楊 夢(mèng)，王 鵬，徐曉倩，熊長(zhǎng)輝，劉曉青，袁 輝，潘歡弘

碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥肺炎克雷伯菌耐藥基因分布和分子分型

楊 夢(mèng)，王 鵬，徐曉倩，熊長(zhǎng)輝，劉曉青，袁 輝，潘歡弘

目的 探討碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥基因分布及分子分型特征。方法收集38株臨床分離的肺炎克雷伯菌，采用肉湯稀釋法藥敏實(shí)驗(yàn)、改良Hodge試驗(yàn)、PCR電泳、脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型及多位點(diǎn)序列分型測(cè)定其耐藥性、耐藥基因型及分子型別。結(jié)果對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物亞胺培南、美羅培南、厄他培南耐藥率分別為18.42%(7/38)、28.95%(11/38)、34.21%(13/38)，其中有7株(18.42%)同時(shí)耐3種藥物。對(duì)阿米卡星、左氧氟沙星、四環(huán)素、呋喃妥因、甲氨芐啶/磺胺甲惡唑、慶大霉素耐藥率為23.68%～44.74%，阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑啉、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南、環(huán)丙沙星耐藥率均大于52.63%，氨芐西林、哌拉西林耐藥率100%。有11 株肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶表型檢測(cè)為陽(yáng)性，占28.95%(11/38),其中5株攜帶blaKPC基因，均為KPC-2型；4株攜帶blaNDM基因，均為NDM-1型。9株攜帶blaKPC或blaNDM耐藥基因的菌株同源性分析顯示有8種不同PFGE帶型，5種MLST 型別(ST型)。5種ST型為ST11、ST15、ST395、ST1031、ST1412，其中以ST11為主。結(jié)論肺炎克雷伯菌耐藥及多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類(lèi)藥物的主要的原因是攜帶KPC-2或者NDM-1基因，菌株基因型多態(tài)性大，提示病例之間不存在關(guān)聯(lián)性。

肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；耐藥基因；分子分型

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是一種重要的機(jī)會(huì)致病菌，常導(dǎo)致肺炎、支氣管炎、泌尿道和創(chuàng)傷感染等醫(yī)院感染。由于高耐藥性而被廣泛關(guān)注。碳青霉烯類(lèi)抗生素是抗菌譜廣、抗菌活性最強(qiáng)的一類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶抗生素，因其具有對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定以及毒性低等特點(diǎn)，已成為治療嚴(yán)重細(xì)菌感染最主要的抗菌藥物之一。但是，隨著碳青霉烯類(lèi)抗生素在臨床上使用的增加，碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥菌株也不斷增加，特別是耐碳青霉烯類(lèi)抗生素的肺炎克雷伯菌快速增加。耐藥菌株中表達(dá)碳青霉烯酶[1-2]，主要是KPC酶和NDM金屬酶。本研究對(duì)肺炎克雷伯菌臨床分離株進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)，篩選出對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌，并通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis typing，PFGE)和多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)方法進(jìn)行分子分型研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 試驗(yàn)菌株為江西省臨床實(shí)驗(yàn)室分離的肺炎克雷伯菌共38株，分離標(biāo)本來(lái)源為痰液22株、尿液8株、血液4株、引流液2株、傷口分泌物2株，見(jiàn)表1。耐藥表型實(shí)驗(yàn)和耐藥基因檢測(cè)的質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706；PFGE分子量標(biāo)準(zhǔn)參考菌株沙門(mén)菌H9812。

1.2 主要儀器 VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀 (法國(guó)Bio-Mrieux 公司) ；PCR 擴(kuò)增儀PTC200、脈沖腸凝膠電泳儀CHEF-DRIII system、凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc2000(美國(guó)Bio-Rad)；電泳儀(北京六一廠(chǎng))；恒溫培養(yǎng)箱(日本TOKYO RIKAKAI EYELA)；微量高速離心機(jī)(德國(guó)eppdoff)。

1.3 主要試劑 VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析儀鑒定卡及GN 14藥敏卡(法國(guó)Bio-Mrieux 公司) ，碳青烯酶類(lèi)藥敏板條(上海星佰有限公司)，TaqDNA聚合酶、dNTPs 、DL2000 Marker、限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ、蛋白酶K、TBE(大連TaKaRa公司)，PCR引物合成(上海生工生物公司)，Gold View核酸染料(上海賽百盛公司)，瓊脂糖(GENE 公司)，核酸提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)。

1.4 菌株復(fù)核及抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 菌株復(fù)蘇后經(jīng)VITEK 2 Compact 分析儀鑒定。先用VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析儀GN14藥敏卡進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，再用稀釋法對(duì)碳青烯酶類(lèi)藥物進(jìn)行分析，判讀及結(jié)果解釋依照2014年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI) 文件進(jìn)行。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株來(lái)源

Tab.1 Information of strains

菌株編號(hào)StrainID標(biāo)本Specimen菌株編號(hào)StrainID標(biāo)本Specimenkp6sputumkp37sputumkp7sputumkp38woundsecretionkp8urinekp42bloodkp9urinekp44drainagekp10sputumkp45sputumkp11urinekp49sputumkp12sputumkp52sputumkp16urinekp62urinekp22sputumkp66sputumkp24urinekp70sputumkp25bloodkp71sputumkp26woundsecretionkp72sputumkp27sputumkp76sputumkp28sputumkp77urinekp31sputumkp78urinekp32sputumkp79sputumkp33sputumkp96drainagekp34bloodkp99bloodkp36sputumkp105sputum

1.5 碳青霉烯酶檢測(cè)(改良Hodge 試驗(yàn)) 將0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏拇竽c埃希菌ATCC25922菌液稀釋10倍后均勻涂布在M-H平板上，中間貼美羅培南紙片(10 μg /片) ，使用1 μL接種環(huán)挑取3個(gè)過(guò)夜生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)菌株菌落垂直于藥敏紙片從紙片邊緣開(kāi)始劃線(xiàn)，長(zhǎng)度為20～25 mm，35 ℃孵育16～20 h，美羅培南抑菌圈處出現(xiàn)凹進(jìn)現(xiàn)象者為改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性，提示該菌株產(chǎn)碳青霉烯酶。陽(yáng)性質(zhì)控菌為肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，陰性質(zhì)控菌為肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706。

1.6 DNA提取 挑取一定量的新鮮培養(yǎng)物懸濁于100 μL純水，沸水浴30 min后，10 000 r/min離心5 min，吸取上清液即為DNA模板，-20 ℃以下保存。1.7 基因檢測(cè)與分析 以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測(cè)耐藥基因blaKPC、blaNDM基因，引物由上海生工合成，引物序列和擴(kuò)增條件詳見(jiàn)表2，所有反應(yīng)體系為25 μL，含有正向引物(F)和反向引物(R)各1 μL、DNA 模板2 μL，10×Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、ddH2O 16 μL，Taq酶0.5 μL。反應(yīng)過(guò)程各項(xiàng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，退火1 min，(退火溫度各基因略有不同)，72 ℃ 1min， 30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Gold View核酸染料的1.5%瓊脂糖電泳。用凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察結(jié)果并拍照。對(duì)攜帶blaKPC、blaNDM基因的菌株采用PCR方法擴(kuò)增基因全長(zhǎng)及測(cè)序，所測(cè)得序列與GenBank已發(fā)表的blaKPC-2、blaNDM-1基因序列比對(duì)。

表2 基因引物序列、產(chǎn)物大小及退火溫度

Tab.2 Primers product size and annealing temperature used in this study

引物名稱(chēng)Primername引物序列(5＇→3＇)Primersequences產(chǎn)物大小(bp)Productsize退火溫度(℃)AnnealingtemperatureblaKPC?FATGTCACTGTATCGCCGTCT88256blaKPC?FTTTTCAGAGCCTTACTGCCCNDM?1?UF：TCGCATAAAACGCCTCTG100755NDM?1?LR：GAAACTGTCGCACCTCAT

1.8 PFGE聚類(lèi)性分析 參照PulseNet China標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)菌株和沙門(mén)菌H9812均選用XbaI酶切。PFGE電泳系統(tǒng)為Bio-Rad公司CHEF DRIII型，電泳電壓6 V，夾角120°，脈沖條件為6～36 s，18.5 h。獲得的電泳圖像以BioNumerics6.6數(shù)據(jù)庫(kù)軟件進(jìn)行分型分析。

1.9 MLST分析 對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的7個(gè)管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB) 參照http：//www．pasteur．fr/recherche/genopole/PF8/mlst/primersKpneumoniae． html 公布的通用引物及退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，將序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中儲(chǔ)存的序列比對(duì)，確定其等位基因譜型及菌株序列型(ST型) 利用官方提供的工具生成Minimum Spanning Trees。

2 結(jié) 果

2.1 抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的解釋標(biāo)準(zhǔn)。 我們分別用Vitek GN14藥敏板條和上海星佰公司的碳青霉烯類(lèi)板條開(kāi)展了抗生素敏感性試驗(yàn)。

38株肺炎克雷伯菌用GN14板條的藥敏結(jié)果，對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物厄他培南、亞胺培南、美洛培南耐藥率為23.68%(9/38)，(菌株號(hào)分別為KP11、KP22、KP24、KP25、KP28、KP31、KP33、KP36、KP49)，阿米卡星、左氧氟沙星、四環(huán)素、呋喃妥因、甲氨芐啶/磺胺甲惡唑、慶大霉素耐藥率為23.68%～44.74%，阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑啉、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南、環(huán)丙沙星耐藥率均大于52.63%，氨芐西林、哌拉西林耐藥率100%，有9株菌同時(shí)對(duì)3種碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥。

38株肺炎克雷伯菌用上海星佰公司的碳青霉烯類(lèi)板條進(jìn)行試驗(yàn)，其結(jié)果為對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物亞胺培南、美羅培南、厄他培南耐藥率分別為18.42%(7/38)、28.95%(11/38)、 34.21%(13/38)，其中有7株(18.42%)同時(shí)耐3種藥物(菌株號(hào)分別為KP11、KP12、KP22、KP24、KP25、KP26、KP28、KP31、KP33、KP36、KP42、KP44、KP49)見(jiàn)表3。

表3 38株肺炎克雷伯菌菌株的藥敏結(jié)果

Tab.3 Antibiotic sensitivity results of 38 K. pneumonia strains

抗菌素名稱(chēng)antibiotics檢測(cè)菌株數(shù)No．ofstrainstested敏感菌株數(shù)No．ofsensitivestrains中介菌株數(shù)No．ofintermediarystrains耐藥菌株數(shù)No．ofresistancestrains耐藥率%Resistantrate亞胺培南Imipenem38274718．42美羅培南Meropenem382701128．95厄他培南Ertapenem382501334．21

2.2 碳青霉烯酶檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)改良 Hodge 試驗(yàn)檢測(cè)，38株肺炎克雷伯菌中有11 株產(chǎn)碳青霉烯酶，占28.95%，分別為KP7、KP11、KP22、KP24、KP25、KP28、KP33、KP36、KP45、KP49、KP105。

2.3 耐藥基因PCR檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果 采用blaKPC、blaNDM基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序，確定菌株是否攜帶blaKPC或blaNDM基因及其型別。38株肺炎克雷伯菌經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)出5株攜帶blaKPC基因(KP25、KP28、KP33、KP45、KP49、)，4株攜帶blaNDM基因(KP11、KP22、KP24、KP105)，KPC或NDM基因陽(yáng)性的，通過(guò)測(cè)序和BLAST比對(duì)，與KPC-2或NDM-1基因完全一致。

2.4 PFGE 結(jié)果分析 對(duì)攜帶blaKPC-2、blaNDM-1耐藥基因的9株菌株進(jìn)行PFGE分型分析，經(jīng)XbaⅠ內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行PFGE分型，其中1株菌(KP45)發(fā)生DNA降解未獲得圖譜，其余8株P(guān)FGE圖譜條帶清晰。將圖譜錄入BioNumerics軟件進(jìn)行分析和構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)(圖1)。結(jié)果顯示，8株菌株中PFGE帶型各不相同，相似系數(shù)在56%～71%之間。

2.5 MLST分析 通過(guò)MLST分型，9株菌分為5種MLST 型別(ST型)。其中攜帶blaKPC-2基因的5株菌分為2種ST型，其中4株為ST11型，1株為ST15型；4株攜帶blaNDM-1基因的菌株分為4種不同的ST型，分別為ST15、ST395、ST1031、ST1412。見(jiàn)表4、圖2。

圖1 8株肺炎克雷伯菌PFGE結(jié)果聚類(lèi)圖Fig.1 Cluster tree of eight K.pneumonia strains based on PFGE patterns

圖2 9株肺炎克雷伯菌MLST分型最小生成樹(shù)Fig.2 Minimum spanning tree of nine K.pneumonia strains based on MLST

表4 MLST等位基因和耐藥基因結(jié)果

Tab.4 Results of MLST and distribution of antibiotic resistance genes

實(shí)驗(yàn)菌株StrainID耐藥基因AntibioticresistancegenesMLST等位基因譜MLSTprofileST型MLSTtypeJX2014KP11NDM?13?1?2?4?1?1?4ST?395JX2014KP22NDM?11?1?1?1?1?1?1ST?15JX2014KP24NDM?12?5?1?1?4?1?18ST?1412JX2014KP25KPC?21?1?1?1?1?1?1ST?15JX2014KP28KPC?23?3?1?1?1?1?4ST?11JX2014KP33KPC?23?3?1?1?1?1?4ST?11JX2014KP45KPC?23?3?1?1?1?1?4ST?11JX2014KP49KPC?23?3?1?1?1?1?4ST?11JX2014KP105NDM?118?22?18?23?134?13?51ST?1031

3 討 論

肺炎克雷伯菌是最常見(jiàn)的醫(yī)院感染菌，可引起下呼吸道、泌尿生殖道、血流、傷口及顱內(nèi)等感染。隨著碳青霉烯類(lèi)抗生素這類(lèi)藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，碳青霉烯類(lèi)耐藥的肺炎克雷伯菌菌株逐漸增多并出現(xiàn)播散的現(xiàn)象，給臨床的治療帶來(lái)了極大的困難。我們從臨床病例標(biāo)本中分離出的38株肺炎克雷伯菌，經(jīng)改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果顯示，11株菌產(chǎn)碳青霉烯酶，可見(jiàn)產(chǎn)碳青霉烯酶是造成肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯酶類(lèi)抗菌藥物敏感性下降的一個(gè)重要原因[3]。

碳青霉烯酶依據(jù)Ambler分類(lèi)有A、B和D 3類(lèi)，我國(guó)耐碳青霉烯類(lèi)抗生素的肺炎克雷伯菌主要以A類(lèi)和B類(lèi)為主。A類(lèi)碳青霉烯酶，最多見(jiàn)的是KPC型碳青霉烯酶，我國(guó)多以KPC-2為主；B類(lèi)碳青霉烯酶，即金屬酶，包括 IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、SFO 和 NDM-1 等[4]，最近幾年報(bào)道的超級(jí)細(xì)菌攜帶的NDM-1也屬于B類(lèi)酶；NDM-1首次在印度引起暴發(fā)感染以來(lái)，陸續(xù)在世界各地都有報(bào)道發(fā)現(xiàn)NDM-1引起的感染[5]。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所2010年首次報(bào)道了在屎腸球菌中分離到3株NDM-1細(xì)菌。

本實(shí)驗(yàn)有2株菌Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性(KP7、KP36)，但未檢測(cè)到blaNDM或blaKPC基因。這2株菌可能產(chǎn)其它類(lèi)型的碳青霉烯酶，例如IMP、VIM等。另外有部分菌株的抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥，但是Hodge試驗(yàn)陰性，提示可能存在產(chǎn)酶以外的耐藥機(jī)制。

PFGE可以檢測(cè)菌株之間可能存在的流行病學(xué)關(guān)聯(lián)性。本研究中，8株攜帶blaNDM-1或blaKPC-2基因的肺炎克雷伯菌，帶型各不相同，表明存在不同的來(lái)源，為散發(fā)病例，提示江西雖然檢出攜帶blaNDM-1肺炎克雷伯菌菌株，但未造成局部流行。目前全球范圍內(nèi)肺炎克雷伯菌播散最廣的克隆是ST258，而中國(guó)報(bào)道的主要流行株是ST11[6]，本研究結(jié)果顯示ST-11為產(chǎn)KPC的肺炎克雷伯菌中主要的克隆型 (4/6)，與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的一致。ST-11與 ST-258只有一個(gè)單基因位點(diǎn)變異(tonB) ，這表明他們之間密切相關(guān)。ST-11和ST-258屬于同一個(gè)克隆群，CC258。而產(chǎn)NDM-1的肺炎克雷伯菌克隆型為ST-15、 ST-395、ST-1412、ST-1031。ST-15在全球流行非常廣泛，如美國(guó)、丹麥、匈牙利、韓國(guó)、馬來(lái)西亞、新加坡、中國(guó)大陸和中國(guó)臺(tái)灣均有報(bào)道[7-9]。本研究檢出2株ST-15，產(chǎn)NDM-1和產(chǎn)KPC-2的菌株各1株。此外，ST395屬于CC258 的亞群 CC292，本研究產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌也有1株。此次還檢測(cè)到ST-1412新的ST型，已被MLST數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)收錄。

KPC型碳青霉烯酶是一種非金屬碳青霉烯酶，可水解碳青霉烯類(lèi)、青霉素類(lèi)、頭抱菌素類(lèi)和氨曲南等抗生素。由攜帶KPC基因的肺炎克雷伯菌株所致的醫(yī)院感染，由于耐藥水平極高，并可在醫(yī)院內(nèi)傳播擴(kuò)散，對(duì)臨床患者的治療造成了極大的困難，因此醫(yī)院必須加強(qiáng)監(jiān)測(cè)和控制，以減緩耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播。

攜帶NDM-1基因細(xì)菌的高耐藥性已經(jīng)成為威脅人類(lèi)公共健康的主要危險(xiǎn)和治療感染性疾病的主要挑戰(zhàn)。NDM-1金屬酶較其他碳青霉烯酶水解活性強(qiáng)，編碼該酶的基因位于質(zhì)粒等移動(dòng)遺傳因子上，使得該類(lèi)酶基因可在細(xì)菌間廣泛傳播，我們應(yīng)該系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)blaNDM-1在革蘭陰性的臨床菌株之間的傳播和擴(kuò)散。

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Resistance genes distribution and molecular typing characteristics of carbapenem-resistantKlebsiellapneumonia

YANG Meng，WANG-Peng，XU Xiao-qian，XIONG Chang-hui，LIU Xiao-qing,YUAN Hui，PAN Huan-hong

(DepartmentofCommunicableDiseaseControlandPrevention，JiangxiProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention，Nanchang330029，China)

To reveal the distribution of resistance genes and molecular typing characteristics of carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，38 clinical carbapenem-resistantK.pneumoniawere collected and analyzed by broth dilution antibiotic susceptibility test，modified Hodge test，PCR and electrophoresis，pulsed-field gel electrophoresis typing (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). Results showed that 7 (18.42%)，11 (28.95%)，and 13 (34.21%) strains showed resistance to imipenem，meropenem，ertapenem，respectively.Of which，7 strains showed resistance to all three antibiotics,eleven strains showed positive results of modified Hodge test,and among them five and four strains carried KPC-2 and NDM-1 genes respectively. These nine strains showed eight different PFGE patterns，and five MLST types.In coclusion，antibiotic resistance amongK.pneumoniaeis serious. KPC-2 and NDM-1 genes are the main cause ofK.pneumoniaeresistant to carbapenems. There was high genetic diversity exists in these strains, suggesting there might no direct relationship of these strains.

Klebsiellapneumoniae; carbapenemase; resistance gene; molecular typing Supported by grants from the Priority Project on Infectious Disease Control and Prevention (No.2013zx10004203-002-007) and the Science and Technology Plan of Jiangxi Province (No.20123154).

Yuan Hui, Email: jxcdcyuanhui@126.com

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目 (No.2013zx10004203-002-007)，江西省衛(wèi)計(jì)委科技計(jì)劃(No.20123154)聯(lián)合資助

袁 輝，Email：jxcdcyuanhui@126.com

江西省疾病預(yù)防控制中心，南昌 330029

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.001

R378.99

A

1002-2694(2016)12-1039-05

2016-06-29；

2016-10-19