高銘彤，王佳奇，陳凱，李瑩，李婧毓，劉一桐，丁傳波，劉文叢，鄭毅男

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，長春 130118)

精氨酸雙糖苷對脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的影響

高銘彤，王佳奇，陳凱，李瑩，李婧毓，劉一桐，丁傳波，劉文叢*，鄭毅男*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，長春 130118)

為研究精氨酸雙糖苷(AFG)體外的抗炎機制，以脂多糖(LPS)刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)作為炎癥模型，用精氨酸雙糖苷(AFG)的低、中、高(5、10、20 mg/L)三個劑量進行干預(yù)后，MTT法測定細(xì)胞毒性作用，Griess法測定一氧化氮(NO)生成量，ELISA法檢測細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及前列腺素E2(PGE2)的分泌量。結(jié)果表明：AFG的三個不同劑量對RAW264.7細(xì)胞無抑制作用(P>0.05)，各濃度給藥組的NO、IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2含量與LPS刺激模型組相比較都顯著降低(P<0.01)，推想AFG的抗炎活性可能是通過抑制NO和PGE2等炎癥介質(zhì)釋放，降低IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的含量而發(fā)揮了作用。

精氨酸雙糖苷；小鼠RAW264.7細(xì)胞；抗炎活性；炎癥因子

精氨酸雙糖苷(Arginyl-Fructosyl-Glucose，AFG)是鮮人參在加工成紅參時，麥芽糖和精氨酸在加熱的過程中，發(fā)生梅拉德反應(yīng)形成的一種葡糖胺重排的中間產(chǎn)物[1]。鄭毅男等[2-3]首次發(fā)現(xiàn)并鑒定了其結(jié)構(gòu)為1′-(精氨酸-N2基)-1′-去氧-4′-O(α-D-吡喃葡萄糖基)-D-果糖[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，AFG的藥理活性強，具有抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、對微循環(huán)[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]等作用，但對抗菌抗炎的作用少有研究。NO、IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2等[9-10]，都是巨噬細(xì)胞經(jīng)過刺激后產(chǎn)生的炎癥因子，而這些炎癥因子的抑制作用通常作為衡量藥物抗炎活性的重要指標(biāo)[11]。因此，本實驗擬通過脂多糖(LPS)刺激小鼠RAW264.7單核巨噬細(xì)胞作為模型，觀察不同濃度的AFG在體外對炎性細(xì)胞因子NO，IL-1β，IL-6，TNF-α和PGE2合成和分泌的影響，從而研究精氨酸雙糖苷在體外的抗炎作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞株來源 小鼠的RAW264.7單核巨噬細(xì)胞，購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫

1.2 藥品及試劑 精氨酸雙糖苷AFG，實驗室自制，純度大于90%，臨用時用純凈水配置成高、中、低劑量所需濃度；一氧化氮(NO)測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、白細(xì)胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒和前列腺E2(PGE2)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，批號：201511，均購于美國R&D公司；小牛血清(FBS)，購于Hyclone公司；脂多糖(LPS)，購于Sigma公司；二甲基噻唑(MTT)，購于Amresco公司；二甲基亞砜(DMSO)，購于Sigma公司；地塞米松(DMX)，購于Sigma公司；青鏈雙抗，購于Gibco公司；蒸餾水，實驗室自制。

1.3 主要儀器 TGL-20B高速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；微量振蕩器，江蘇省金壇市宏華儀器廠；-70℃溫冰箱，Haier；CO2培養(yǎng)箱，F(xiàn)orma Scientific公司，美國；倒置顯微鏡，Olympus公司，日本；電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司，上海；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備廠；MK3酶標(biāo)儀，Thermo Electron公司，美國；電熱恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；移液槍，Thermo；48孔細(xì)胞板，COSTER；LC-20AT Shimadzus HPLC，檢測器SPD-20A，日本島津公司；FD-1D-50型真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

2 方法

2.1 AFG制備 取L-精氨酸1 g，麥芽糖2 g，檸檬酸0.75 g，溶于10 mL丙三醇中，搖勻，于80 ℃水浴條件下反應(yīng)120 min,得AFG總合成物，上樣于高效陽離子柱，1.5%氨水洗脫，部分接收器接樣，分批處理后，樣品通過HPLC測得純度，真空冷凍干燥機凍干為白色粉末。將粉末分別配置成5、10和20 mg/L三個濃度，備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 使用RPMI1640培養(yǎng)液50 mL培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7，在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)。2.3 給藥分組 空白對照組：不加藥物干預(yù)也不加脂多糖刺激；LPS模型組：不加藥物干預(yù)只加10 μg/L的LPS處理，建立炎癥模型；陽性對照組：加地塞米松DMX0.5 μg/L干預(yù)后2 h加10 μg/L的LPS刺激；給藥組：加入不同濃度(5、10、20 mg/L)的AFG進行干預(yù)后2 h加10 μg/L的LPS刺激。

2.4 檢測方法

2.4.1 對RAW264.7細(xì)胞存活率影響 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成1×105/mL單細(xì)胞懸液，以每孔100 μL點在48孔板內(nèi)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入不同濃度(5、10、20 mg/L)的AFG預(yù)處理2 h后，加入10 μg/L的LPS刺激細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在終止細(xì)胞培養(yǎng)前4 h，將上述各處理組的各孔細(xì)胞中加入20 μL，5 mg/L的MTT，37 ℃繼續(xù)孵育。終止細(xì)胞培養(yǎng)后，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩，直至細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶完全溶解，530 nm波長下用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值(OD值)。

2.4.2 對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的檢測將調(diào)整好的1×105/mL單細(xì)胞懸液，在48孔板中每孔均勻點100 μL，根據(jù)2.3所述的過程進行分組處理后，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取上清液，按照NO測定試劑盒(Griess法)說明書測定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量。

2.4.3 對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2的檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，使細(xì)胞懸液濃度為1×105/mL每孔100 μL均勻點于48孔板內(nèi)，與2.4.2操作相同，根據(jù)2.3所述的過程進行分組處理后，37 ℃，5% CO2繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后取上清液，按照ELISA試劑盒說明書上的方法分別檢測IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2的分泌量。

3 結(jié)果

3.1 對RAW264.7細(xì)胞存活率影響 MTT結(jié)果(圖1)顯示，AFG的三個濃度干預(yù)細(xì)胞24 h后，AFG的三個劑量均與空白對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明AFG對細(xì)胞的活性沒有顯著影響。

圖1 AFG三個濃度對RAW264.7細(xì)胞活性的影響

與空白組相比##P<0.01；與模型組相比**P<0.01圖2 AFG三個劑量對LPS誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞NO的生成情況

3.2 NO檢測 NO生成的影響結(jié)果見圖2，模型組與空白對照組相比NO的生成量顯著增加，差異

具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。不同劑量的AFG處理組與模型組比較，NO的生成量顯著減少，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，AFG低、中、高三個劑量與模型組相比，NO含量逐漸降低，其低、中、高三個劑量的抑制率分別為22.2%、30.3%和50.6%。3.3 IL-1β、IL-6的檢測 結(jié)果見表1。

表1 AFG三個劑量對LPS誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞IL-1β、IL-6的生成情況

與空白組相比##P<0.01；與模型組相比**P<0.01；與陽性組相比ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

結(jié)果顯示，模型組與空白對照組相比，IL-1β和IL-6都有顯著增加(P<0.01)，而經(jīng)AFG處理后的IL-1β和IL-6的分泌量與模型組相比都顯著降低(P<0.01)，其中，經(jīng)AFG的低劑量和中劑量處理后的IL-1β分泌量與陽性對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AFG的高劑量處理后的IL-1β分泌量與陽性對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。3.4 TNF-α、PGE2的檢測 TNF-α和PGE2的生成情況見表2。模型對照組與空白組比較，TNF-α和PGE2的生成均顯著增加(P<0.01)，AFG給藥組三個劑量與模型組比較，TNF-α和PGE2的生成均顯著性降低(P<0.01)。其中，在TNF-α的生成量中，AFG的低、中、高三個劑量成逐漸降低趨勢，AFG的20 mg/L劑量最有效。經(jīng)AFG的中劑量和高劑量處理后的PGE2分泌量比AFG低劑量組分泌量低，與陽性對照組無明顯差異(P>0.05)。

表2 AFG三個劑量對LPS誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞NF-α、PGE2的生成情況

與空白組相比##P<0.01；與模型組相比**P<0.01；與陽性組相比ΔΔP<0.01

4 討論

NO具有促進炎癥形成和抗炎的雙重特性，既抑制淋巴細(xì)胞增殖，又促發(fā)包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的許多免疫反應(yīng)及免疫病理過程[12]。有研究表明，過多的產(chǎn)生NO是有害的，會導(dǎo)致各種炎癥和自發(fā)免疫性疾病[13]。本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的含量檢測發(fā)現(xiàn)，LPS模型組的NO分泌量比空白組明顯升高，而AFG的三個劑量組的NO分泌量與LPS模型組比較均顯著降低，并且隨著藥物濃度的升高，分泌量水平呈逐步降低趨勢，呈劑量依賴性關(guān)系，因此我們可推想AFG 的抗炎作用應(yīng)該與其抑制NO的合成有關(guān)系。

IL-1β和IL-6都是由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種具有調(diào)節(jié)作用的促炎癥因子，可因TNF-α誘導(dǎo)后產(chǎn)生，也可由LPS刺激直接產(chǎn)生，是LPS誘導(dǎo)發(fā)熱的主要內(nèi)在介質(zhì)，是炎癥反應(yīng)的主要誘導(dǎo)者[14]。IL-6可通過自身分泌的形式作用在軟骨細(xì)胞，用來促進軟骨細(xì)胞的增殖[15]。通過LPS誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞分泌出大量炎癥因子，與空白對照組有明顯差異，則代表建造炎癥模型成功，對試驗中細(xì)胞上清液的IL-1β和IL-6含量檢測發(fā)現(xiàn)，AFG三個劑量組的分泌量與LPS模型組比較均有顯著降低，由此得出抑制IL-1β和IL-6的釋放水平，對于緩解炎癥效果、控制炎癥進程具有重要意義。

TNF-α主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，也可由LPS是誘導(dǎo)后，T細(xì)胞和NK細(xì)胞在某些刺激因子作用下分泌產(chǎn)生，是炎癥反應(yīng)進程中起到最為關(guān)鍵的作用，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞和腫瘤免疫等病理和生理過程中一種重要的細(xì)胞因子，生物學(xué)活性廣泛[16]。本研究中給藥組干預(yù)后的炎癥因子分泌量與模型組比較均有顯著降低，且分泌量隨給藥濃度逐漸變大而成遞減趨勢，呈劑量依賴性關(guān)系。結(jié)果表明AFG可以通過對抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放起到抗炎的作用。

PGE2是一種重要的細(xì)胞生長和調(diào)節(jié)因子，是花生四烯酸環(huán)氧合酶代謝產(chǎn)物，是前列腺素(PG)的一種，具有免疫抑制和抗炎作用[17]。本研究顯示：AFG三個劑量均明顯抑制了通過用LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7單核巨噬細(xì)胞后分泌的PGE2，且AFG10 mg/L處理組抑制最明顯。因此可推想AFG的抗炎作用大概與其抑制PGE2的合成相關(guān)。

人參是滋補身體的要藥，在醫(yī)療保健上常被人們稱為“長生不老藥”[18-19]。AFG屬于氨基酸衍生物一種，是人參中一種主要成分，人參中還包括人參皂苷、人參多糖、多肽和多糖等其他成分，近幾年人們對AFG 的研究逐漸增加，發(fā)現(xiàn)AFG有很強的藥理活性，既往研究發(fā)現(xiàn)：AFG有抗氧化、抗腫瘤和促進微循環(huán)等藥理活性；本研究結(jié)果表明：AFG還有抗炎癥因子的生物活性。

本研究通過LPS刺激小鼠RAW264.7單核巨噬細(xì)胞作為模型，體外檢測通過藥物AFG進行干預(yù)后的細(xì)胞毒性和炎癥因子的分泌情況，結(jié)果顯示，經(jīng)過AFG干預(yù)后的炎癥因子(NO、IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2)分泌量與模型組相比較有顯著降低(P<0.01)，且AFG的低、中、高三個劑量對細(xì)胞均無毒副作用，但AFG的體外抗炎機制還有待進一步研究。

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(編輯：李文平)

Effects of Arginyl-Fructosyl-Glucose on the Secretion of Inflammatory Cytokines in Macrophages Induced by Lipopolysaccharide

GAO Ming-tong, WANG Jia-qi, CHEN Kai, LI Ying, LI Jing-yu, LIU Yi-tong,DING Chuan-bo, LIU Wen-cong*, ZHENG Yi-nan*

(1.CollegeofChineseMedicinalMaterials，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China)

In this paper, we studied the anti-inflammatory mechanism of arginyl-fructosyl-glucose (AFG)invitro. The inflammation model, which was established based on the mouse monocyte-macrophage cells (RAW264.7) stimulated by lipopolysaccharide (LPS), is intervened by three doses of AFG, low, medium and high (5, 10, 20 mg/L). After intervention, MTT approach was used to access cytotoxicity; Griess approach is used to determine the amount of nitric oxide(NO); and ELISA was used to evaluate the secretion of interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and prostaglandin E2(PGE2) in cell supernatants. The results that: The three doses of AFG have no inhibition effect on RAW264.7 cells (P>0.05). In the control group, all contents of NO, IL-1β, IL-6, TNF-α and PGE2are significant less than placebo group (LPS model) (P<0.01). The mechanism of AFG in anti-inflammatory activity may be contributed by inhibiting the release of inflammatory mediators of NO and PGE2, reducing the amount of IL-1β, IL-6, TNF-α and other inflammatory factors.

arginyl-fructosyl-glucose(AFG); mouse RAW264.7 cells; anti-inflam- matory activity; inflammatory factors.

科技型中小企業(yè)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金項目(20160308002YY)

2016-08-31

A

1002-1280 (2016) 11-0065-05

Q53