徐 超，魏慶寬，李 瑾，肖 婷，尹 昆，孔祥禮，王用斌，崔 勇，孫 慧，趙桂華，朱 嵩，閆 歌，黃炳成

輸入性惡性瘧原蟲(chóng)耐藥相關(guān)基因Pfcrt和Pfmdr1單倍型及突變分析

徐 超，魏慶寬，李 瑾，肖 婷，尹 昆，孔祥禮，王用斌，崔 勇，孫 慧，趙桂華，朱 嵩，閆 歌，黃炳成

目的 了解目前山東省輸入性惡性瘧原蟲(chóng)抗藥性基因Pfcrt和Pfmdr1的單倍型，分析突變基因型及其分布情況。方法根據(jù)惡性瘧原蟲(chóng)Pfcrt和Pfmdr1基因序列設(shè)計(jì)套式PCR引物，對(duì)采自全省非洲務(wù)工返鄉(xiāng)的輸入性惡性瘧感染者血樣擴(kuò)增，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序和序列對(duì)比分析。結(jié)果68例樣本Pfcrt基因第72～76位點(diǎn)和Pfmdr1基因第86、1 042和1 246位點(diǎn)目的片段全部成功擴(kuò)增和測(cè)序。Pfcrt基因中69.12%為野生單倍型CVMNK，30.88%為突變單倍型，突變型包括CVIET、CVIDT及混合型，其中CVIET數(shù)量最多。Pfmdr1基因中69.12%為野生單倍型NND，30.88%為突變單倍型，即YND及混合基因型。6個(gè)非洲輸入來(lái)源國(guó)樣本中，除幾內(nèi)亞Pfcrt基因全部為野生型外，其它國(guó)家Pfcrt和Pfmdr1基因均有突變型存在。5例樣本Pfcrt和Pfmdr1基因共同表現(xiàn)為突變單倍型。結(jié)論山東省輸入性惡性瘧Pfcrt和Pfmdr1基因突變單倍型具有多樣化特征。Pfcrt和Pfmdr1突變型比例均低于野生型，提示目前該省流行的輸入性惡性瘧未出現(xiàn)嚴(yán)重的氯喹耐藥性。

惡性瘧原蟲(chóng)；輸入性病例；耐藥性；Pfcrt基因；Pfmdr1基因；單倍型；突變型

惡性瘧原蟲(chóng)耐藥性已經(jīng)成為全球有效控制和消除瘧疾的主要障礙。長(zhǎng)期使用單一抗瘧藥治療瘧疾會(huì)導(dǎo)致蟲(chóng)體產(chǎn)生抗性并將抗性傳播至其它瘧區(qū)種群[1]。上世紀(jì)50～60年代，氯喹、磺胺多辛、乙胺嘧啶等傳統(tǒng)抗瘧藥因具有療效好、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)先后被作為一線藥物廣泛使用。然而，這些抗瘧藥在東南亞地區(qū)開(kāi)始出現(xiàn)耐藥型蟲(chóng)種，隨后在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，導(dǎo)致許多國(guó)家放棄使用[2]。目前多國(guó)采用以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)方案替代傳統(tǒng)藥物進(jìn)行惡性瘧治療并取得了顯著療效。ACTs是目前治療惡性瘧感染最重要也是唯一沒(méi)有形成普遍耐藥的抗瘧藥物。然而，最近在東南亞大湄公河次區(qū)域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)青蒿素耐藥蟲(chóng)種，有可能面臨ACTs抗性株傳播風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，有必要監(jiān)測(cè)和評(píng)估當(dāng)前惡性瘧對(duì)傳統(tǒng)抗瘧藥的耐藥趨勢(shì)，預(yù)測(cè)傳統(tǒng)藥能再次被使用的可行性，有利于避免過(guò)度利用青蒿素造成的抗性傳播。

瘧原蟲(chóng)的某些基因可以作為分子標(biāo)記用來(lái)研究其抗藥性，監(jiān)測(cè)這些分子標(biāo)記的等位基因和單倍型能對(duì)藥物敏感性進(jìn)行有效預(yù)測(cè)，從而有助于指導(dǎo)瘧疾臨床用藥[4]。惡性瘧原蟲(chóng)第7號(hào)染色體的氯喹抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(P.falciparumchloroquine resistance transporter，Pfcrt)全長(zhǎng)大約3.1 kb，編碼位于蟲(chóng)體食物泡內(nèi)的PfCRT蛋白。大量研究證實(shí)Pfcrt基因多態(tài)性在蟲(chóng)體對(duì)氯喹耐藥過(guò)程中起重要作用，尤其第72～76位點(diǎn)單倍型是研究焦點(diǎn)[5]。惡性瘧原蟲(chóng)第5號(hào)染色體的多藥耐藥基因1(P.falciparummultidrug resistance-1，Pfmdr1)全長(zhǎng)約4.3 kb，編碼位于蟲(chóng)體食物泡膜上的P-糖蛋白同系物1(P-glycoprotein homologue 1，Pgh-1)。Pfmdr1基因多態(tài)性與惡性瘧對(duì)氯喹、甲氟喹、喹啉、本芴醇等多種藥物耐受性相關(guān)，其中第86、1 042、1 246位點(diǎn)氨基酸發(fā)生替換起到關(guān)鍵作用[6]。

山東省曾是瘧疾的重要流行區(qū)，經(jīng)幾十年積極有效的綜合防治措施，本地感染病例已降至較低水平。然而隨著出國(guó)務(wù)工人員數(shù)量和流動(dòng)性增加，該省輸入性瘧疾病例卻在逐年遞增，尤其是惡性瘧患者。本文首次對(duì)山東省境外輸入性惡性瘧Pfcrt和Pfmdr1基因單倍型進(jìn)行分析，旨在從分子水平上了解該省輸入性惡性瘧對(duì)氯喹等傳統(tǒng)抗瘧藥的耐藥情況，為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 核酸抽提試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；Taq DNA聚合酶、dNTP和PCR buffer購(gòu)自大連寶生物公司。瓊脂糖購(gòu)自西班牙Biowest公司；電泳DNA marker和核酸染料GoldView購(gòu)自北京索萊寶公司；引物由北京華大基因科技公司合成。Veriti 96-well Thermal Cycler循環(huán)擴(kuò)增儀為美國(guó)Applied Biosystems產(chǎn)品；DYCP-31DN型核酸電泳儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品；Chemidoc XRS凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-rad公司產(chǎn)品。

1.2 樣本的采集 采集2011至2013年間從非洲尼日利亞等6國(guó)打工返回山東省人員中被地市CDC診斷為瘧疾感染的上報(bào)病例血樣共68份。經(jīng)山東省瘧疾診斷參比實(shí)驗(yàn)室鏡檢復(fù)核和PCR檢測(cè)，全部病例樣本確診為單一惡性瘧感染。陰性對(duì)照樣本采集自本單位職工健康查體血樣。血樣的采集和病例信息調(diào)查經(jīng)過(guò)病人知情同意。采集的抗凝血用1.5 mL EP管分裝并編號(hào)，置于-80 ℃低溫保存。

1.3 DNA的抽提 取每份標(biāo)本0.2 mL抗凝血，按照核酸抽提試劑盒說(shuō)明流程提取基因組DNA，提取后的DNA放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 巢式PCR擴(kuò)增和測(cè)序 參考文獻(xiàn)報(bào)道，設(shè)計(jì)擴(kuò)增包含惡性瘧Pfcrt基因72～76位點(diǎn)和Pfmdr1基因第86、1 042、1 246位點(diǎn)片段的引物[7]。Pfcrt基因72～76位點(diǎn)外側(cè)引物P1：5′-CCGTTAATAATAAATACACGCAG-3′，P2：5′-CGGATGTTACAAAACTATAGTTACC-3′；內(nèi)側(cè)引物N1： 5′-TGTGCTCATGTGTTTAAACTT-3′，N2：5′-CAAAACTATAGTTACCAATTTTG-3′；產(chǎn)物片段長(zhǎng)度145 bp。Pfmdr1基因第86位外側(cè)引物P3：5′-TTAAATGTTTACCTGCACAACATAGAAAATT-3′，P4： 5′-CTCCACAATAACTTGCAACAGTTCTTA-3′；內(nèi)側(cè)引物N3：5′-TGTATGTGCTGTATTATCAGGA-3′，N4： 5′-CTCTTCTATAATGGACATGGTA-3′；產(chǎn)物片段長(zhǎng)度526 bp。Pfmdr1基因第1 042、1 246位外側(cè)引物P5：5′-AATTTGATAGAAAAAGCTATTGATTATAA-3′，P6：5′-TATTTGGTAATGATTCGATAAATTCATC-3′；內(nèi)側(cè)引物N5：5′-GAATTATTGTAAATGCAGCTTTA-3′，N6：5′-GCAGCAAACTTACTAACACG-3′；產(chǎn)物片段長(zhǎng)度799 bp。第一輪25 μL PCR反應(yīng)體系為：2.5 μL含Mg2+的10×PCR buffer，2 μL dNTP Mix(各2.5 mmol/L)，0.15 μLTaq酶(5 U/μL)，各1 μL正、反向外側(cè)引物(10 μmol/L)，2 μL DNA模板，用ddH2O補(bǔ)足剩余體系。第二輪50 μL PCR反應(yīng)體系為：5 μL含Mg2+的10×PCR buffer，4 μL dNTP Mix(各2.5 mmol/L)，0.25 μL Taq酶(5 U/μL)，各2 μL正、反向內(nèi)側(cè)引物(10 μmol/L)，3 μL第一輪產(chǎn)物模板，用ddH2O補(bǔ)足剩余體系。Pfcrt基因擴(kuò)增反應(yīng)條件：第一輪95 ℃預(yù)變性5 min，92 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，60 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，60 ℃總延伸3 min；第二輪95 ℃預(yù)變性5 min，92 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，65 ℃總延伸3 min。Pfmdr1基因擴(kuò)增反應(yīng)條件：第一輪95 ℃預(yù)變性3 min，93 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸5 min；第二輪反應(yīng)條件與第一輪相同。反應(yīng)完畢后，取5 μL第二輪產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀中觀察結(jié)果并拍照保存。第二輪PCR產(chǎn)物送往北京華大基因科技公司進(jìn)行測(cè)序。1.5 序列比對(duì)分析 從瘧疾基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://plasmodb.org/plasmo/)中下載惡性瘧原蟲(chóng)Pfcrt基因(PF3D7_0709000)和Pfmdr1基因(PF3D7_0523000)參考序列。用MEGA 6.0軟件分析比對(duì)樣本序列和參考序列，篩查堿基位點(diǎn)突變情況。利用Chromas 2.0軟件分析純合突變型和混合基因型。

2 結(jié) 果

2.1 基本信息 68例輸入性惡性瘧感染病例的瘧疾來(lái)源國(guó)包括尼日利亞21例、加納16例、蘇丹9例、剛果8例、莫桑比克7例、幾內(nèi)亞7例。所有病例中，男性67例，女性1例；年齡范圍19～57歲，主要集中于25～50歲(83.82%)；主要職業(yè)為民工、海員、服務(wù)業(yè)人員等。

2.2 巢式PCR和測(cè)序結(jié)果 經(jīng)套式PCR檢測(cè)，68例輸入性惡性瘧樣本Pfcrt和Pfmdr1基因目的片段全部擴(kuò)增成功。Pfcrt基因第72～76位點(diǎn)目的片段在145 bp處出現(xiàn)單一條帶(圖1)；Pfmdr1基因第86位點(diǎn)目的片段在526 bp處出現(xiàn)單一條帶(圖2)；Pfmdr1基因第1 042、1 246位點(diǎn)目的片段在799 bp處出現(xiàn)單一條帶(圖3)；3個(gè)片段均與預(yù)期長(zhǎng)度相符。MEGA 6.0軟件分析結(jié)果顯示所有樣本PCR產(chǎn)物與參考序列同源性均達(dá)到97%以上，證明PCR結(jié)果完全正確。

2.3Pfcrt基因第72～76位點(diǎn)單倍型 68例惡性瘧標(biāo)本中，47例Pfcrt基因第72～76位氨基酸為野生型，即C72V73M74N75K76(CVMNK)單倍型，占69.12%(圖4i)；21例為突變型，占30.88%。在所有的突變基因型種，第72和73位點(diǎn)均未發(fā)生突變，第74～76位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生突變，具體為第74位點(diǎn)堿基ATG突變?yōu)锳TT(氨基酸M74I)，第75位點(diǎn)堿基AAT突變?yōu)镚AA或GAT(氨基酸N75E/D)，第76位點(diǎn)AAA突變?yōu)锳CA(氨基酸K76T)。突變單倍型包括CVIET型15例，占71.43%(圖4ii)；CVMNK和CVIDT混合型3例，占14.29%(圖4iii)；CVMNK、CVIET、CVIDT混合型3例，占14.29%(圖4iv)。對(duì)輸入性惡性瘧6個(gè)來(lái)源國(guó)家分析結(jié)果表明：尼日利亞有突變型9例，包括7例CVIET型，1例CVMNK和CVIDT混合型，1例CVMNK、CVIET、CVIDT混合型；加納有突變型1例，為CVMNK和CVIDT混合型；莫桑比克有突變型1例，為CVMNK、CVIET、CVIDT混合型；蘇丹有突變型5例，包括4例CVIET型，1例CVMNK和CVIDT混合型；剛果有突變型5例，包括4例CVIET型，1例CVMNK、CVIET、CVIDT混合型；幾內(nèi)亞全部為CVMNK野生型。

M：DNA標(biāo)志物；A1～A8：惡性瘧樣本；A9：陰性對(duì)照；A10：空白對(duì)照M: DNA marker；A1～A8: P. falciparum samples; A9: Negative control; A10: Blank control.圖1 pfcrt基因第72～76位點(diǎn)片段的套式PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Nested PCR amplification of codon 72 to 76 in pfcrt gene

M：DNA標(biāo)志物；B1～B8：惡性瘧樣本；B9：陰性對(duì)照；B10：空白對(duì)照M: DNA marker; B1～B8: P. falciparum samples; B9: Negative control; B10: Blank control.圖2 pfmdr1基因第86位點(diǎn)片段的套式PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Nested PCR amplification of codon 86 in pfmdr1 gene

M：DNA標(biāo)志物；C1，C3～C6：惡性瘧樣本；C2：陰性對(duì)照；C7：空白對(duì)照M: DNA marker; C1, C3～C6: P. falciparum samples; C2: Negative control; C7: Blank control.圖3 pfmdr1基因第1 042、1 246位點(diǎn)片段的套式PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Nested PCR amplification of codon 1 042 and 1 246 in pfmdr1 gene

codon 72～ codon 76：第72～76位點(diǎn)密碼子 ⅰ：CVMNK單倍型(野生型) ⅱ：CVIET單倍型 ⅲ：CVMNK和CVIDT混合型 ⅳ：CVMNK、CVIET、CVIDT混合型(黑色箭頭處為雜合位點(diǎn))ⅰ: CVMNK haplotype (wild type); ⅱ: CVIET haplotype; ⅲ: CVMNK and CVIDT mixed haplotype; ⅳ: CVMNK, CVIET and CVIDT mixed haplotype. The black arrows indicate heterozygous loci圖4 惡性瘧樣本pfcrt基因第72～76位點(diǎn)單倍型Fig.4 Codon 72 to 76 haplotypes in pfcrt gene of P. falciparum samples

2.4Pfmdr1基因第86、1 042和1 246位點(diǎn)單倍型 68例樣本Pfmdr1基因第86位點(diǎn)氨基酸中，47例為野生型N，占69.12%；21例為突變型，堿基AAT突變?yōu)門(mén)AT(氨基酸N86Y)，占30.88%。在突變型中，14例為純合突變(氨基酸Y)，7例為混合基因型(氨基酸N/Y)。所有樣本Pfmdr1基因第1 042和1 246位點(diǎn)氨基酸均分別呈現(xiàn)野生型N和D。在86、1 042、1 246三個(gè)位點(diǎn)單倍型中，NND占69.12%(圖5i)，YND占20.59%(圖5ii)，NND和YND混合型占10.29%(圖5iii)。對(duì)輸入性惡性瘧6個(gè)非洲來(lái)源國(guó)的突變型分析結(jié)果表明：尼日利亞有突變型4例，包括3例YND型，1例NND和YND混合型；加納有突變型5例，包括1例YND型，4例NND和YND混合型；莫桑比克有突變型2例，包括1例YND型，1例NND和YND混合型；蘇丹有突變型5例，包括4例YND型，1例NND和YND混合型；剛果有突變型2例，均為YND型；幾內(nèi)亞有突變型3例，均為YND型。

第86、1 042和1 246位點(diǎn)密碼子 i：NND單倍型(野生型) ii：YND單倍型 iii：NND和YND混合型(黑色箭頭處為雜合位點(diǎn))codon 86、codon 1 042、codon 1 246：i: NND haplotype (wild type); ii: YND haplotype；iii: NND and YND mixed haplotype.The black arrows indicate heterozygous loci.圖5 惡性瘧樣本Pfmdr1基因第86、1 042、1 246位點(diǎn)單倍型Fig.5 Codon 86, 1 042 and 1 246 haplotypes in Pfmdr1 gene of P. falciparum samples

2.5Pfcrt和Pfmdr1突變相關(guān)性 31例樣本Pfcrt和Pfmdr1基因單倍型共同表現(xiàn)為野生型，即CVMNK + NND。5例樣本Pfcrt和Pfmdr1基因單倍型共同表現(xiàn)為突變型，其中3例為CVIET+ YND純合型，1例為CVIET+YND/NND混合型，1例為CVMNK/CVIET/CVIDT+YND混合型。16例樣本表現(xiàn)為Pfcrt突變型和Pfmdr1野生型，包括11例為CVIET+ NND純合型，3例為CVMNK/CVIDT+ NND混合型，2例為CVMNK/CVIET/CVIDT+ NND混合型。16例樣本表現(xiàn)為Pfmdr1突變型和Pfcrt野生型，包括10例為CVMNK+YND純合型，6例為CVMNK+YND/NND混合型。

3 討 論

近年來(lái)，中國(guó)與國(guó)際間貿(mào)易、勞務(wù)輸出等日趨頻繁，境外輸入性瘧疾明顯增多[8]。2011-2013年，山東省共報(bào)告瘧疾病例340例，境外輸入性病例占94.41%。其中，2013年由非洲輸入的惡性瘧病例在當(dāng)年疫情中所占比例高達(dá)84.73%[9]。由于耐藥型惡性瘧在全球廣泛分布，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重危害，因此對(duì)輸入性惡性瘧實(shí)施耐藥性分子監(jiān)測(cè)具有重要意義。

惡性瘧原蟲(chóng)pfcrt基因第72～76位突變與其耐藥性緊密相關(guān)，其中K76T被認(rèn)為是最關(guān)鍵的突變位點(diǎn)[10]。研究表明，pfcrt基因第72～76位單倍型主要存在2種突變型，即起源于泰國(guó)-柬埔寨邊境地區(qū)的CVIET型和起源于哥倫比亞-委內(nèi)瑞拉邊境地區(qū)的SVMNT型[11]。在東南亞地區(qū)，泰國(guó)主要存在CVIET型；老撾同時(shí)存在CVIET和SVMNT 2種突變型；在柬埔寨還發(fā)現(xiàn)3種CVIET的衍生型，即CVIDT、CVTNT和CVMNT[12-14]。由于非洲惡性瘧種群曾對(duì)氯喹普遍耐藥，絕大多數(shù)非洲國(guó)家普遍存在CVIET型，而且是部分地區(qū)唯一高頻突變的單倍型。此外，坦桑尼亞和安哥拉存在一定頻率的SVMNT型；剛果和莫桑比克存在CVIDT和SVIET型；中非共和國(guó)存在少數(shù)的CVINT、CVIEK、SVIEK突變型等[15-17]。張國(guó)慶等[18]研究顯示，在我國(guó)瘧疾流行較為嚴(yán)重的云南和海南省，惡性瘧種群pfcrt基因突變率超過(guò)70%。云南主要突變型為CVIET，同時(shí)還存在SVMNT和CVIKT型；海南僅發(fā)現(xiàn)CVIET型。本文中山東省輸入性惡性瘧Pfcrt基因第72～76位突變型所占比例為30.88%，明顯低于云南和海南省本地惡性瘧種群。另外，CVIET型(含混合型)在所有突變型中的比例高達(dá)85%以上，并且在尼日利亞、蘇丹、剛果樣本中均占據(jù)主導(dǎo)地位，與前期研究報(bào)道結(jié)論相符。本文還發(fā)現(xiàn)了一定比例的CVIDT型，在前期報(bào)道的云南本地惡性瘧中未發(fā)現(xiàn)該突變型。值得注意的是，除幾內(nèi)亞外，其余5個(gè)非洲來(lái)源國(guó)均發(fā)現(xiàn)包含CVIDT的混合基因型，在一定程度上反應(yīng)出CVIDT散播和分布的廣泛性。

惡性瘧原蟲(chóng)pfmdr1基因N86Y突變與其對(duì)氯喹耐藥有重要相關(guān)性，被認(rèn)為是僅次于Pfcrt基因K76T的重要抗性突變位點(diǎn)[19]。另外，有報(bào)道稱惡性瘧pfmdr1基因N1042D和D1246Y突變能降低蟲(chóng)體對(duì)氯喹耐藥性程度[20]。不同地理位置惡性瘧種群pfmdr1多態(tài)性分布有一定差別，比如N86Y主要廣泛分布于亞洲和非洲；N1042D和D1246Y在南美洲出現(xiàn)頻率較高。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究表明，盡管我國(guó)云南本地惡性瘧種群K76T突變率非常高，但N86Y、N1042D和D1246Y的突變率相對(duì)較低[21-22]。本文中由非洲輸入的惡性瘧pfmdr1基因N86Y突變型(30.88%)低于野生型，與pfcrt突變型數(shù)量少于野生型情況一致，提示近期山東省輸入性惡性瘧氯喹抗性基因尚未出現(xiàn)高頻突變情況。尼日利亞等6個(gè)來(lái)源國(guó)樣本均存在N86Y突變型，暗示N86Y在非洲國(guó)家可能廣泛分布。另外，本文未發(fā)現(xiàn)N1042D和D1246Y突變，這進(jìn)一步證明非洲惡性瘧種群發(fā)生這兩種突變的概率較低。前期有研究指出，惡性瘧pfcrt和pfmdr1基因之間具有連鎖不平衡特征，2個(gè)基因發(fā)生聯(lián)合作用可能造成更嚴(yán)重耐藥性[23]。本文中有5例樣本pfcrt和pfmdr1基因同為突變型，表明2個(gè)基因有聯(lián)合突變的特性，但數(shù)量少于單一基因的突變型。

在氯喹、磺胺多辛、乙胺嘧啶等傳統(tǒng)抗瘧藥相繼出現(xiàn)廣泛耐藥性后，WHO于2006年推薦引入ACTs作為治療惡性瘧的一線藥物[24]。盡管ACTs有效遏制了全球瘧疾疫情的嚴(yán)峻形勢(shì)，但近期出現(xiàn)的青蒿素耐藥型蟲(chóng)種對(duì)ACTs成功應(yīng)用造成潛在威脅[25]。為此，評(píng)估重新使用氯喹等傳統(tǒng)抗瘧藥的可行性，既有利于降低用藥成本，更有助于避免出現(xiàn)因過(guò)度使用ACTs導(dǎo)致其耐藥性廣泛散播的危險(xiǎn)局面。有研究表明，長(zhǎng)期停止使用氯喹治療后，惡性瘧對(duì)藥物敏感性會(huì)增強(qiáng)。非洲馬拉維停止應(yīng)用氯喹10年后，在8年時(shí)間里本地惡性瘧pfcrt基因K76T突變型比例從85%下降至13%[26]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山東省自非洲輸入惡性瘧pfcrt和pfmdr1突變型比例均少于野生型，在一定程度上提示了近期該省輸入性惡性瘧未出現(xiàn)嚴(yán)重的氯喹耐藥，并存在對(duì)藥物敏感性增強(qiáng)的可能。通過(guò)未來(lái)持續(xù)的抗性分子監(jiān)測(cè)，為評(píng)估重新使用氯喹等傳統(tǒng)抗瘧藥的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有利于指導(dǎo)臨床合理用藥。

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Haplotype and mutation analysis of drug resistancePfcrtandPfmdr1 gene of importedPlasmodiumfalciparum

XU Chao, WEI Qing-kuan, LI Jin, XIAO Ting, YIN Kun, KONG Xiang-li, WANG Yong-bin,CUI Yong, SUN Hui, ZHAO Gui-hua, ZHU Song, YAN Ge, HUANG Bing-cheng

(ShandongAcademyofMedicalSciences,ShandongInstituteofParasiticDiseases,ShandongProvincialReferenceLaboratoryforMalariaDiagnosis,Jining272033,China)

In order to understand the drug resistancePfcrtandPfmdr1 gene haplotypes ofPlasmodiumfalciparumimportedcurrentlyin Shandong Province, we analyzed the mutant genotypes and their distribution situation. The blood samples were collected from malaria cases infected withP.falciparumderiving from Africa during 2011 to 2013 in Shandong Province.P.falciparumgenomic DNA was extracted and primers were designed according to thePfcrtandPfmdr1 gene sequences. Nested PCR amplification and sequencing were performed, and sequence alignment was carried out by using bioinformatics software. The results showed that all of 68P.falciparumsamples imported were amplified and sequencing successfully at codon 72-76 inPfcrtgene and codon 86, 1 042 and 1 246 inPfmdr1 gene. And 69.12% of the samples were wild type CVMNK inPfcrtgene and 30.88% were mutation types, including CVIET, CVIDTand mixed types, of which the CVIEThaplotype was the most. The 69.12% of the samples were wild type NND inPfmdr1 gene and 30.88% were mutation types including YND and mixed types. Among the six African source countries' samples, mutant gene types existed in all samples in bothPfcrtandPfmdr1 gene exceptPfcrtgenotype from Guinea were all wild type. Five samples had mutation types in bothpfcrtandpfmdr1 gene together. What could be drawn conclusion from the results was that mutantPfcrtandPfmdr1 haplotypes expressed diversification in the importedP.falciparumcases in Shandong Province, and the proportion of mutant genotypes were less than wild genotypes, which suggested that it was not appeared serious chloroquine-resistant of the importedP.falciparumprevalence in Shandong Province currently.

Plasmodiumfalciparum; imported malaria cases; drug resistance;Pfcrtgene;Pfmdr1 gene; haplotype; mutant genotypes

Huang Bing-cheng, Email: hbc863@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.003

黃炳成，Email: hbc863@hotmail.com

山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東省寄生蟲(chóng)病防治研究所，山東省瘧疾診斷參比實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)寧 272033

R382.31

A

1002-2694(2016)12-1051-07

2016-05-25；

2016-09-28

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2016WS0394)，山東省自然科學(xué)基金(No. ZR2014YL036，2012ZRC03040)，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新工程，全球基金中國(guó)瘧疾項(xiàng)目(No. 201201055)，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院課題計(jì)劃(No. 2014-59)聯(lián)合資助

Supported by the Projects of Medical and Health Technology Development Program in Shandong Province(2016WS0394)，Natural Science Fund of Shandong Province (Nos. ZR2014YL036, 2012ZRC03040),The Innovation Project of Shandong Academy of Medical Sciences,China Malaria Project of the Global Fund to Fight AIDS, Tuberculosis, and Malaria (No. 201201055), and the Project of Shandong Academy of Medical Sciences (No.2014-59)