李翀，韓燕燕，鄭旭，呂艷，蘭福，趙杰

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300000；2天津中醫(yī)藥大學(xué))

·論著·

順鉑與XAV939聯(lián)合應(yīng)用對人肺癌細胞A549增殖、遷移能力的影響及機制

李翀1,2，韓燕燕1，鄭旭1，呂艷1，蘭福1，趙杰1

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300000；2天津中醫(yī)藥大學(xué))

目的 觀察順鉑聯(lián)合端錨聚合酶抑制劑XAV939對人肺癌細胞增殖和遷移能力的影響，并探討其機制。方法 將體外培養(yǎng)的人肺癌A549細胞分為空白對照組、順鉑組、XAV939組、順鉑+XAV939組，分別用1 μmol/L NaCl、0.002 g/L順鉑、1 μmol/L XAV939、0.002 g/L順鉑+1 μmol/L XAV939培養(yǎng)。用MTT法觀察各組細胞增殖情況并計算細胞增殖抑制率；用細胞劃痕實驗和Transwell小室實驗觀察各組細胞遷移能力；用Western blotting法檢測各組細胞中的WNT通路轉(zhuǎn)錄因子端錨聚合酶、β-連接素蛋白。結(jié)果 與對照組相比，順鉑組、XAV939組、順鉑+XAV939組細胞增殖抑制率高(P均<0.05)，細胞遷移距離短(P均<0.05)，穿膜細胞數(shù)少(P均<0.05)，細胞中端錨聚合酶、β-連接素蛋白相對表達量低(P均<0.05)；與順鉑組和XAV939組相比，順鉑+XAV939組細胞增殖抑制率高(P均<0.05)，細胞遷移距離短(P均<0.05)，穿膜細胞數(shù)少(P均<0.05)，細胞中端錨聚合酶、β-連接素蛋白相對表達量低(P均<0.05)。結(jié)論 順鉑聯(lián)合XAV939可以抑制人肺癌A549的增殖和遷移，且效果強于單用XAV939或順鉑。這可能與二者抑制WNT通路轉(zhuǎn)錄因子端錨聚合酶、β-連接素蛋白表達有關(guān)。

XAV939；順鉑；肺癌；細胞增殖；細胞遷移；WNT通路；端錨聚合酶；β-連接素

鉑類為主的化療是治療晚期非小細胞肺癌的主要手段，但是耐藥較多。端錨聚合酶在多數(shù)腫瘤中活性升高，是一種癌基因[1～5]，也是是WNT信號通路的轉(zhuǎn)錄因子。XAV939是端錨聚合酶小分子選擇性抑制劑，已用于治療乳腺癌、大腸癌等多種腫瘤，療效明顯[6，7]，但目前關(guān)于XAV939治療非小細胞肺癌的報道較少，其機制亦不明確[8]。本研究觀察了順鉑聯(lián)合XAV939對人肺癌A549細胞增殖、遷移能力及WNT信號通路轉(zhuǎn)錄因子端錨聚合酶、β-連接素表達的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌A549細胞株由天津市人民醫(yī)院張詩武主任饋贈。注射用順鉑凍干粉劑購自天津市中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。XAV939購自美國Selleck公司(S1180)。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國HyClone公司。端錨聚合酶抗體購自美國Abcam公司，β-連接素抗體、β-actin抗體購自北京中杉金橋公司。 MTT購自美國Sigma公司。

1.2 A549細胞分組及用藥方法 A549細胞加入含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞分為對照組、順鉑組、XAV939組和順鉑+XAV939組，分別用1 μmol/L NaCl、0.002 g/L順鉑、1 μmol/L XAV939、0.002 g/L順鉑+1 μmol/L XAV939培養(yǎng)。

1.3 各組A549細胞增殖情況觀察 采用MTT法。各組細胞接種到96孔板，用藥方法按照1.2進行，每孔200 μL，細胞密度2×104/mL，每組6個復(fù)孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48 h時，加入10 μL MTT孵育4 h，離心棄上清，再加入150 μL DMSO。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔490 nm波長處吸光度，計算各組A549細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-待測孔OD值/對照孔OD值)×100%。

1.4 各組A549細胞遷移能力觀察 ①細胞劃痕實驗：將細胞按1×105/孔接種于6孔板，分組及用藥方法按照1.2進行。待細胞長滿單層后，用100 μL移液槍頭在中間劃一劃痕， PBS洗去漂浮細胞，顯微鏡觀察、拍照。各組加入含有相應(yīng)藥物的無血清RPMI1640培養(yǎng)基處理24 h，同一觀察點處顯微鏡下再次觀察、拍照。用Image-Pro Plus6.0軟件測量劃痕間距，兩次劃痕間距的差值為細胞遷移距離。②Transwell小室實驗：Transwell小室不含有基質(zhì)，膠纖維孔徑為8 μm，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，上室加入100 μL不含胎牛血清的各組培養(yǎng)基，然后在上室加入1×108/L的各組細胞懸液30 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，取出濾膜，甲醇固定，Gimsa染色，顯微鏡下每張濾膜隨機取5個視野(200×)計數(shù)穿膜細胞數(shù)，取平均數(shù)。

1.5 各組A549細胞中端錨聚合酶、β-連接素蛋白檢測 采用Western blotting法。培養(yǎng)瓶內(nèi)各組細胞PBS充分洗滌，吸干。于冰上加入細胞裂解液 (1 ml RIPA+10 μL PMSF混合液) 80 μL。刮刀掛下液體至1.5 mL EP管，4 ℃下12 000 r/min離心10 min。取上清1 μL用于測蛋白濃度。取等量蛋白樣品，經(jīng)10%、12.5%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%TBST的脫脂奶粉封閉非特異結(jié)合位點，加入一抗anti-端錨聚合酶(1∶400)、 anti-β-連接素(1∶1 000) 、anti-β-actin(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜。TBST充分洗膜，發(fā)光混合溶液A和B各1 mL浸泡PVDF膜1 min，洗盡殘液，放入暗室，上附X線膠片，根據(jù)發(fā)光情況曝光膠片數(shù)秒到數(shù)分鐘，沖洗膠片，拍照。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 培養(yǎng)24、48 h各組細胞增殖抑制率見表1。由表1可見，與對照組相比，順鉑組、XAV939組、順鉑+XAV939組細胞增殖抑制率均增高(P均<0.05)；與順鉑組和XAV939組相比，順鉑+XAV939組細胞增殖抑制率增高(P均<0.05)。

表1 不同時點各組細胞增殖抑制率比較±s)

注：與對照組相比，＊P<0.05；與順鉑組相比，△P<0.05；與XAV939組相比，#P<0.05。

2.2 各組細胞遷移能力比較 各組細胞遷移距離和穿膜細胞數(shù)見表2。由表2可見，與對照組相比，順鉑組、XAV939組、順鉑+XAV939組細胞遷移距離短，穿膜細胞數(shù)少(P均<0.05)；與順鉑組和XAV939組相比，順鉑+XAV939組細胞遷移距離短，穿膜細胞數(shù)少(P均<0.05)。

2.3 各組A549細胞中端錨聚合酶和β-連接素蛋白表達比較 各組A549細胞中端錨聚合酶和β-連接素蛋白相對表達量見表3。由表3可見，與對照組相比，順鉑組、XAV939組、順鉑+XAV939組端錨聚合酶和β-連接素蛋白相對表達量低(P均<0.05)；與順鉑組和XAV939組相比，順鉑+XAV939組細胞端錨聚合酶和β-連接素蛋白相對表達量低(P均<0.05)。

表2 各組細胞遷移距離和穿膜細胞數(shù)比較±s)

注：與對照組相比，＊P<0.05；與順鉑組相比，△P<0.05；與XAV939組相比,#P<0.05。

表3 各組A549細胞中端錨聚合酶和β-連接素蛋白相對表達量比較±s)

注：與對照組相比，P<0.05；與順鉑組相比，△P<0.05；與XAV939組相比，#P<0.05。

3 討論

XAV939是端錨聚合酶的小分子選擇性抑制劑和特異有效的Wnt/β-連接素信號通路阻滯劑[9,10]。XAV939可抑制端錨聚合酶1和端錨聚合酶2的聚腺苷二磷酸-核糖多聚酶(PARP)活性，上調(diào)軸蛋白活性，維持細胞內(nèi)的動態(tài)穩(wěn)定，加速β-連接素被磷酸化降解，從而阻滯Wnt/β-連接素信號通路，阻滯c-myc、cyclin D1、fra-1、c-jun等一系列癌基因的激活，最終抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。XAV939不同于端粒酶抑制劑，其除了對Wnt/β-連接素信號通路有較強抑制作用外，對核轉(zhuǎn)錄因子-κB、轉(zhuǎn)化因子 或其他信號通路沒有影響。因此其對腫瘤細胞具有選擇性殺傷，對正常體細胞作用不大。近期實驗已證實XAV939對A549細胞的抑制作用有明顯的濃度依賴性和時間依賴性[8]。本研究結(jié)果顯示，單獨使用順鉑和XAV939均可抑制A549細胞增殖，但兩種藥物聯(lián)合使用時對A549細胞的增殖抑制作用效果更明顯。

腫瘤細胞的遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要步驟，抑制腫瘤細胞遷移可以有效的控制腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究細胞劃痕實驗及Transwell小室實驗結(jié)果均顯示，順鉑和XAV939均可以減少A549細胞的遷移距離和穿膜細胞數(shù)，從而降低其遷移能力；兩藥聯(lián)合應(yīng)用對A549細胞遷移能力的抑制更加明顯。這一結(jié)果與增殖實驗結(jié)果相一致。

β-連接素作為Wnt/β-連接素通路的中心因子，對腫瘤的增殖、分化、凋亡等起重要作用[11，12]。其中一個重要功能就是參與E-鈣黏蛋白介導(dǎo)的細胞與細胞間的黏附作用，而β-連接素的異常積蓄使E-鈣黏蛋白失活，失去細胞黏附作用，使癌細胞呈浸潤性、分散性生長[13]。本研究結(jié)果驗證了XAV939不僅可以抑制A549細胞的增殖和遷移，還可以直接降低A549細胞中端錨聚合酶和β-連接素的表達。在此基礎(chǔ)上，取順鉑和XAV939聯(lián)合作用于A549細胞,結(jié)果顯示，兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用，A549細胞中端錨聚合酶和β-連接素表達下降更明顯，提示順鉑、XAV939可能通過與端錨聚合酶 RARP結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，加速β-連接素被磷酸化降解，從而減少了β-連接素在細胞核/質(zhì)的累積，進而抑制經(jīng)典Wnt信號途徑的激活，抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

[1] Sun J, Huang H. Study on the expression of tankyrase in malignant hematopoietic cells and its relation with telomerase activity[J]. J Exp Hematol, 2004,12(1):11-15.

[2] Lu H, Lei Z, Lu Z, et al. Silencing tankyrase and telomerase promotes A549 human lung adenocarcinoma cell apoptosis and inhibits proliferation.[J]. Oncol Rep, 2013,30(4):1745-1752.

[3] Zhan ZL, Chong LI. Preliminary research on the effect of antisense oligodeoxynucleotides of tankyrase 1 on tumor growth following intratumoral injection in mice[J]. Chin J Tuber Resp Dis, 2004,27(9):604-607.

[4] Li M, Wang X, Jia T, et al. Tankyrase inhibitors attenuate WNT/β-catenin signaling and inhibit growth of hepatocellular carcinoma cells[J]. Oncotarget, 2015, 6(28):25390-25401.

[5] Busch AM, Johnson KC, Stan RV, et al. Evidence for tankyrases as antineoplastic targets in lung cancer[J]. Bmc Cancer, 2013, 13(1):122-129.

[6] Bao R. Inhibition of tankyrases induces axin stabilization and blocks wnt signalling in breast cancer cells[J]. PloS One, 2012, 7(11):3725-3744.

[7] Wu DW, Lin PL, Cheng YW, et al. DDX3 enhances oncogenic KRAS induced tumor invasion in colorectal cancer via the β catenin/ZEB1 axis[J]. Oncotarget, 2016,34(5):203-207.

[8] 李翀, 鄭旭, 韓燕燕,等. 不同濃度XAV939對肺腺癌細胞增殖和遷移能力的影響[J].山東醫(yī)藥,2016,56(22):15-17.

[9] 李翀, 李談, 戰(zhàn)忠利. Tankyrase1反義核酸干預(yù)肺癌移植瘤生長的實驗研究[J]. 中國腫瘤臨床, 2010, 37(19):1089-1093.

[10] Huang SMA, Mishina YM, Shanming L, et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signaling[J]. Nature, 2009, 461(7264):614-620.

[11] Si W, Li Y, Shao H, et al. MiR-34a inhibits breast cancer proliferation and progression by targeting wnt1 in wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Am J Med Sci, 2016，352(2)：191-199.

[12] Liu XP, Liu SC,Chen J, et al. Baicalein suppresses the proliferation of acute T-lymphoblastic leukemia Jurkat cells by inhibiting the Wnt/β-catenin signaling[J]. An Hematol, 2016，95(11):1787-1793.

[13] 武健, 吳鶯, 孟凡魯,等. miR-200c通過wnt/β-catenin信號途徑抑制SW480結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[J]. 江蘇醫(yī)藥, 2014, 40(11):1260-1262.

Effects of cisplatin combined with XAV939 on proliferation, migration and transcription factor expression in WNT pathway of human lung cancer A549 cells

LIChong1,HANYanyan,ZHENGXu,LYUYan,LANFu,ZHAOJie

(1FirstTeachingHospitalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300000,China)

Objective To observe the effects of cisplatin combined with tankyrase small molecule inhibitor XAV939 on the proliferation and migration of human lung cancer A549 cells and to investigate the mechanism. Methods The human lung cancer A549 cells were divided into the blank control group (treated with 1 μ mol/L NaCl), cisplatin group (treated with 0.002 g/L), XAV939 group (treated with 1 μ mol/L), and cisplatin+XAV939 group (treated with 0.002 g/L cisplatin+1 μ mol/L XAV939). The cell proliferation and proliferation inhibitory rates in each group were assessed by MTT assay. The cell migration ability was detected by Scratch test and Transwell chamber assay. Then, the protein expression of tankyrase and β-catenin was detected by Western blotting, respectively. Results Compared with the control group, the proliferation inhibitory rates of cells was higher, the cell migration distance was shorter, the number of transmembrane cells was less, and the protein expression of β-catenin and tankyrase was lower in the cisplatin group, XAV939 group, and cisplatin+XAV939 group (allP<0.05). Compared with the cisplatin and XAV939 group, the proliferation inhibitory rate of the cisplatin +XAV939 group was higher, the cell migration distance was shorter, the number of transmembrane cells was less, and the protein expression of β-catenin and tankyrase was lower (allP<0.05). Conclusions Cisplatin combined with XAV939 may inhibit the proliferation and migration abilities of A549 cells and the combined effect is more powerful that of XAV939 or cisplatin alone. This effect may be correlated with the inhibition of β-catenin expression and tankyrase expression.

XAV939; cisplatin; lung carcinoma; cell proliferation; cell migration; WNT pathway; tankyrase; β-catenin

天津市衛(wèi)生局科技基金資助項目(2014KZ130)。

李翀(1974-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向為腫瘤病理學(xué)。E-mail: lc740922@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.001

R323.2

A

1002-266X(2016)47-0001-03

2016-08-11)