潘軍平 蔣桂芳

解脲支原體藥敏及對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性研究

潘軍平 蔣桂芳

解脲支原體；氟喹諾酮類藥物；耐藥性；敏感性

非淋菌性尿道炎是臨床上常見的疾病，其發(fā)病率出現(xiàn)上升趨勢(shì),并超過(guò)淋病[1]。根據(jù)相關(guān)研究[2]結(jié)果顯示，非淋菌性尿道炎主要是由于沙眼衣原體和解脲支原體（ureaplasma urealyticum，Uu）引起，患者發(fā)病后主要以尿頻、尿急、尿痛等為主，影響患者正常生活和工作[3]。目前，臨床上對(duì)于非淋菌性尿道炎尚缺乏理想的治療方法，常規(guī)抗生素雖然能夠改善患者癥狀，但是病菌耐藥性較高。氟喹諾酮類藥物屬人工合成廣譜抗生素，廣泛用于非淋菌性尿道炎患者，但是近年來(lái)解脲支原體對(duì)非淋菌性尿道炎耐藥株不斷增加，且報(bào)道研究發(fā)現(xiàn)多為基因突變引起的氨基酸改變引起[4]。為了探討解脲支原體藥敏及對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性和敏感性。本研究選取我院收治的432例患者資料進(jìn)行分析，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年4月—2014年4月本院收治的432例患者中共分離出解脲支原體101株，其中男45例，女56例，年齡16～65歲，平均（47.4±1.3）歲。患者入院時(shí)臨床表現(xiàn)女性主要以白帶增多，部分患者伴有異位、外陰瘙癢等為主；男性則主要以尿道刺癢、燒灼感、尿頻、尿急等為主。男性解脲支原體取自尿道內(nèi)3～4cm處，女性從宮頸內(nèi)1～1.5cm處取材，對(duì)采集標(biāo)本進(jìn)行分離和鑒定?；颊邔?duì)實(shí)驗(yàn)方案、實(shí)驗(yàn)措施等有知情權(quán)。

1.2 方 法 研究中所用的Uu檢測(cè)以及藥敏分析試劑Mycoplasma ICS Kit試劑盒均由珠海麗珠試劑有限公司提供；DNA抽提、PCR以及相關(guān)試劑均由珠海麗珠試劑有限公司提供；實(shí)驗(yàn)中支原體檢測(cè)以及藥敏分析必須嚴(yán)格遵循試劑盒相關(guān)操作步驟進(jìn)行[5]。藥敏主要包括四環(huán)素類藥物，如強(qiáng)力霉素、美滿霉素；大環(huán)內(nèi)酯類：交沙霉素、克拉霉素、羅紅霉素等；喹諾酮類：如氧氟沙星、左旋氧氟沙星等。每種抗生素藥物均制備兩種濃度。強(qiáng)力美素與美滿霉素為4mg/L和8mg/L；交沙霉素為2mg/L、8mg/L；克拉霉素、羅紅霉素以及氧氟沙星等藥物濃度均為1mg/L 和4mg/L。當(dāng)藥敏兩孔均為紅色時(shí)為耐藥，藥敏孔低稀釋度變色，高稀釋度變化不明顯或不變色為重度敏感。選取1.5mL氟喹諾酮類耐藥菌株進(jìn)行10min離心，離心速度為15 000r/min，離心的半徑調(diào)整為4.9cm，去除上層清液，采用0.01mmol/L PBS進(jìn)行洗滌，然后進(jìn)行2min心，離心速度為13 000r/min，離心半徑為4.9cm，去除上層清液，向沉淀物內(nèi)加入200mg/mL蛋白酶K進(jìn)行消化2h，滅活5min，離心30s，離心半徑4.9cm，速度1000r/min，取10μL作為標(biāo)準(zhǔn)模板[6-7]。

1.3 PCR引物及反應(yīng)條件 參照相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)的引物，gyrA上下游引物序列分別為：5′-TTGCTGCTT TCGAAAACGG-3′，5′-CTGATGGTAAAACACTTGG-3′；gyrB上下游引物為5′-CCTGGTAAATTAGCTGAC TG-3′，5′-TTCGAATATGACTGCCATC-3′，反應(yīng)體系含有5μL 10×buffer，濃度為1.5mmol/lmg CL2，0.2mmol/ L dNTP，引物濃度為0.5μmol/L，加入2.5uTaqDNA聚合酶，2μL模板DNA，并采用超純水將其補(bǔ)充到50μL，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置PCR循環(huán)反應(yīng)條件。擴(kuò)增完畢后取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2μL溴酚藍(lán)，并取上層清液進(jìn)行染色，并進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，采用紫外透射反射檢測(cè)分析儀觀察結(jié)果。將獲得的PCR擴(kuò)張目的片段經(jīng)過(guò)回收純化后進(jìn)行測(cè)序，并將耐藥株測(cè)序結(jié)果采用Blast軟件和Genbank中Uu3基因序列進(jìn)行比較，確定基因變化情況[8-9]。

2 結(jié) 果

2.1 101株Uu對(duì)常用抗生素的藥物敏感情況 喹諾酮類藥物對(duì)Uu的耐藥性最高。氧氟沙星耐藥30株，耐藥率29.90%；羅紅霉素耐藥24株，耐藥率23.76%；阿奇霉素、美滿霉素以及克拉霉素耐藥均為166株，耐藥率15.84%，見表1。

表1 101株Uu對(duì)常用抗生素藥物敏感情況[株（%）]

2.2 gyrA、gyrB基因擴(kuò)增及突變分析 本研究PCR擴(kuò)增中分別得到大小為335bp和310bp的片段，對(duì)4株耐喹諾酮Uu進(jìn)行突變分析。結(jié)果顯示，2株耐喹諾酮Uu的gyrA302位堿基C-T誤義突變使其編碼的101位丙氨酸變?yōu)槔i氨酸；1株在gyrA13位發(fā)生突變，但是氨基酸未發(fā)生改變，另外1株為突變。

3 討 論

抗生素治療非淋菌性尿道炎效果理想，但是隨著抗生素的不斷使用，Uu對(duì)抗生素的耐藥率出現(xiàn)上升趨勢(shì)[10]。本研究顯示，喹諾酮類藥物對(duì)Uu的耐藥性最高。交沙霉素和強(qiáng)力霉素對(duì)Uu均具有良好的敏感性，但是藥物不良反應(yīng)發(fā)生率較高，且藥物價(jià)格比較昂貴，臨床上使用時(shí)受到患者家庭經(jīng)濟(jì)等因素的限制[11]。氧氟沙星、羅紅霉素等耐藥性也出現(xiàn)上升趨勢(shì)，可能和藥物長(zhǎng)期大劑量使用有關(guān)。因此，臨床上對(duì)于支原體感染患者治療時(shí)應(yīng)該加強(qiáng)細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)檢測(cè)，提高藥物使用合理性，從而降低耐藥株發(fā)生率[12]。

氟喹諾酮類藥藥物作用靶位為細(xì)菌擴(kuò)撲異構(gòu)酶，包括旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶。其中，旋轉(zhuǎn)酶主要是由gyrA和gyrB組成的A2B2四聚體結(jié)構(gòu)，并且由gyrA和gyrB基因編碼。而拓補(bǔ)異構(gòu)酶則主要是由C2E2四聚體結(jié)構(gòu)。目前，臨床上普遍認(rèn)為[13]，細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要表現(xiàn)為靶酶的突變。根據(jù)相關(guān)研究[14]結(jié)果顯示，大腸埃希菌旋轉(zhuǎn)酶的突變經(jīng)過(guò)出現(xiàn)在gyrA5′末端第199到318位堿基保守區(qū)。而gyrB5′的兩個(gè)位點(diǎn)，分別為425和447位氨基酸和喹諾酮類藥物耐藥關(guān)系密切。本研究對(duì)4株耐喹諾酮Uu進(jìn)行突變分析顯示，2株耐喹諾酮Uu的gyrA302位堿基C-T誤義突變使其編碼的101位丙氨酸變?yōu)槔i氨酸；1株在gyrA13位發(fā)生突變，但是氨基酸未發(fā)生改變，另外1株為突變。解脲支原體對(duì)氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生的耐藥性可能還與其他機(jī)制和基因有關(guān)，尚需要進(jìn)一步研究和分析。

綜上所述，解脲支原體對(duì)氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生的敏感性主要是由于gyrA基因突變引起所控氨基酸發(fā)生變化，臨床用藥應(yīng)選擇針對(duì)性的抗生素治療，提高臨床療效。

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（收稿：2015-08-27 修回：2015-10-26）

浙江省湖州市吳興區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（湖州 313008）

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