楊 梅 張 巖 金 昊 李一夫 夏 鵬 鄭少玲 蔡 勇 陳必成 楊亦榮

冬蟲夏草提取物對混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系Treg/Th17軸的影響

楊 梅 張 巖 金 昊 李一夫 夏 鵬 鄭少玲 蔡 勇 陳必成 楊亦榮

目的觀察冬蟲夏草提取物對混合淋巴細(xì)胞（MLC）培養(yǎng)體系Treg/Th17軸的影響，探討冬蟲夏草提取物的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。方法體外建立單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系，用冬蟲夏草提取物干預(yù)培養(yǎng)體系，在不同的時間點(diǎn)收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中輔助性T細(xì)胞17（Th17細(xì)胞）和CD4+CD25+T調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg細(xì)胞）的比例，并計算出Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞的比值；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法分別檢測培養(yǎng)液白細(xì)胞介素（IL）-17、IL-23、IL-2和IL-6的濃度。結(jié)果冬蟲夏草提取物干預(yù)組12、24、36h三個時間點(diǎn)T細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例分別為（13.17± 1.25）%、（12.3±1.31）%、（11.89±1.46）%，同時間點(diǎn)對照組T細(xì)胞Treg細(xì)胞比例分別為（11.04±1.32）%、（10.16±1.15）%、（8.91±0.97）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例分別為（2.81±0.13）%、（4.02±0.38）%、（4.95±0.49）%，同時間點(diǎn)的對照組T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例分別為（4.65±0.31）%、（6.63±0.63）%、（8.03±0.76）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。冬蟲夏草提取物干預(yù)組12、24、36h三個時間點(diǎn)T細(xì)胞中Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞的比例均顯著低于同時間點(diǎn)的對照組（P＜0.05）。冬蟲夏草提取物干預(yù)組12、24、36h三個時間點(diǎn)培養(yǎng)液IL-2水平明顯高于同時間點(diǎn)對照組（P＜0.05），而干預(yù)組培養(yǎng)液IL-6、IL-17、IL-23水平低于同時間點(diǎn)的對照組（P＜0.05）。結(jié)論冬蟲夏草提取物能夠明顯促進(jìn)MLC體系細(xì)胞中Treg細(xì)胞增殖，抑制Thl7細(xì)胞增殖，降低Th17/Treg細(xì)胞比值，改變Th17/Treg軸的平衡，同時增加IL-2分泌、減少IL-6、IL-17、IL-23分泌，有利于誘導(dǎo)免疫耐受。

冬蟲夏草提取物；細(xì)胞分化；輔助性T細(xì)胞17；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；細(xì)胞因子

冬蟲夏草（cordyceps sinensis，CS）是我國傳統(tǒng)中藥，現(xiàn)代科學(xué)研究證實(shí)了冬蟲夏草有抗腫瘤、降血壓、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、增強(qiáng)免疫力、鎮(zhèn)靜中樞、抗心肌缺血及調(diào)節(jié)心率等功能，臨床上人工冬蟲夏草制劑用于腎臟移植已近20年，療效顯著。我們前期對冬蟲夏草提取物治療移植動脈硬化的研究結(jié)果表明，冬蟲夏草可以減少T淋巴細(xì)胞浸潤，減輕慢性排斥反應(yīng)，延緩大鼠移植動脈硬化的進(jìn)展[1-2]；但其抗慢性排斥的機(jī)理不明。本研究通過觀察冬蟲夏草提取物對混合淋巴細(xì)胞（MLC）培養(yǎng)體系Treg/Th17軸及細(xì)胞因子的影響，探討冬蟲夏草提取物的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥 物 冬蟲夏草提取物的制備：冬蟲夏草在15℃恒溫下培養(yǎng)45天，取冬蟲夏草菌絲體，經(jīng)過濾、干燥和粉碎成為超細(xì)粉。超細(xì)粉經(jīng)過乙醇提取、水提取和酶解，溶解至水中，4℃冰箱保存。

1.2 試 劑 RPMI-1640培養(yǎng)基為美國GIBCO公司產(chǎn)品，新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，絲裂霉素為浙江海正藥業(yè)公司產(chǎn)品，BCA蛋白濃度測定試劑盒為江蘇碧云天生物研究所產(chǎn)品。FITC標(biāo)記的CD4單克隆抗體，PE標(biāo)記的白細(xì)胞介素（IL）-17A、CD25單克隆抗體均購自美國eBioscience公司。小鼠IL-2、IL-6、IL-17A和 IL-23酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒均購自美國eBioscience公司。

1.3 動 物 受鼠為BALB/c小鼠，雌性；供鼠為C57BL/6小鼠，雄性；均為清潔級近交系小鼠，鼠齡8～12周，溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SYXK（浙）2010-0150。所有小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的嚙齒類食物喂養(yǎng)，可自由飲水。喂養(yǎng)環(huán)境設(shè)置：12h：12h人工白天黑夜循環(huán)，維持室內(nèi)溫度（21±2）℃，濕度（55±2）%。

2 試驗(yàn)方法

2.1 單向MLC培養(yǎng)體系的建立 將C57BL/6小鼠（供鼠）頸椎脫臼處死，置入75%的乙醇中浸泡10 min，在超凈臺內(nèi)無菌取出小鼠脾臟，置于200目金屬過濾網(wǎng)上，勻漿器芯輕輕研磨，制成脾細(xì)胞懸液，用RPMI-1640液洗2次。調(diào)整細(xì)胞含量為1×109/L。經(jīng)臺盼藍(lán)染色后計算細(xì)胞存活率（＞95%）。計數(shù)板計數(shù)并將C57BL/6小鼠脾細(xì)胞調(diào)2×109/L作為反應(yīng)細(xì)胞。BALB/c小鼠（受鼠）的脾細(xì)胞取法同上。將BALB/ c小鼠脾細(xì)胞含量調(diào)至1×109/L，加入絲裂霉素至終濃度25mg/L，于37℃水浴作用30min，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次，除去殘余的絲裂霉素，調(diào)整細(xì)胞含量至2×109/L，作為刺激細(xì)胞。將已制備好的供受鼠脾細(xì)胞按如下分組加入24孔板，每孔加入反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞各0.1mL。實(shí)驗(yàn)分組：對照組不加任何處理，冬蟲夏草組每孔加入無菌處理過的2mmol/L蟲草提取物，每組設(shè)3個復(fù)孔，各組均置于37℃ 5%CO2孵箱進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的12、24、36h時收集各實(shí)驗(yàn)孔的細(xì)胞。

2.2 CD4+CD25+T及Th17+T細(xì)胞檢測 制備淋巴細(xì)胞懸液，將淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整為5×108/L，加入異硫氰基熒光素（FITC）標(biāo)記的抗CD4單抗和藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗CD25單抗，上機(jī)檢測。以陰性對照管設(shè)門參數(shù)，檢測CD4+CD25+T細(xì)胞。將淋巴細(xì)胞密度調(diào)整為5×106/mL，加入異硫氰基熒光素（FITC）標(biāo)記的抗CD4單抗和藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗白細(xì)胞介素（IL）-17單抗，破膜后上機(jī)檢測，以陰性管設(shè)門參數(shù)作為對照，檢測CD4+IL-17+Th17細(xì)胞比例。

2.3 培養(yǎng)液IL-17和IL-23水平測定 取培養(yǎng)液，使用小鼠IL-2、IL-6、IL-17A和IL-23酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒分別檢測培養(yǎng)液中IL-2、IL-6、IL-17A和IL-23的水平，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 冬蟲夏草提取物對Treg細(xì)胞分化和增殖的影響 對照組12、24、36h三個時間點(diǎn)CD4+CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例隨時間延長而下降，呈時間依賴性。冬蟲夏草組12、24、36h三個時間點(diǎn)CD4+ CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例均顯著高于同時間點(diǎn)的對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1，圖1（封二）。

3.2 冬蟲夏草提取物對Th17細(xì)胞分化和增殖的影響 對照組12、24、36h三個時間點(diǎn)CD4+Th17+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例隨時間延長而增加，呈時間依賴性。冬蟲夏草組12、24、36h三個時間點(diǎn)CD4+ Th17+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例均顯著低于同時間點(diǎn)的對照組（P＜0.05），見表1，圖2（封二）。

3.3 冬蟲夏草提取物對Th17/Treg細(xì)胞比值的影響

對照組12、24、36h三個時間點(diǎn)Th17/Treg細(xì)胞比值隨時間延長而升高，呈時間依賴性。冬蟲夏草組12、24、36h三個時間點(diǎn)TTh17/Treg細(xì)胞比值均顯著低于同時間點(diǎn)的對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

3.4 冬蟲夏草提取物對混合淋巴培養(yǎng)體系IL-2、IL-6、IL-17和IL-23表達(dá)水平的影響 對照組12、24、36h三個時間點(diǎn)IL-2濃度隨時間延長而升高，呈時間依賴性。冬蟲夏草組12、24、36h三個時間點(diǎn)IL-2濃度均顯著高于同時間點(diǎn)的對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。對照組12、24、36h三個時間點(diǎn)IL-6、IL-23、IL-17濃度分均隨時間延長而下降，呈時間依賴性。冬蟲夏草組12、24、36h三個時間點(diǎn)IL-6、IL-23、IL-17濃度均顯著低于同時間點(diǎn)的對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 各組混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系CD4+CD25+Treg、CD4+Th17細(xì)胞的分布（%，±s）

表1 各組混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系CD4+CD25+Treg、CD4+Th17細(xì)胞的分布（%，±s）

注：與12h比較，*P＜0.05；與24h比較，△P＜0.05；與同時間點(diǎn)對照組比較，▲P＜0.05；Treg：調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞；Th17：輔助性T淋巴細(xì)胞17

時間12h 24h 36h對照組冬蟲夏草干預(yù)組Treg 11.04±1.32 10.16±1.15* 8.91±0.97*△Th17 4.65±0.31 6.63±0.63* 8.03±0.76*△Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞0.42±0.06 0.65±0.07* 0.89±0.11*△Treg 13.17±1.25▲12.3±1.31*▲11.89±1.46*△▲Th17 2.81±0.13▲4.02±0.38*▲4.95±0.49*△▲Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞0.21±0.03▲0.33±0.05*▲0.41±0.08*△▲

表2 各組淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液IL-2、IL-6、IL-17和IL-23表達(dá)水平（pg/mL±s）

表2 各組淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液IL-2、IL-6、IL-17和IL-23表達(dá)水平（pg/mL±s）

注：與12h比較，*P＜0.05；與24h比較，△P＜0.05；與同時間點(diǎn)對照組比較，▲P＜0.05；IL-2：細(xì)胞介素-2；IL-6：白細(xì)胞介素-6；IL-17A：白細(xì)胞介素-17A；IL-23：白細(xì)胞介素-23

時間12h 24h 36h對照組 冬蟲夏草干預(yù)組IL-2 125.13±15.39 139.82±20.36* 157.69±21.09*△IL-6 120.64±11.06 132.07±13.39* 138.74±14.15*△IL-17A 61.79±11.55 75.58±14.34* 83.03±16.25*△IL-23 112.70±18.75 96.31±14.61* 87.16±12.85*△IL-2 144±19.37▲176±24.11*▲189.35±32.15*△▲IL-6 102.73±8.65▲114.47±9.37*▲122.31±9.89*△▲IL-17A 46.17±7.46▲58.02±9.86*▲63.97±10.99*△▲IL-23 81.49±12.77▲74.93±10.08*▲59.82±7.63*△▲

4 討 論

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis（Berk）Sace.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體。最近一些研究證實(shí)冬蟲夏草能延長異體皮膚移植物和心臟移植的存活時間，和環(huán)孢素A有協(xié)同效應(yīng)，與環(huán)孢素A聯(lián)用可以抑制排斥反應(yīng)，同時減少環(huán)孢素A引起的蛋白尿和延緩慢性移植物腎臟病的進(jìn)展[3]。He等[4]研究表明，冬蟲夏草對慢性移植物腎臟病有一定的治療作用，它可以減輕腎小球及腎小管間質(zhì)損害。此外，冬蟲夏草能顯著降低CD8+T細(xì)胞活性，抑制急性排斥反應(yīng)，減輕移植物血管病[5]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草提取物有顯著地抗移植物血管病的作用，并且有顯著的抗慢性排斥的作用[1-2]，但其抗慢性排斥的機(jī)制不明。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）中以對CD4+CD25+的T調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞的研究最為突出。在體內(nèi)，CD4+ CD25+Treg可抑制CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)[6]；CD4+CD25+Treg可抑制抗原特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)[7]；CD4+CD25+Treg可直接或間接作用于抗原提呈細(xì)胞（APC），從而影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生，下調(diào)共刺激分子的表達(dá)，通過促進(jìn)凋亡而清除效應(yīng)細(xì)胞[8-9]。在免疫耐受形成的過程中，IL-2參與誘導(dǎo)初始CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細(xì)胞并表達(dá)Foxp3，使其具備調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特性[10]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體存在一種新型的不同于Th1 和Th2的CD4+效應(yīng)細(xì)胞——輔助性T細(xì)胞17型（T help cell 17，Th17），該細(xì)胞是由天然T細(xì)胞前體分化而來，具有獨(dú)立的分化和調(diào)節(jié)機(jī)制，特異性產(chǎn)生白介素（interleukin 17，IL-17）效應(yīng)因子，在自身免疫性疾病和機(jī)體防御反應(yīng)中具有重要的意義[11]。IL-23主要參與Thl7細(xì)胞的擴(kuò)增以及功能的維持12。IL-2是Th17細(xì)胞分化的抑制因素，它通過STAT5信號傳導(dǎo)對Th17細(xì)胞的分化起到抑制作用[12]Th17細(xì)胞除了分泌IL-17以外還可以產(chǎn)生IL-21、IL-22、TNF-α和IL-6等炎性因子，Thl7細(xì)胞在疾病中的作用主要是促進(jìn)器官特異性的自身免疫性疾病和慢性感染的防御[13]。研究證實(shí)，IL-23或者IL-17缺陷小鼠可以降低自身免疫病和慢性感染的易感性，而近期的一些研究也表明，TH17細(xì)胞可以加速移植物血管病的進(jìn)程，介導(dǎo)移植血管硬化[14-15]。

正常體內(nèi)Treg與Th17細(xì)胞保持平衡狀態(tài)，而當(dāng)炎癥等情況時Th17細(xì)胞分化增強(qiáng)比例增加導(dǎo)致Treg/Th17失衡，是引起多種自身免疫病以及移植排斥的重要原因[16]。Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞之間存在復(fù)雜的相關(guān)關(guān)系，二者在功能上相互拮抗，而在分化上卻具有相關(guān)性。Treg/Th17的平衡在器官移植、自身免疫性疾病中有著重要的作用[17]。Treg/Th17的平衡能夠抑制炎癥反應(yīng)[18]，減輕排斥，誘導(dǎo)免疫耐受，在大鼠的肝臟移植[19]及人類的移植物抗宿主病[20]中均得到了證實(shí)。通過調(diào)控Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值可以維持體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)的平衡，該比值升高時，自身免疫及促炎效應(yīng)占優(yōu)勢，比值降低時，免疫耐受及抗炎效應(yīng)占優(yōu)勢。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干預(yù)組Treg細(xì)胞顯著高于同時間點(diǎn)的對照組，而Th17細(xì)胞顯著低于同時間點(diǎn)的對照組，干預(yù)組的Th17/Treg細(xì)胞比值也顯著低于同時間點(diǎn)的對照組。表明冬蟲夏草提取物可以顯著促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖，抑制Th17細(xì)胞增殖，降低Th17/Treg細(xì)胞比值，改變Th17/Treg軸的平衡，誘導(dǎo)T細(xì)胞向Treg分化，抑制T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。同時檢測培養(yǎng)體系中一系列細(xì)胞因子的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)干預(yù)組IL-2水平顯著高于同時間點(diǎn)的對照組；IL-6、IL-17和IL-23表達(dá)水平顯著低于同時間點(diǎn)的對照組。這表明冬蟲夏草提取物可以提高IL-2水平，降低IL-6、IL-17和IL-23表達(dá)水平。而IL-2正是CD4+ CD25+細(xì)胞擴(kuò)增所必需的細(xì)胞因子。這也是冬蟲夏草提取物誘導(dǎo)T細(xì)胞向Treg分化的一個分子水平的證據(jù)。另外冬蟲夏草提取物降低了IL-6、IL-17和IL-23表達(dá)水平，這可能是其抑制T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，Th17細(xì)胞數(shù)量減少，分泌的IL-6、IL-17和IL-23也相應(yīng)的減少，這些促炎因子的減少也有利于誘導(dǎo)免疫耐受。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，冬蟲夏草提取物能改變Th17/Treg軸的平衡，誘導(dǎo)T細(xì)胞向Treg分化，抑制T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。提高單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中IL-2表達(dá)水平，降低IL-6、IL-17和IL-23表達(dá)水平。其誘導(dǎo)免疫耐受的作用機(jī)制可能是通過改變Th17/Treg軸的平衡，提高抗炎細(xì)胞因子，降低炎性細(xì)胞因子來實(shí)現(xiàn)的，具體機(jī)制有待于在動物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（收稿：2015-08-11 修回：2015-10-10）

Influence of Cordyceps Sinensis Extract on the Treg/Th17 Axis of Mixed Lymphocyte Culture Technique

YANG Mei,ZHANG Yan,允IN Hao,Li Yifu,XIA Peng,ZHENG Shaoling,CAI Yong,CHEN Bicheng,YANG Yirong.Department of Intensive Care Unit（YANG Mei）,Centre for Transplantation（ZHANG Yan,JIN Hao,Li Yifu,XIA Peng,ZHENG Shaoling,CAI Yong,YANG Yirong）,Department of Surgery Laboratory（CHEN Bicheng）, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medicine University,Wenzhou(325000),China

ObjectiveTo investigate the influence of Cordyceps sinensis extract on the Treg/Th17 axis of mixed lymphocyte culture（MLC）system,in order to explore the immune regulation mechanism of Cordyceps sinensis extract.MethodsOne-way mixed lymphocyte culture system was established in vitro,then was interfered with Cordyceps sinensis extract.Cells were collected at different time points for detection of Th17 cells and Treg cells by flow cytometry;the ratio of TH17 cells to Treg cells was calculated.Enzyme linked immunosorbent assay was used to determine concentrations of interleukin（IL）-17,IL-23,IL-2 and IL-6 in the medium.ResultsAt 12,24, 36 h after treatment,the percentage of Treg cells in Cordyceps sinensis extract group were 13.17%±1.25%,12.3%± 1.31%,11.89%±1.46%,those in control group were 11.04%±1.32%,10.16%±1.15%,8.91%±0.97%;the difference between the 2 groups was statistically significant（P＜0.05）.At the same time points,the percentage of Th17 cells in Cordyceps sinensis extract group were 2.81%±0.13%,4.02%±0.38%,4.95%±0.49%,those in control group were 4.65%±0.31%,6.63%±0.63%,8.03%±0.76%,with significant difference between 2 groups（P＜0.05）.The ratio of TH17/Treg in Cordyceps sinensis extract group was significantly lower than that of control group at the same timepoints（P＜0.05）.IL-2 levels of the medium in Cordyceps sinensis extract group were significantly higher than those in the control group at the same time points（P＜0.05）,while IL-6,IL-17,and IL-23 levels were significantly lower than those in control group（P＜0.05）.ConclusionCordyceps sinensis extract can obviously promote the proliferation of Treg cells,inhibit the proliferation of Thl7 cells,resulting in the decrease of the ratio of Th17/Treg and consequently changing the balance of Th17/Treg axis in the system of MLC cells.Meanwhile,Cordyceps sinensis extract can increase the secretion of IL-2,reduce the secretion of IL-6,IL-17,IL-23,which is advantageous to the induction of immune tolerance.

Cordyceps sinensis extract;cell differentiation;Th17cells;regulatory T cells;cytokine

浙江省溫州市科技計劃項(xiàng)目（No.Y20120207，Y20120158）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.LQ13H100003，No.LQ16H100003）

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（楊梅）、移植中心（張巖、金昊、李一夫、夏鵬、鄭少玲、蔡勇、楊亦榮）、外科實(shí)驗(yàn)室（陳必成）（溫州 325000）

張巖，E-mail：biobabry@163.com