王曉霞,郭貴寶,王正德,馬力通,閆 慧,海 波,劉云穎,白宇辰
(內(nèi)蒙古科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014010)
研究與開發(fā)
紫外光譜法研究噴昔洛韋與DNA的相互作用
王曉霞,郭貴寶,王正德,馬力通,閆 慧,海 波,劉云穎,白宇辰
(內(nèi)蒙古科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014010)
本文采用紫外光譜法研究了噴昔洛韋與DNA相互作用的光譜特性。結(jié)果表明,DNA的加入使噴昔洛韋的紫外光譜產(chǎn)生增色、藍(lán)移的現(xiàn)象;噴昔洛韋與DNA之間的作用主要是嵌插作用,它們之間的結(jié)合常數(shù)K=3.14×102L·mol-1。
噴昔洛韋;DNA;紫外吸收光譜
噴昔洛韋(Penciclovir,PCV),化學(xué)名為9-[4-羥基-3-(羥甲基)丁基]鳥嘌呤(圖1),是由英國(guó)史密斯克萊恩·比徹姆(Smithkline Beecham)公司研究開發(fā)的抗病毒藥,是抗病毒藥法昔洛韋(Famiciclovir,FCV)的活性代謝產(chǎn)物,屬于核苷酸類抗病毒藥物[1],于1996 年首次在英國(guó)上市[2]。噴昔洛韋屬于無環(huán)鳥嘌呤衍生物,其結(jié)構(gòu)和活性譜與無環(huán)鳥苷相似,但在作用機(jī)制方面有某些本質(zhì)的區(qū)別。由于噴昔洛韋的磷酸化率、穩(wěn)定性、磷酸鹽衍生物濃度及對(duì)病毒 DNA 多聚酶的親合力均較無環(huán)鳥苷高,故噴昔洛韋在安全性、療效和給藥方法等方面比無環(huán)鳥苷有優(yōu)勢(shì)。因?yàn)閲娢袈屙f對(duì)皰疹病毒有獨(dú)特療效,已成為治療唇皰疹的首選藥物,同時(shí)亦是治療生殖器皰疹的有效藥物。對(duì)外陰皰疹、帶狀皰疹、免疫缺陷患者的皰疹感染及乙肝病毒等正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)[3]。目前在我國(guó),噴昔洛韋原料藥已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,國(guó)內(nèi)有多家企業(yè)正在開發(fā)噴昔洛韋的新劑型,重點(diǎn)是開發(fā)眼用制劑(治療病毒性眼角膜炎)、注射劑(治療帶狀皰疹、乙型病毒性肝炎和丙型病毒性肝炎)等。
圖1 噴昔洛韋的結(jié)構(gòu)式
脫氧核糖核酸(DNA)是重要的生命物質(zhì)基礎(chǔ)與重要的遺傳物質(zhì),具有儲(chǔ)存和傳遞信息的功能,它控制著蛋白質(zhì)的合成, 也是許多藥物的靶向分子。藥物分子與DNA的相互作用會(huì)影響到DNA的生理和物理化學(xué)性質(zhì)[4],改變DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。目前普遍認(rèn)為藥物分子與DNA的非共價(jià)鍵力作用包括靜電結(jié)合、溝渠結(jié)合和嵌插作用3種方式(圖2)[5]:1)靜電結(jié)合,即帶正電荷的小分子與DNA鏈中磷酸骨架上的負(fù)電荷產(chǎn)生靜電作用而結(jié)合;2)溝槽作用。進(jìn)入DNA的大小溝中與DNA的某些基團(tuán)結(jié)合;3)嵌插作用。與DNA中的堿基等基團(tuán)相互作用[6]。
圖2 藥物分子與DNA相互作用的3種方式
研究小分子藥物與核酸的相互作用,對(duì)藥物的作用機(jī)理以及以核酸為靶標(biāo)的藥物分子的設(shè)計(jì)有一定的意義。在醫(yī)藥研究中,DNA與靶向分子相互作用的研究不僅可以闡述一些抗腫瘤、抗病毒藥物以及致癌物的作用機(jī)理,而且對(duì)進(jìn)一步指導(dǎo)新型藥物的設(shè)計(jì)合成研究都具有重要意義。本文采用紫外光譜法,對(duì)噴昔洛韋與DNA相互作用的光譜性能及作用方式進(jìn)行研究,以期為理解藥物對(duì)DNA的影響提供一定的理論依據(jù)。
1.1 主要儀器與試劑
Specord 50雙光束紫外分光光度計(jì),SHA-B恒溫振蕩器,PHS-25C pH檢測(cè)計(jì),TP-114型電子天平。
噴昔洛韋(PCV,C10H15N5O3),無水乙醇(分析純),鹽酸(分析純),鮭魚精DNA。
1.2 溶液制備
經(jīng)計(jì)算,稱取噴昔洛韋配制為1×10-4mol·L-1的噴昔洛韋乙醇溶液,配置0.21mg·mL-1的DNA工作液。利用PHS-25C pH檢測(cè)計(jì)配制出pH梯度為2.0~9.0的Tris-HCl溶液。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 不同濃度噴昔洛韋溶液與鮭魚精DNA工作液的相互作用
準(zhǔn)備10支10mL干凈的刻度管,分別在刻度管中加入1mL的 DNA工作液,然后再向每支刻度管中分別加入不同體積的噴昔洛韋溶液(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL),最后用二次蒸餾水定容、搖勻。將二次蒸餾水加入比色皿中作為參比,用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。不同濃度DNA與噴昔洛韋的相互作用方法同上。
1.3.2 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系影響
取1支10mL干凈的試管,分別加入1mL噴昔洛韋與1mL的DNA工作液,最后用二次蒸餾水定容,搖勻。將二次蒸餾水加入比色皿中作為參比,放置不同時(shí)間,用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量,測(cè)出不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響。
1.3.3 pH對(duì)體系的影響
取9支10mL干凈的刻度管,分別加入1mL噴昔洛韋與1mL的DNA工作液,分別加入pH梯度為2.0~9.0的Tris-HCl溶液,最后用二次蒸餾水定容、搖勻。將二次蒸餾水加入比色皿中作為參比,采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。
1.3.4 增大溫度對(duì)體系的影響
取2支10mL干凈的刻度管,分別加入1mL的DNA工作液,然后向每只刻度管中分別加入不同體積的噴昔洛韋溶液(0mL、1mL),最后用二次蒸餾水定容、搖勻。在不同溫度的恒溫水域中靜置0.5h,將二次蒸餾水作為參比,用紫外分光光度計(jì)分別進(jìn)行測(cè)量。
2.1 噴昔洛韋與DNA相互作用的紫外光譜
DNA的最大吸收峰在260nm處,由圖3與圖4可知,隨著噴昔洛韋濃度增加,DNA的紫外吸收光譜最大吸收波長(zhǎng)從260nm逐漸向左移至254nm。增色效應(yīng)和減色效應(yīng)是與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型密切相關(guān)的特有光譜性質(zhì)。增色效應(yīng)是指有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,而使其吸收帶的摩爾吸光系數(shù)增加的現(xiàn)象,減色效應(yīng)是指有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而使其吸收帶的摩爾吸收系數(shù)減小的現(xiàn)象[7-9]。發(fā)生增色效應(yīng)時(shí)噴昔洛韋與DNA中的堿基基團(tuán)配位,是DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)改變的結(jié)果。而減色效應(yīng)是噴昔洛韋與DNA中的磷酸基團(tuán)靜電作用,使DNA發(fā)生空間軸向收縮的結(jié)果。噴昔洛韋與DNA作用時(shí),結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生一定的競(jìng)爭(zhēng)作用,發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象。而噴昔洛韋在DNA堿基對(duì)之間存在插入作用[10],故顯示增色效應(yīng)。
圖3 濃度從0依次增加到0.0945mg·mL-1的DNA工作液與濃度為1×10-4mol·L-1的噴昔洛韋溶液的紫外吸收光譜
圖4 濃度從0依次增加到4.5×10-5mol·L-1的噴昔洛韋與0.21mg·mL-1的DNA工作液的紫外吸收光譜
DNA最大吸收值隨藥物與DNA濃度的比值呈線性關(guān)系,說明這兩種藥物與DNA結(jié)合是一配基一受點(diǎn)的結(jié)合方式,即藥物濃度愈大,DNA的吸附愈強(qiáng),這反映出DNA長(zhǎng)鏈大分子有較多的結(jié)合位點(diǎn),可以容納較多的藥物小分子。根據(jù)雙倒數(shù)公式[11-12]有:1/(A-A0)=1/A0+1/(K×A0×CDNA),式中A0、A分別表示加入DNA前后的藥物吸收值,K表示結(jié)合常數(shù)。代入實(shí)驗(yàn)結(jié)果,經(jīng)計(jì)算DNA與噴昔洛韋相互作用的結(jié)合常數(shù)K=3.14×102L·mol-1,表明這兩種藥物在DNA上存在著許多的結(jié)合位點(diǎn)。
圖5 噴昔洛韋濃度對(duì)DNA紫外吸收峰值的影響
圖6 不同濃度DNA與噴昔洛韋作用的雙倒數(shù)曲線
2.2 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系影響
DNA有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn), 即堿基和磷酸基團(tuán),噴昔洛韋在DNA堿基對(duì)中發(fā)生插入作用。研究溶液紫外吸收值隨時(shí)間變化的情況[13],由圖7數(shù)據(jù)可知,隨著混合時(shí)間的增大,噴昔洛韋與DNA在不同時(shí)間上的紫外吸收光譜的譜線峰值從0.1255上升到0.1729,總體上升了0.0474,即隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,噴昔洛韋與DNA相互作用的吸收峰值呈上升趨勢(shì)。由圖8可知,紫外光譜一直顯示增色效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明,當(dāng)反應(yīng)到達(dá)一定時(shí)間后,藥物與DNA的紫外吸收值趨于穩(wěn)定狀態(tài)。通過數(shù)據(jù)可知,當(dāng)反應(yīng)達(dá)到一定時(shí)間后(約16min左右),藥物與DNA的吸收值呈現(xiàn)出穩(wěn)定狀態(tài),這表明噴昔洛韋與DNA的結(jié)合是一個(gè)伴隨著擴(kuò)散過程的結(jié)合。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),藥物與DNA反應(yīng)的速率逐漸上升直至達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[14]。
圖7 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系的影響
圖 8 不同反應(yīng)時(shí)間的紫外吸收光譜
2.3 pH對(duì)體系的影響
圖9為噴昔洛韋與DNA體系在不同pH條件下的紫外吸收曲線。降低酸度可中和掉DNA磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷,有利于雙螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,但當(dāng)pH低于4.0或者大于11.0時(shí),酸堿可引起DNA堿基之間的氫鍵變性,致使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。
圖9 pH對(duì)體系的影響
由圖9可見,當(dāng)pH值處于2~4時(shí)體系紫外吸光度不斷變化;當(dāng)pH值處于6時(shí),紫外吸收值達(dá)到最大。如果考慮熱運(yùn)動(dòng)造成的誤差,可以認(rèn)為當(dāng)pH值在2~9內(nèi),特征峰波長(zhǎng)基本在255nm附近,這說明pH值取2~9時(shí),噴昔洛韋與DNA的相互作用相對(duì)穩(wěn)定。因此,在pH變化的情況下紫外光譜的吸收值比較大,且波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。詳細(xì)的作用機(jī)理比較復(fù)雜,還需要進(jìn)一步的研究。
2.4 溫度對(duì)噴昔洛韋與DNA相互作用的影響
溫度從25℃上升到45℃的過程中,吸光度由0.019上升到0.294,最后在溫度到達(dá)55℃時(shí)略微降低,趨于穩(wěn)定。而DNA溶液的特征波峰也隨溫度的升高發(fā)生了略微紅移。而噴昔洛韋與DNA混合液的紫外吸光度則不斷升高。加入藥物前后的DNA的紫外吸光度有很大的差別,溫度的影響直接導(dǎo)致系統(tǒng)內(nèi)能增加,促進(jìn)兩種物質(zhì)的相互作用,所以二者的紫外吸光度有很大變化,而溫度的影響又使得單獨(dú)DNA的特征波峰發(fā)生細(xì)微變化。
噴昔洛韋與DNA的作用方式和程度取決于時(shí)間、濃度、酸度和離子強(qiáng)度等因素。噴昔洛韋濃度增加,PCV-DNA紫外光譜呈現(xiàn)出越來越明顯的增色效應(yīng)。經(jīng)過初步的實(shí)驗(yàn)得出,噴昔洛韋通過插入至DNA的堿基而發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象。同時(shí),利用雙倒數(shù)法求得噴昔洛韋與鮭魚精DNA 結(jié)合的結(jié)合常數(shù)K=3.14×102L·mol-1,表明噴昔洛韋與DNA相互發(fā)生作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還進(jìn)一步表明,生物大分子與藥物小分子的相互作用受多方面因素的影響,其中藥物濃度的影響較為顯著,這意味著,在生物分子領(lǐng)域,物質(zhì)之間的相互作用還是以靜電力、范德華力等電磁相互作用為主。
[1] 鄧燕,何農(nóng)躍,張永強(qiáng),傅娟,張繼德.噴昔洛韋的合成工藝研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2009(9): 737-739.
[2] 鄒尚榮,洪鳴.抗病毒藥噴昔洛韋的合成工藝改進(jìn)[J].海峽藥學(xué) 2009(4):92-94.
[3] 陳梅玲,裴慧霞.噴昔洛韋合成工藝研究[J].中國(guó)藥業(yè),2006(7):33-34.
[4] 張愛梅,賈麗萍,黃蓬.光譜法研究頭孢曲松鈉與DNA的相互作用[J].聊城大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009(1):51-53.
[5] 劉煒,張瓊梅.巖白菜素與DNA相互作用的光譜研究[J].海南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011(2):177-179.
[6] 魏光成,付彩霞,閆苗苗.熒光探針輔助研究硒(Ⅱ)、土霉素與DNA的相互作用[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2012(2):865-869.
[7] 彭俊峰,凌建亞,張晗星,張長(zhǎng)鎧.蟲草素與DNA作用的光譜研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2004(7):858-861.
[8] 蔡雪梅,李建晴,王文艷,董川,衛(wèi)艷麗.光譜法研究R-(+)-萘普生與DNA的相互作用[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2011(3):351-354.
[9] 張婧,胡林,劉艷輝,張碧程.DNA凝聚性質(zhì)的紫外光譜研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2012(5):1306-1309.
[10] 程風(fēng)杰,李楠,周瑞河,劉延成,陳振鋒,梁宏.噴昔洛韋的晶體結(jié)構(gòu)及其與ct-DNA的相互作用[A].第六屆化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C],2009-10-22.
[12] 費(fèi)丹,王興明,阮開敏,等.γ-環(huán)糊精-達(dá)旦黃包合物與鯡魚精DNA的作用機(jī)理[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,40(2):367-374.
[13] 高蘇亞,王黎,范濤,等.光度法研究姜黃素金屬絡(luò)合物與鮭魚精DNA的相互作用[J].應(yīng)用化工,2010,39(6):796-799.
[14] 張朝紅,蘇欣,臧樹良,趙廣富,馮沖,鐵梅,耿兵,董殿波.用紫外光譜和熒光光譜研究三丁基錫化合物與脫氧核糖核酸的相互作用[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2006(3):267-270.
[15] 張碧程,胡林,劉艷輝,張婧.喹諾酮藥物與DNA分子相互作用的紫外光譜研究[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2011(7):11-16.
Interaction of Ultraviolet Spectroscopy Study of Penciclovir and DNA
WANG Xiaoxia, GUO Guibao, WANG Zhengde, MA Litong, YAN Hui, HAI Bo, LIU Yunying, BAI Yuchen
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014010, China)
The spectral properties of penciclovir and DNA by UV spectra technique was studied. The results showed that the addition of DNA made the ultraviolet spectrum of penciclovir produce color, blue shift phenomenon. Between the penciclovir and DNA role was the intercalation. The binding constant between them was K=3.14×102L/mol.
penciclovir; DNA; ultraviolet absorption spectra
TQ 463;R 914.5
A
1671-9905(2016)12-0001-04
國(guó)家自然科學(xué)基金(21463016);內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2013MS0209);內(nèi)蒙古高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目(NJZZ14160);內(nèi)蒙古科技大學(xué)創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(2012NCL034)
王曉霞(1984-),女,內(nèi)蒙古包頭市人,講師,碩士,主要從事熒光光譜分析,電話:(0472)5951561,傳真:(0472)5951561,E-mail:wxx572369@163.com
2016-10-18