朱良全, 孫曄，，劉延亭，蔣卉，彭小薇，陳祥，丁家波*

(1．中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2．北京中海生物科技有限公司，北京 100081；3．江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009)

仔豬副傷寒活疫苗合成培養(yǎng)基發(fā)酵工藝應(yīng)用研究

朱良全1, 孫曄1，2，劉延亭2，蔣卉1，彭小薇1，陳祥3*，丁家波1*

(1．中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2．北京中海生物科技有限公司，北京 100081；3．江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009)

為確定仔豬副傷寒活疫苗合成培養(yǎng)基發(fā)酵參數(shù)，根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵技術(shù)，設(shè)計(jì)3種不同工藝，分別發(fā)酵培養(yǎng)21 h，每隔3 h取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)表明，培養(yǎng)15～21 h均可達(dá)細(xì)菌穩(wěn)定期，工藝3培養(yǎng)菌數(shù)高于其余2種，其最適培養(yǎng)時(shí)間為18 h；將合成培養(yǎng)基以1%、2%和3%的接菌量按工藝3分別發(fā)酵18 h，發(fā)現(xiàn)3者培養(yǎng)菌數(shù)基本一致。進(jìn)一步比較4批合成培養(yǎng)基和普通肉湯發(fā)酵18 h的培養(yǎng)效果，期間15、18 h抽樣的合成培養(yǎng)基培養(yǎng)菌數(shù)分別比普通肉湯高12%和25%；發(fā)酵18 h的菌液對(duì)小鼠安全性及對(duì)兔的免疫原性，兩者基本一致，接種小鼠均10/10健活，免疫攻毒兔均達(dá)4/5～5/5保護(hù)，對(duì)照攻毒兔5/5死亡。結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)工藝3可行，可實(shí)現(xiàn)仔豬副傷寒活疫苗合成培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)，且發(fā)酵菌體安全性及免疫原性良好。

合成培養(yǎng)基；發(fā)酵工藝；培養(yǎng)菌數(shù)；安全性；免疫原性

仔豬副傷寒(Paratyphus swine)又稱豬沙門氏菌病(Swine salmonellosis)，是由豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)引起的一種仔豬高熱傳染病，目前主要通過(guò)接種疫苗進(jìn)行預(yù)防[1-3]。我國(guó)的仔豬副傷寒活疫苗毒力穩(wěn)定、安全，在豬沙門氏菌病防控中發(fā)揮了重要作用[4]。但其制苗用菌液生產(chǎn)一直采用普通肉湯，該培養(yǎng)基主要成分牛肉湯受動(dòng)物的種類、年齡、及肉源的新鮮與消化程度影響大，造成疫苗批次間的質(zhì)量不穩(wěn)定，很難建立標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)酵工藝參數(shù)[5-6]。合成培養(yǎng)基替代天然培養(yǎng)基是發(fā)展的必然趨勢(shì)，由于其成分相對(duì)確定、質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便，易于在線檢測(cè)、監(jiān)控和及時(shí)調(diào)整，故成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[6]。合成培養(yǎng)基的配套發(fā)酵工藝是實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度發(fā)酵培養(yǎng)的關(guān)鍵。由于具有較高的技術(shù)含量，一般為商業(yè)秘密或?qū)＠a(chǎn)品，相關(guān)正式報(bào)道較少。本課題組在成功研制出仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)用合成培養(yǎng)基的前期基礎(chǔ)上，對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，以期為指導(dǎo)該合成培養(yǎng)基科學(xué)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而進(jìn)一步為其他細(xì)菌類疫苗合成培養(yǎng)基及配套發(fā)酵工藝的研究提供借鑒。

1 材料

1.1 菌種 生產(chǎn)用菌種為豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)(2006.8.29凍干，0.3 mL/支)；檢驗(yàn)用菌種為豬霍亂沙門氏菌(CVCC79102株)(2006.8.29凍干，0.3 mL/支)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 仔豬副傷寒活疫苗合成培養(yǎng)基(批號(hào)為200801、200802、200803)，由北京中海生物科技有限公司配制及提供。其主要成分：胰酪蛋白胨(批號(hào)VM732731-644)， 購(gòu)自MERCK公司；酵母浸粉(批號(hào)911948)購(gòu)自O(shè)XOID公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、碳酸鈉、葡萄糖等均為分析純化學(xué)試劑，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

普通肉湯( 批號(hào)為200811、200812、200813、200814)由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司配制及提供。

1.3 30 L發(fā)酵罐 BIOF-2000型，上海高機(jī)生物工程有限公司。

1.4 動(dòng)物 小鼠：ICR系，30～35日齡、體重18～22 g，清潔級(jí)；大耳白兔：體重1.5～2.0 kg，普通級(jí)。由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組采購(gòu)并提供。

2 方法

2.1 種子液制備 按《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程(2000版)》(以下簡(jiǎn)稱《規(guī)程》[5])進(jìn)行。

2.2 不同發(fā)酵工藝比較試驗(yàn) 將合成培養(yǎng)基按說(shuō)明書(shū)用注射用水溶解成20000 mL后，輸入30 L發(fā)酵罐中，116 ℃在線滅菌30 min。待其恢復(fù)室溫后，按2%加入種子液，按表1設(shè)計(jì)的3種不同發(fā)酵工藝各發(fā)酵培養(yǎng)21 h，其培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21 h分別取樣，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》[7]方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

表1 發(fā)酵工藝及參數(shù)表

2.3 不同接菌量的比較試驗(yàn) 按2.2項(xiàng)方法將合成培養(yǎng)基無(wú)菌定量輸入30 L發(fā)酵罐后，分別按1%、2%和3%加入種子液，按表1中獲得最佳發(fā)酵工藝及參數(shù)，發(fā)酵培養(yǎng)18 h，其培養(yǎng)15、18 h分別取樣，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》[7]方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

2.4 同常規(guī)培養(yǎng)基比較試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù) 按2.2項(xiàng)的量及方法將合成培養(yǎng)基和普通肉湯輸入發(fā)酵罐后，按2%加入種子液，按表1中獲得最佳發(fā)酵工藝及參數(shù)培養(yǎng)18 h，其培養(yǎng)15、18 h分別取樣，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》[7]方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。合成培養(yǎng)基和普通肉湯各培養(yǎng)4批。

2.4.2 培養(yǎng)菌液的安全性試驗(yàn) 取每批合成培養(yǎng)基及普通肉湯培養(yǎng)18 h菌液各100 mL，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)后，用生理鹽水作適當(dāng)稀釋，按《規(guī)程》[5]用量，分別皮下注射體重18～22 g的小鼠10只，0.2 mL/只(含1×108CFU活菌)，觀察21 d，記錄健活情況。

2.4.3 培養(yǎng)菌液的免疫原性試驗(yàn) 取2.4.2項(xiàng)培養(yǎng)菌液，根據(jù)其活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，用生理鹽水作適當(dāng)稀釋，按《規(guī)程》[5]用量，分別肌肉注射體重1.5～2.0 kg的家兔5只，1.0 mL/只(含25×108CFU活菌)，30 d后，連同條件相同的不免疫對(duì)照家兔5只，各皮下注射經(jīng)肉肝胃(膜)消化湯培養(yǎng)2代的豬霍亂沙門氏菌(CVCC79102株)2.0 mL(含3MLD的活菌)，觀察30 d，記錄健活情況。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件包中的獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。*，P<0.05，代表顯著性差異，**,P<0.01 ，代表非常顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同發(fā)酵工藝參數(shù) 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 3種不同發(fā)酵工藝培養(yǎng)菌數(shù)曲線圖

從圖1可以看出，合成培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)15～21 h，3種不同發(fā)酵工藝可達(dá)到細(xì)菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期。工藝3發(fā)酵培養(yǎng)菌數(shù)高于其余2種，其最適發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為18 h。

3.2 不同接種量活菌計(jì)數(shù)結(jié)果 由3.1項(xiàng)結(jié)果得出工藝3實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵培養(yǎng)最好，進(jìn)一步按照工藝3進(jìn)行不同接菌量比較試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同接種量發(fā)酵培養(yǎng)菌數(shù)(單位：×108CFU/mL)

從表2看出，合成培養(yǎng)基采用1%～3%接菌量進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)15、18 h各自培養(yǎng)菌數(shù)基本一致。

3.3 與常規(guī)培養(yǎng)基發(fā)酵試驗(yàn)比較結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)表3，從表3結(jié)果及其統(tǒng)計(jì)分析看出，發(fā)酵培養(yǎng)15 h的4批合成培養(yǎng)基培養(yǎng)菌數(shù)平均值雖然高于普通肉湯12%，但差異不明顯；而發(fā)酵培養(yǎng)18 h，兩者差異明顯(*，P<0.05)。

表3 合成培養(yǎng)基與普通肉湯發(fā)酵罐培養(yǎng)比較結(jié)果(單位：×108CFU/mL)

3.4 培養(yǎng)18 h的菌液對(duì)小鼠的安全性 結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 培養(yǎng)菌體安全的安全性試驗(yàn)結(jié)果表

從表4可以看出，合成培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液對(duì)小鼠安全，與普通肉湯一致，均10/10健活。

3.5 培養(yǎng)18 h的菌體免疫原性 結(jié)果見(jiàn)表5。從表5結(jié)果可以看出，合成培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液免疫原性良好，其免疫攻毒效果與普通肉湯基本一致，免疫兔達(dá)4/5～5/5保護(hù)，對(duì)照5/5死亡。

表5 培養(yǎng)菌體免疫原性試驗(yàn)結(jié)果表

注：①皮下攻毒菌數(shù)54CFU(約含3MLD)，測(cè)毒時(shí)接種18CFU強(qiáng)毒菌液,接種兔分別在第9、11、12日各死1只；第14日死亡2只。②200802批合成培養(yǎng)基肌肉注射免疫攻毒4/5保護(hù)(攻毒后12日死亡1只)；200811批普通肉湯免疫攻毒4/5保護(hù)(攻毒后20日死亡1只)，200813批普通肉湯免疫攻毒3/5保護(hù)(攻毒后14、15日各死亡1只)，200814普通肉湯免疫攻毒4/5保護(hù)(攻毒后16日死亡1只)。

4 討論與小結(jié)

自獸用生物制品企業(yè)實(shí)行GMP以來(lái)，大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于成為獸用細(xì)菌類疫苗。發(fā)酵工藝本身是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，它涉及到發(fā)酵罐類型，如通氣攪拌式及氣升式發(fā)酵罐等，以及具體發(fā)酵參數(shù)，如溫度、溶氧、pH值等[8]。本試驗(yàn)中的通氣攪拌式發(fā)酵罐在獸用生物制品企業(yè)應(yīng)用較為普遍，其最大的特點(diǎn)通過(guò)攪拌槳和進(jìn)氣流量改變?nèi)苎趿亢蛽Q氣頻率。研制成功的合成培養(yǎng)基解決了批次間穩(wěn)定性問(wèn)題，而發(fā)酵工藝是實(shí)現(xiàn)合成培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)的重要途徑。綜合全文研究表明，研制的合成培養(yǎng)基采用工藝3，2%接種發(fā)酵培養(yǎng)18 h，適用于發(fā)酵培養(yǎng)豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)。

在發(fā)酵工藝研究中，根據(jù)需氧菌營(yíng)養(yǎng)代謝的特點(diǎn)設(shè)計(jì)了3種工藝參數(shù)，發(fā)現(xiàn)溶液pH值下降時(shí)采用不同類型堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)的效果差異比較大。如采用氫氧化鈉，因其為強(qiáng)堿，瞬時(shí)調(diào)整pH值能力很強(qiáng)，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值短期調(diào)整幅度大，反而不利于菌體的繁殖。而碳酸鈉為強(qiáng)堿弱酸鹽，短時(shí)間調(diào)整能力弱，但促進(jìn)菌數(shù)增殖能力不明顯。賴氨酸為堿性氨基酸，既可調(diào)節(jié)pH值，又被菌體代謝，促進(jìn)了菌體繁殖及穩(wěn)定。

雖然普通肉湯起始pH值可高達(dá)7.6，但此發(fā)酵工藝能否適應(yīng)普通肉湯，有待進(jìn)一步研究。因?yàn)榘l(fā)酵工藝與培養(yǎng)基有很大關(guān)系，普通肉湯中主要成分含有大量嘌呤堿，營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜[6]。曾有學(xué)者報(bào)道，合成培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液進(jìn)行后續(xù)凍干，其凍干菌存率低于普通肉湯[9-10]。這樣的結(jié)論有些偏頗，因?yàn)閮龈删媛手饕婕熬w狀態(tài)、凍干保護(hù)劑及凍干工藝，與培養(yǎng)基影響不大[11]。曾選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期或穩(wěn)定前期的合成培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液，采用耐熱保護(hù)劑進(jìn)行凍干，其凍干菌存率高達(dá)75%以上，且耐熱性能良好(數(shù)據(jù)未發(fā)表，待另文表述)，無(wú)論凍干菌存率還是耐老化性能均優(yōu)于文獻(xiàn)[9,11]報(bào)道的菌存率。

致謝：感謝哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司、山東綠都生物科技有限公司相關(guān)領(lǐng)導(dǎo)和同志們?cè)谠囼?yàn)中給予的大力支持和協(xié)助。

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(編輯：侯向輝)

Study on the Application on the Fermentation Process for Production of Paratyphoid Live Vaccine in Synthetic Medium

ZHU Liang-quan1， SUN Ye1,2， LIU Yan-ting2，JIANG Hui1，PENG Xiao-wei1， CHEN Xiang3*, DING Jia-bo1*

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China;2.BeijingZhonghaiBiotechCo.,Ltd,Beijing100081,China;3.JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis,YangzhouUniversity,Yangzhou，Jiangsu225009,China)

This study was carried out to identify the fermentation parameters for production of paratyphoid live vaccine in the synthetic medium. According to the key techniques of fermentation, three different fermentation processes were designed to produceSalmonellaentericaserovar Choleraesuis (S.choleraesuis) strain CVCC79500, and the samples were taken out for live bacteria counting every 3 h. The growth of strain CVCC79500 could reach its stationary phase after fermentation for 15～21 h. The obtained bacteria count was higher using the No.3 process than using the other two, and the optimal fermentation time was 18 h. The strain CVCC79500 was produced in synthetic medium via the No. 3 fermentation process for 18 h with different inoculation amount as 1%, 2% or 3%. The obtained bacteria count was similar with different inoculation amount at 15 h and 18 h. Further, we compared the production for the strain CVCC79500 for 18 h in either synthetic medium or common broth. The live bacteria count was measured at 15 h and 18 h as well. The average bacteria count was 12% and 25% higher in synthetic medium compared to in common broth at 15 h and 18 h, respectively. Finally, we investigated the safety and immunogenicity of the bacteria harvested at 18 h from both medium. Both culture were safe for immunized mice as the survival ratio (number of alive species / number of vaccinated species) of 100% (10/10). Also both culture showed the protective ratio (number of protected species / number of challenged species) of 80%～100% (4/5～5/5), with the mortality (number of died specied / number of challenged species) for non-vaccinated control of 5/5. Therefore, the No.3 fermentation process was workable and can achieve the high density cultivation of paratyphoid live vaccine in synthetic medium. The fermented bacteria were safe and had good immunogenicity.

synthetic medium；fermentation process；bacteria count；safety；immunogenicity

江蘇省人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(R1410)；北京市科技新星計(jì)劃項(xiàng)目(No. XX2013099)

朱良全，從事人畜共患病病原學(xué)、細(xì)菌類疫苗合成培養(yǎng)基及相關(guān)獸用生物制品研究。

陳祥。E-mail：chenxiang@yzu.edu.cn;丁家波。E-mail：dingjiabo@126.com

2015-12-19

A

1002-1280 (2016) 03-0016-05

S859.797