕩3 min，離心20 min(4 ℃，12000 r/min)，合并上清液。取上清液于40 ℃干浴氮氣吹干，用200 μL流動相復溶吹干殘渣，渦旋振蕩5 min。將復溶后的溶液移至2 mL指形管內(nèi)，離心20 min(4 ℃，12000 r/min)，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液供HPLC分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 標準曲線及線性范圍 分別配制特比萘芬質(zhì)量濃度為0.02，0.05，0.10，0.50，1.00，2.50，5.00 μg/mL的血漿樣品，按2.3項血漿樣品處理方法處理后，進行HPLC分析。采用外標法計算，以特比萘芬峰面積(As)對血藥濃度(C)進行線性回歸，

得回歸方程：As= 356.28C-2.0311(r2= 0.99989)。表明特比萘芬于本方法在0.02～5.00 μg/mL線性關(guān)系良好。血漿最低檢測濃度為0.01 μg/mL(S/N≥3)，定量限濃度為0.02 μg/mL(S/N≥10)。標準曲線如圖1所示。

圖1 特比萘芬標準曲線圖

3.2 精密度和準確度 分別平行配制低、中、高3個濃度，分別為0.02，1.00，5.00 μg/mL血漿質(zhì)控各5份，同日萃取測定，計算日內(nèi)RSD分別為4.699%，1.348%，2.892%；在5個不同日進行萃取測定，計算得日間RSD分別為6.598%，6.482%，3.564%，結(jié)果見表1所示。

表1 特比萘芬血漿濃度HPLC方法的精密度和準確度(n=5)

注：n：樣本數(shù);RSD：變異系數(shù)

3.3 回收率 分別平行配制低、中、高3個濃度，分別為0.02，1.00，5.00 μg/mL血漿質(zhì)控各5份，同日萃取測定，計算得方法平均相對回收率分別為108.866%，100.406%，102.120%，結(jié)果見表2所示。

表2 血漿中空白添加特比萘芬HPLC方法的相對回收率(%)(n=5)

注：RSD：變異系數(shù);a：基于檢出的平均濃度進行計算

3.4 穩(wěn)定性

3.4.1 室溫放置下的穩(wěn)定性 制備濃度為0.1，1.0，5.0 μg/mL的5個空白血漿添加平行樣品，立刻對樣品進行分析，得到第0時數(shù)據(jù)，之后在室溫(約22 ℃)下分別放置2、6、8 h后進行樣品分析。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較，考察室溫下放置時血樣中特比萘芬的穩(wěn)定性。計算得8 h 的RSD分別為3.471%，3.729%，3.967%，結(jié)果見表3所示。表明在本試驗建立的處理方法下，樣品中特比萘芬在室溫條件下(+22 ℃)能夠保持穩(wěn)定達8 h。

表3 室溫放置8 h后犬血漿中特比萘芬測定的穩(wěn)定性

儲存時間(溫度)加標濃度/(μg·mL-1)檢出的平均濃度/(μg·mL-1)RSD/%樣本數(shù)n檢出加標濃度回收率/%a0h0．10．1043．5805104．11．00．9892．201598．95．05．2823．9735105．62h(室溫，+22℃)0．10．1011．6035100．81．00．9975．073599．75．05．2454．0985104．96h(室溫，+22℃)0．10．1032．8855103．01．00．9992．483599．95．05．2002．8795104．08h(室溫，+22℃)0．10．1053．4715104．81．00．9793．729597．95．05．1183．9675102．4

注：RSD為變異系數(shù); a: 基于檢出的平均濃度進行計算

3.4.2 凍融穩(wěn)定性考察 制備濃度為0.1，1.0，5.0 μg/mL的5個空白血漿添加平行樣品，立刻對樣品進行分析，得到第0時數(shù)據(jù)。在-20 ℃下至少儲存1 d后取出解凍，之后再次冷凍、解凍，反復共進行3次凍融循環(huán)處理。兩次凍融間隔時間至少為5 h。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較考察反復凍融下血樣中特比萘芬的穩(wěn)定性。計算得最終濃度RSD分別為4.999%，2.215%，0.561%，結(jié)果見表4所示。表明特比萘芬樣品在三個凍融循環(huán)后，仍然保持穩(wěn)定。

表4 三個凍融循環(huán)后犬血漿中特比萘芬測定的穩(wěn)定性

注：RSD：變異系數(shù);a：基于檢出的平均濃度進行計算

3.4.3 樣品存儲期間的穩(wěn)定性 制備濃度為0.1，1.0，5.0 μg/mL的5個空白血漿添加平行樣品，立刻對樣品進行分析，得到第0時數(shù)據(jù)。之后分別于凍存(約-20 ℃)1周和2個月后進行樣品分析。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較考察樣品貯存期間的穩(wěn)定性。計算得2個月濃度RSD分別為9.697%，1.360%，3.601%，結(jié)果見表5所示。表明特比萘芬樣品在-20 ℃條件下凍存，可保持穩(wěn)定達2個月。

3.4.4 儲備液的穩(wěn)定性 制備2 mL濃度為0.1，1.0，5.0 μg/mL的標準液，立刻對樣品進行分析，每個濃度重復5次，得到第0時數(shù)據(jù)。之后分別于凍存(約-20 ℃)1個月和2個月后進行樣品分析。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較考察儲備液貯存期間的穩(wěn)定性。2個月濃度RSD分別為1.514%，3.097%，1.809%，結(jié)果見表6所示。表明特比萘芬儲備液稀釋后的標準溶液，在-20 ℃條件下凍存可保持2個月穩(wěn)定。

表5 -20 ℃條件下凍存后血漿中特比萘芬測定的穩(wěn)定性

注：RSD：變異系數(shù);a：基于檢出的平均濃度進行計算

表6 -20 ℃條件下凍存后儲備液中特比萘芬測定的穩(wěn)定性

注：RSD：變異系數(shù);a：基于檢出的平均濃度進行計算

3.5 分離效果 由特比萘芬對照品、空白添加樣品、空白血漿色譜峰的分離圖譜可知，特比萘芬的色譜峰分離效果良好，空白血清及其他雜質(zhì)對其無影響，保留時間為14.1 min左右(圖2 ～ 圖6)。

圖2 特比萘芬(0.02 μg/mL)對照品色譜圖

圖3 空白血漿添加特比萘芬標準品(0.02 μg/mL)對照品色譜圖

圖4 特比萘芬(1 μg/mL)對照品色譜圖

圖5 空白血漿添加特比萘芬標準品(1 μg/mL)對照品色譜圖

圖6 空白血漿色譜圖

圖7 特比萘芬紫外全波長掃描圖

4 討論與小結(jié)

本試驗對特比萘芬血藥濃度測定方法進行了大量的研究。在色譜條件方面，用安捷倫1260進行DAD全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在223 nm紫外檢測波長處有最大吸收，其他波段吸收皆較低(圖7)。通過參考文獻發(fā)現(xiàn)特比萘芬在較強的無機酸性環(huán)境下溶解性及穩(wěn)定性較好[5]，經(jīng)多次嘗試，最終流動相選用甲醇-0.1%磷酸水；而用乙腈-0.1%磷酸水，則無法經(jīng)該色譜設備檢測到。由于紫外檢測波長較低，雜質(zhì)峰較多，多次調(diào)試發(fā)現(xiàn)當流動相比例為甲醇-0.1%磷酸(59∶41，V/V)時，出峰時間為14.1 min，能夠在圖譜上呈現(xiàn)較好的峰形，并能與其他雜質(zhì)峰分離開。當柱溫為室溫或者30 ℃時，發(fā)現(xiàn)藥物峰有前沿峰，經(jīng)試驗調(diào)試，當柱溫升為35 ℃時，前沿峰消失?？紤]緩沖劑因素時[6-8]，試驗中發(fā)現(xiàn)加入磷酸二氫鉀或乙酸銨等緩沖液時，均會造成增加較多雜質(zhì)峰，故流動相未添加緩沖液。

在提取方法中，試驗先后用1 mL純正己烷、甲醇、乙腈、異丙醇三種方法進行兩次重復萃取藥物，發(fā)現(xiàn)正己烷組回收率不足10%，甲醇組回收率不足15%，乙腈組為25%左右，異丙醇組為58%～65%，乙腈組和異丙醇組增大劑量均未見回收率明顯提高，正己烷組劑量增大至4 mL時，重復提取兩次回收率在20%左右。有大量研究在對血樣進行處理時主要使用正己烷[9-11]，本試驗發(fā)現(xiàn)藥物在正己烷中的回收率低于甲醇，低于乙腈，低于異丙醇，并且與其他提取劑混合后沒有明顯更高效果，故提取劑中未添加正己烷。參考文獻[12-13]，試驗設計了用磷酸將提取劑酸化和萃取后加入磷酸酸化萃取液兩種方案，試驗發(fā)現(xiàn)兩種方案三組回收率均達85%以上，分析特比萘芬在酸性條件下能夠被HPLC穩(wěn)定測出，但是酸性條件并不能提高萃取率?？紤]到檢測的便捷性，最終選用酸化提取劑方法對樣品進行藥物提取。有些報道[14]通過加入大量鹽酸進行酸化，考慮到鹽酸量過多不易被氮氣吹干，會增加檢測周期，故未選用。為進一步提高藥物回收率及檢測的精確度，試驗嘗試酸化混合提取劑進行藥物提取，最終選用提取劑乙腈-異丙醇(40∶60，V/V)(用磷酸調(diào)pH至3.0)的提取劑，能夠極大的提高藥物的回收率。

在穩(wěn)定性研究方面，特比萘芬血樣處理前于-20 ℃冰箱避光保存2個月能保持相對穩(wěn)定，經(jīng)處理后室溫下血樣在8 h內(nèi)保持相對穩(wěn)定。血樣經(jīng)反復凍融后，特比萘芬也能保持相對穩(wěn)定性；標準溶液在-20 ℃冰箱避光保存2個月無明顯變化。

在本試驗所建立的HPLC條件下，待測藥物特比萘芬峰形良好，出峰時間為14.1 min左右，在223 nm處有最大紫外吸收峰，并且能夠準確定量?？瞻籽獫{添加不同濃度的特比萘芬在0.02～5.00 μg/mL范圍內(nèi)回收率在95%～110%之間，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別小于5%和7%，方法的檢測限和定量限分別為0.01 μg/mL和0.02 μg/mL。特比萘芬在0.02～5.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)，藥物濃度與檢測器響應值之間相關(guān)性良好(r2= 0.99989)。本試驗所建立的反相高效液相色譜-紫外檢測法，分析成本低，操作便捷，方法的靈敏度、準確性和重現(xiàn)性均能滿足特比萘芬血藥濃度檢測的需求，能夠為進一步的特比萘芬藥動學研究和生物利用度研究提供依據(jù)。

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(編輯：侯向輝)

Development of HPLC Method for the Determination of Terbinafine in Dog Plasma

WANG Dong-liang1,2,NIE Qiao1,2,LI Yu-chen1,2,WU Tian-xing1,2,BU Shi-jin1,2*

(1.VeterinaryMedicineCollege,YangzhouUniversity,Yangzhou，Jiangsu225009，China; 2.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,Yangzhou，Jiangsu225009,China)

To establish and improve a simple, rapid,sensitive and high selective high-performance liquid chromatographic (HPLC) method for the determination of terbinafine in canine plasma, and study the stability of terbinafine in different condition, The plasma sample containing terbinafine was extracted by the extracting of acetonitrile/isopropanol (phosphoric acid adjusting to pH 3.0, 40:60，V/V), and dried by nitrogen at 40 ℃, then dissolved in mobile phase and centrifuged, and 20 μL of the upper phase was injected into the sampler. The stability of the samples in different condition was studied. Separation was performed on a reversed-phase Agilent 5 HC-C18(2) column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). The isocratic mobile phase was methyl alcohol and 0.1% phosphoric acid with the rate of (59:41，V/V), and the run rate was 1 mL·min-1. The detective UV wavelength was 223 nm and the column temperature was 35 ℃. The chromatography condition good and not interfered by the components of the plasma. The limit of quantity was 0.01 μg·mL-1. The HPLC method had a linearity over the range of 0.02 ～ 5 μg·mL-1. The linear equation was y=356.28x-2.0311(r2=0.99989). The intra-assay precision did not exceed 5% and inter-assay precision did not exceed 7% for low, medium, high quality samples, respectively. The average recovery of the described method was 108.9%, 100.4% and 102.1%, respectively. The samples in 8 h or 3 times of freezing and thawing cycles after processing can maintain good stability. The samples after processing and the standard solution of terbinafine were stabilized for 2 months. A sensitive and accurate method for determining terbinafine has been established, which may be used in futureinvivopharmacokinetic studies of this antifungal drug.

terbinafine; determination of plasma concentration; stability：HPLC

江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程(PAPD)

王東亮，碩士，從事獸醫(yī)藥理及毒理學研究。

卜仕金。E-mail:pushijin@aliyun.com

2016-04-24

A

1002-1280 (2016) 07-0034-07

S859.83