候鳳，李新蘋，王鋼，李盛東，袁科，王鵬江，李新平，李延濤，賀筍

(新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，烏魯木齊 830011)

3種支原體培養(yǎng)基對豬肺炎支原體CJ株培養(yǎng)效果的比較分析

候鳳，李新蘋，王鋼，李盛東，袁科，王鵬江，李新平，李延濤，賀筍*

(新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，烏魯木齊 830011)

通過豬肺炎支原體CJ株接種3種豬肺炎支原體培養(yǎng)基后的生長活性研究發(fā)現(xiàn)，與其他2種培養(yǎng)基相比，接種改良Friis培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d含菌量可達(dá)到1.0×109～10CCU/mL，具有生長迅速、含菌量高的特點(diǎn)，可用于豬肺炎支原體CJ株的培養(yǎng)。

豬肺炎支原體；培養(yǎng)基；生長時(shí)間；含菌量

豬支原體肺炎又稱豬地方性流行肺炎，我國俗稱豬氣喘病[1]，是由豬肺炎支原體引起的一種慢性、接觸性、呼吸道傳染病[2],可造成帶菌病豬生長發(fā)育緩慢、生長率降低、飼料轉(zhuǎn)化率降低以及飼料和人力的浪費(fèi)。此外，豬肺炎支原體能夠引起機(jī)體免疫抑制，致使其他疫苗免疫失敗[3-4]。

目前，我國豬肺炎支原體的分離培養(yǎng)難度很大，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式耗時(shí)長，并且滴度不高，是目前支原體疫苗規(guī)模化生產(chǎn)的技術(shù)瓶頸?，F(xiàn)有的培養(yǎng)豬肺炎支原體的培養(yǎng)基主要有1975年報(bào)道的Friis培養(yǎng)基[5]、1975年江蘇農(nóng)科院發(fā)明的KM2培養(yǎng)基[6]、《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(二〇〇〇年版)[7]中提出的豬肺炎支原體培養(yǎng)基和2006年農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中提到的A26培養(yǎng)基。以上述傳統(tǒng)培養(yǎng)基及培養(yǎng)工藝培養(yǎng)自行分離的豬肺炎支原體CJ株的共同缺點(diǎn)是生長速度較慢且含菌量較低(在1.0×107～8CCU/mL之間)，從而影響疫苗的免疫效力。針對以上問題，本試驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)豬肺炎支原體培養(yǎng)基配方的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 豬肺炎支原體CJ株，由新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司分離鑒定、保管和供應(yīng)。

1.1.2 改良Friis培養(yǎng)基商品化成分 豬血清，購自GIBCO公司；PPLO肉湯粉、BHI均購自BD公司；干酵母粉購自安琪公司；氯化鈣、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鈉、酚紅、青霉素均購自Sigma公司。

1.1.3 設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱，購自上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 3種培養(yǎng)基的配制 改良Friis培養(yǎng)基的配制方法為稱取PPLO肉湯粉4.0 g以及腦心浸液粉3.0 g，加入700 mL純水中，待其溶解后加入30 mL10×漢克氏平衡鹽溶液及200 U/mL青霉素，待其溶解后再加入30 mL酵母浸出液以及10 mL 0.25%酚紅，最后與經(jīng)滅補(bǔ)體處理過的200 mL豬血清混合，并調(diào)整pH值至7.6，并用0.2 μm濾膜無菌過濾并分裝。其中，酵母浸出液需提前制備，取干酵母粉100 g，加去離子水1000 mL，混勻后，在36～38 ℃下發(fā)酵60 min后煮沸10 min，冷卻后，再以8000 r/min離心20 min，收取上清液，過濾除菌后置2～8 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》附錄[7]配制豬肺炎支原體培養(yǎng)基；參照ATCC方法配制ATCC 1699豬肺炎支原體培養(yǎng)基。隨機(jī)挑選1～2瓶培養(yǎng)基按現(xiàn)行《中國獸藥典》方法[8]進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。

1.2.2 種子液培養(yǎng) 將豬肺炎支原體CJ株菌種按1∶10分別繼代于以上3種培養(yǎng)基中，置于36～38 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌液pH值降低至6.7～6.8時(shí)收集菌液，進(jìn)行含菌量的測定。

1.2.3 含菌量測定 取菌種依次10倍系列稀釋，稀釋度達(dá)到10-1、10-2、10-3……10-12。再設(shè)改良Friis培養(yǎng)基作對照，置36～38℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d。每日觀察記錄培養(yǎng)物顏色變化和混濁度的變化，直至培養(yǎng)物pH值不再發(fā)生變化。最后發(fā)生顏色變化的稀釋度即為該培養(yǎng)物的CCU(color changing units)滴度。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)試驗(yàn) 將豬肺炎支原體CJ株分別接種3種培養(yǎng)基，在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其生長時(shí)間及含菌量的測定結(jié)果見表1。

表1 豬肺炎支原體CJ株接種3種培養(yǎng)基的生長時(shí)間及含菌量測定結(jié)果

由表1中3種培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體CJ株生長時(shí)間的結(jié)果可知，豬肺炎支原體CJ株在改良Friis培養(yǎng)基中生長較快，為2～3 d；豬肺炎支原體培養(yǎng)基需4～5 d，ATCC 1699培養(yǎng)基需6～7 d。由此說明，改良Friis培養(yǎng)基更適宜豬肺炎支原體CJ株的生長，并具有生長迅速的特點(diǎn)。

從3種培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體CJ株含菌量的結(jié)果可知，改良Friis培養(yǎng)基、豬肺炎支原體培養(yǎng)基和ATCC 1699培養(yǎng)基測定的含菌量逐漸降低，分別為1.0×109～10、1.0×107～8、1.0×107CCU/mL。由此說明，改良Friis培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體CJ株具有含菌量高的特點(diǎn)。

2.2 數(shù)據(jù)分析 將3種培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體CJ株含菌量的結(jié)果進(jìn)行對數(shù)化處理，并運(yùn)用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。表2結(jié)果顯示，改良Friis培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體CJ株的含菌量與另2種培養(yǎng)基的差異均極顯著(P<0.01)，而另2種培養(yǎng)基之間無顯著差異(P>0.05)。

表2 豬肺炎支原體CJ株接種3種培養(yǎng)基的含菌量測定結(jié)果比較

組間上標(biāo)字母不同時(shí)表示差異極顯著,P<0.01；上標(biāo)字母相同時(shí)表示差異不顯著，P>0.05

3 討論

由于支原體很小而產(chǎn)量又少，所以常用的定量估計(jì)菌體的方法(如濁度、細(xì)胞容積和干重)不適用于豬肺炎支原體的定量檢測。適合一般應(yīng)用的定量測定支原體的主要方法有：濃縮培養(yǎng)物的濁度測定、用菌落計(jì)數(shù)測量活菌數(shù)和用測定變色單位測量活菌數(shù)[9]。其中，采用高速離心濃縮菌液測定OD420的濁度方法需要至少15～30 mL菌液進(jìn)行離心濃縮，不適用于微量定量應(yīng)用，而且為了減少培養(yǎng)物pH對測定結(jié)果的影響，菌液需要洗滌數(shù)次，使菌液的收獲率大大降低。菌落形成單位(colony form unit,CFU)的測定需要至少兩周時(shí)間，且菌落在瓊脂培養(yǎng)基上生長時(shí)暴露時(shí)間長，易污染；由于支原體菌落小，難辨別，計(jì)數(shù)難保證精確性，測定其含量較為困難[10-11]。因此，CCU計(jì)數(shù)法比較直觀，其測定的是培養(yǎng)物中的活菌數(shù)，結(jié)果更具有代表性，仍是測定支原體含量的經(jīng)典方法，也是獸用生物制品目前仍采用的方法，廣泛運(yùn)用于支原體的培養(yǎng)檢驗(yàn)、活疫苗的保存條件檢測等，在檢測疫苗活菌數(shù)的應(yīng)用中具有不可替代的作用[12-13]。

豬肺炎支原體可以在無細(xì)胞培養(yǎng)基中生長，但條件要求較為苛刻，需要以多種必須的營養(yǎng)物質(zhì)作為營養(yǎng)來源，比如：含有甾醇和脂質(zhì)類且能夠補(bǔ)充氨基酸的動(dòng)物血清，含有多種維生素及碳水化合物的酵母浸出液，具有維持培養(yǎng)基滲透壓和pH值的無機(jī)鹽類，抑制雜菌生長的抗生素等等[14]。培養(yǎng)基的質(zhì)量直接影響豬肺炎支原體的生長發(fā)育，從而影響疫苗的免疫效力。本文中的培養(yǎng)基改良于1975年報(bào)道的Friis培養(yǎng)基[5]：動(dòng)物血清使用的是血清蛋白含量很高的豬血清，生長滴度高且來源方便；酵母浸出液是使用面包酵母新鮮發(fā)酵而成，能有效促進(jìn)豬肺炎支原體的生長發(fā)育；并且添加了PPLO肉湯粉，更有利于豬肺炎支原體的生長繁殖；并且培養(yǎng)基配制工序簡單方便，可操作性強(qiáng)。

用自制的改良Friis培養(yǎng)基培養(yǎng)自行分離的豬肺炎支原體CJ株，2～3 d含菌量可達(dá)到1.0×109～10CCU/mL，由此說明，改良Friis培養(yǎng)基具有生長迅速、含菌量高的特點(diǎn)，可用于豬肺炎支原體CJ株的培養(yǎng)。

[1] 李彥明,張映.豬肺炎支原體及其生物學(xué)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2003,24(3):25-27.

[2] 王華,張清,王君瑋,等.豬支原體肺炎流行病學(xué)和診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(9):73-77.

[3] Dee S,Otake S,Oliveira S,etal.Evidence of long distance air-borne transport of porcine reproductive and respiratory syndrome virus andMycoplasmahyopneumoniae[J].Vet Res,2009,40(4):39.

[4] 王茂文.豬肺炎支原體病的特點(diǎn)及其防制措施[J].畜禽業(yè),2008(2):16-17.

[5] Friis N F.Some recommendations concerning primary isolation ofMycoplasmasuipneumoniaeandMycoplasmafloccularea survey[J].Nord Vet Med,1975,27(6):337-339.

[6] 還紅華,邵國青,倪艷秀, 等.豬肺炎支原體培養(yǎng)技術(shù)研究[J].中國人畜共患病雜志,2001,17(3):70-71.

[7] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程[M]. 化學(xué)工業(yè)出版社, 2000.

[8] 中國獸醫(yī)藥典委員會(huì). 中華人民共和國獸藥典(三部)[M]. 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2010.

[9] 畢丁仁,王桂枝.動(dòng)物霉形體及研究方法[M]. 中國農(nóng)業(yè)出版社,1998.

[10]Stemke G W, Robertson J A. Comparison of two methods for enumeration ofMycoplasmas[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1982, 16(5): 959-961.

[11]陳天壽.微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M].中國農(nóng)業(yè)出版社, 1995, 6:470-491.

[12] 杜德燕，張洪，姜來生, 等.不同容積的培養(yǎng)瓶對豬肺炎支原體培養(yǎng)滴度的影響[J].四川畜牧獸醫(yī), 2003, 6:29-31.[13]韋艷娜，熊祺琰，劉茂軍, 等.不同因素對豬肺炎支原體顏色變化單位測定的影響[J].中國獸藥雜志, 2012,46(8):8-10.

[14]李彥明，張映.豬肺炎霉形體培養(yǎng)技術(shù)簡介[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊， 2003(2)： 16-17.

(編輯：李文平)

Cultural Effects of Three Kinds of Mycoplasma Culture Media on Mycoplasma hyopneumoniae Strain CJ

HOU Feng，LI Xin-ping，WANG Gang, LI Sheng-dong, YUAN Ke, WANG Peng-jiang, LI Xin-ping, LI Yan-tao，HE Sun*

(XinjiangTeconLivestockBiotechnologyCo.,Ltd.，Urumqi830011,China)

In this article,Mycoplasmahyopneumoniaestrain CJ was inoculated with three kinds of culture media respectively, and the growth active was studied. Compared with the other two kinds of culture media, the bacterial content with the modified Friis medium could reach 1.0×109～10CCU/mL after culturing 2～3 days, with characteristics of rapid growth and high bacterial, which could be used for the culture ofM.hyopneumoniaestrain CJ.

Mycoplasmahyopneumoniae;medium; growth time; bacterial content

候鳳，碩士，技術(shù)員，從事動(dòng)物疫苗研發(fā)工作。

賀筍。E-mail: hesun318@163.com

2015-12-03

A

1002-1280 (2016) 03-0021-03

S852.62