高智玲，紀(jì) 雪，郭學(xué)軍，陳 萍，劉彥晶，劉 軍，祝令偉，周 偉，馮書(shū)章，孫 洋

嗜水氣單胞菌雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

高智玲1,2，紀(jì) 雪1，郭學(xué)軍1，陳 萍2，劉彥晶3，劉 軍1，祝令偉1，周 偉1，馮書(shū)章1，孫 洋1

目的 建立快速準(zhǔn)確檢測(cè)致病性嗜水氣單胞菌的雙重?zé)晒舛縋CR方法。方法針對(duì)嗜水氣單胞菌的16S rDNA和氣溶素基因aerA的序列設(shè)計(jì)特異性引物及TaqMan探針，優(yōu)化雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件，并結(jié)合常規(guī)PCR方法及分離培養(yǎng)鑒定對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)和對(duì)比驗(yàn)證。結(jié)果熒光定量PCR反應(yīng)體系對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的敏感性為10拷貝/反應(yīng)，是常規(guī)PCR檢測(cè)方法的100倍；該方法檢測(cè)12種其他種屬細(xì)菌時(shí)未出現(xiàn)假陽(yáng)性；對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果其敏感性同樣高于普通PCR，定量檢測(cè)目的基因的拷貝數(shù)與樣品中目的菌的分離率成正比。結(jié)論本方法敏感性高，特異性好，可用于致病性嗜水氣單胞菌感染的診斷、疾病防控及流行病學(xué)研究。

嗜水氣單胞菌；熒光定量PCR；檢測(cè)；應(yīng)用

Supported by the National Science and Technology Major Project of China (No. 2013ZX10004-217-002) and the Scientific and Technological Development Project of Jilin Province (Nos. 20140101032JC and 20150101110 JC) Corresponding author: Sun Yang, Email: sunyang10@hotmail.com

嗜水氣單胞菌是一種革蘭氏陰性桿菌，可從水、魚(yú)、無(wú)脊椎動(dòng)物、土壤及食物中分離出來(lái)，往往與其他疾病關(guān)聯(lián)而發(fā)生繼發(fā)性感染[1]。近年來(lái)，由于其對(duì)人類(lèi)及水生動(dòng)物的潛在致病性而備受世界關(guān)注。對(duì)于人類(lèi)，嗜水氣單胞菌可以引發(fā)多種疾病，從輕微的胃腸、傷口感染到危及生命的敗血癥及壞死性筋膜炎[2]，對(duì)于魚(yú)類(lèi)，可引發(fā)出血病、紅鰭病及敗血癥等疾病。目前，嗜水氣單胞菌所引起的疾病已成為威脅我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病，給我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確的診斷方法顯得尤為重要。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是近年發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，與普通PCR相比，具有自動(dòng)化程度高、快速、敏感、特異性好的特點(diǎn)[4]，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，例如細(xì)胞因子[5]、基因表達(dá)[6]、病毒篩選[7]和細(xì)菌病原體檢測(cè)[8]等。本研究旨在建立基于TaqMan探針的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，可同時(shí)完成嗜水氣單胞菌的快速檢測(cè)及毒力確認(rèn)，為預(yù)防和監(jiān)測(cè)致病性嗜水氣單胞菌病的流行提供有效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 菌株及樣品 嗜水氣單胞菌質(zhì)控菌株ATCC7966、大腸桿菌DH5α及特異性檢測(cè)所用菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。魚(yú)類(lèi)樣品采集于長(zhǎng)春周邊養(yǎng)魚(yú)場(chǎng)及水產(chǎn)市場(chǎng)。

1.2 主要試劑與儀器 PCR擴(kuò)增預(yù)混液Premix PrimeSTAR HS、T4 DNA連接酶、DL2000 DNA Marker及PMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；熒光定量PCR試劑盒為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀(ABI StepOne Plus)，核酸蛋白檢測(cè)儀(Quawell Q5000)。

1.3 引物及探針的設(shè)計(jì)及合成 參考文獻(xiàn)[9]，針對(duì)嗜水氣單胞菌屬特異性16S rDNA基因片段，合成了引物和TaqMan探針，報(bào)告基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為T(mén)AMRA。同時(shí)用Premier 5.0生物軟件針對(duì)嗜水氣單胞菌氣溶素基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，報(bào)告基團(tuán)為VIC，淬滅基團(tuán)為BHQ1。引物、探針由invitrogen公司合成(表1)。

表1 引物及探針序列

Tab.1 Sequences of primers and probes

Primer/probeSequences(5′-3′)Productsize(bp)AH16SrDNA?FGGCCTTGCGCGATTGGATAT103AH16SrDNA?RGTGGCTGATCATCCTCTCAGAAH16SrDNA?PFAM?CAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGG?TAMRAAHaerA?FGCTCCAAGATCCCGGTGAAG146AHaerA?RGCGGTTGTCCGGATGGGTATAHaerA?PVIC?CGAGCTCTACAAGGCTGACATCTCCT?BHQ1

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板的制備 以ATCC7966基因組DNA為模板，擴(kuò)增嗜水氣單胞菌16S rDNA基因特異性片段和氣溶素基因片段，凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增的目的片段，與pMD18-T載體連接，分別轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，作為熒光定量PCR模板。

1.5 雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃，1s；60 ℃，20s，40個(gè)循環(huán)。設(shè)立陰性對(duì)照(去離子水)。分別以0.3 μL、0.5 μL、0.7 μL的引物及探針進(jìn)行反應(yīng)(各條引物、探針使用液均為10 μmol/L)，以確定最佳引物濃度及探針濃度。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 重組質(zhì)粒以核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定核酸濃度，根據(jù)重組質(zhì)粒的堿基數(shù)計(jì)算分子質(zhì)量，換算單位體積拷貝數(shù)。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋(109拷貝/μL～100拷貝/μL)，分別取2 μL作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，進(jìn)而建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.7 特異性試驗(yàn) 以不同種屬(嗜水氣單胞菌ATCC7966、殺鮭氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、腸球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、豬霍亂弧菌，肺炎克雷伯菌、不動(dòng)桿菌、鏈球菌、及嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌)細(xì)菌基因組DNA為模板，進(jìn)行雙重嗜水氣單胞菌TaqMan熒光定量PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，鑒定其特異性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 以3個(gè)不同濃度的2種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(107copies/μL、105copies/μL及103copies/μL)為模板，進(jìn)行熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)。

1.9 敏感性試驗(yàn) 將109～100 copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行雙重TaqMan熒光定量PCR，并同時(shí)進(jìn)行普通PCR，比較2種方法的檢出限，確定敏感性指標(biāo)。

1.10 實(shí)際樣品的檢測(cè) 73份淡水魚(yú)鰓拭子及腸道內(nèi)容物樣品懸液以細(xì)菌基因組提取試劑盒抽提DNA制備模板，雙重TaqMan熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以普通PCR方法擴(kuò)增。參考文獻(xiàn)[10]方法，73份樣品進(jìn)行致病性嗜水氣單胞菌的分離培養(yǎng)及鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR最佳反應(yīng)體系的確定 經(jīng)過(guò)對(duì)退火溫度、模板、引物和探針的濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定雙重TaqMan 熒光定量PCR 20 μL反應(yīng)體系的最佳組成為：Premix Ex Taq 10 μL，ROX 2 μL，引物、探針各0.5 μL，ddH2O 3 μL，模板2 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 以?xún)?yōu)化的熒光定量PCR方法對(duì)梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增，建立熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖1)，16S rDNA基因及Aero基因擴(kuò)增方程式分別為y=-3.393x+38.879和y=-3.19x+38.567，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.998及1。

圖1 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curves of fluorescence quantitative PCR

2.3 特異性檢測(cè) 沙門(mén)氏菌、腸球菌和大腸桿菌等其他種屬細(xì)菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，僅嗜水氣單胞菌呈現(xiàn)良好的擴(kuò)增曲線(xiàn)，證明了該雙重?zé)晒舛縋CR方法的特異性。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 3個(gè)梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)擴(kuò)增4次，雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增曲線(xiàn)重疊性好，Ct值誤差不到1個(gè)循環(huán)，變異系數(shù)(CV)在0.18%～0.55%之間，具有較高的可重復(fù)性，保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性(表2)。

表2 熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of reproducibility test

Copies/μLTargetGenesCTValues1234xsCV(%)10716s12．4112．2612．2712．3312．320．060．49A12．8012．7212．8712．9112．830．070．5510516s19．8919．8120．0219．7619．870．100．50A20．5520．5020．3820．3720．450．080．3910316s27．7227．7028．0027．9127．830．130．47A28．3528．3728．2628．2728．310．050．18

2.5 敏感性試驗(yàn) 結(jié)果表明雙重?zé)晒舛縋CR對(duì)2種目的基因的最低檢測(cè)限均為10拷貝(圖2)，而常規(guī)PCR的最低檢測(cè)限為103拷貝(圖3)。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果 熒光定量PCR檢測(cè)嗜水氣單胞菌陽(yáng)性率為97.26%(71/73)，氣溶素基因陽(yáng)性率為79.45%(58/73)；普通PCR檢測(cè)嗜水氣單胞菌陽(yáng)性率為72.60%(53/73)，氣溶素基因陽(yáng)性率為20.55%(15/73)。其中熒光定量PCR檢測(cè)陰性樣品普通PCR方法檢測(cè)也為陰性，普通PCR檢測(cè)陽(yáng)性樣品熒光定量PCR檢測(cè)同樣為陽(yáng)性。以致病性嗜水氣單胞菌選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)并進(jìn)行生化鑒定，73份樣品有15份分離到致病性嗜水氣單胞菌，均為熒光定量PCR檢測(cè)陽(yáng)性樣品，陰性樣品未分離到致病性嗜水氣單胞菌。

1: 109copies；2：108copies；3：107copies，以此類(lèi)推1: 109copies；2: 108copies；3: 107copies, and so on.圖2 雙重?zé)晒舛縋CR的敏感性檢測(cè)Fig.2 Sensitivity analysis of fluorescence quantitative PCR

1～10孔的模板濃度依次為109～100 copies；M：100bp Marker；N：陰性對(duì)照1-10: 109-100 copies; M: 100bp Marker; N: Negative control.圖3 雙重常規(guī)PCR的敏感性檢測(cè)Fig.3 Sensitivity analysis of ordinary PCR

3 討 論

水產(chǎn)品的安全問(wèn)題越來(lái)越受到全社會(huì)的關(guān)注，嗜水氣單胞菌作為水產(chǎn)品中的常見(jiàn)菌，在水生環(huán)境中廣泛分布，根據(jù)其毒力差異，可分為致病性菌株和非致病性菌株。致病性菌株可感染魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳類(lèi)等動(dòng)物，輕可引起皮膚感染及腹瀉，重者引起敗血癥，是一種典型的人獸共患病病原菌。目前，由于致病性嗜水氣單胞菌引起水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的頻發(fā)及人感染病例日漸增多，該菌的檢測(cè)及防治變得愈加重要。

熒光定量PCR技術(shù)兼?zhèn)浜怂岣咝U(kuò)增和精確定量等優(yōu)點(diǎn)，且假陽(yáng)性率低、重復(fù)性好，與普通PCR相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。本研究使用Premix Ex TaqTM預(yù)混酶替代了前期實(shí)驗(yàn)中的Ex Taq Hot Star、10×buffer和dNTP等試劑，使繁瑣的加樣過(guò)程變得簡(jiǎn)單、快速，并且降低了操作過(guò)程中污染的機(jī)率。建立的的熒光定量PCR方法對(duì)沙門(mén)氏菌、腸球菌、大腸桿菌等12種其他屬的菌株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，證明該方法對(duì)致病性嗜水氣單胞菌具有很好的特異性，且敏感性高，最低檢測(cè)限達(dá)到普通PCR方法的100倍。

該方法能夠?qū)?shí)際樣品的核酸提取物進(jìn)行直接檢測(cè)，使得檢測(cè)結(jié)果更加快速、準(zhǔn)確，同時(shí)能判定樣品中目的菌的數(shù)量。在樣品中目的菌較少的情況下，常規(guī)的分離培養(yǎng)難以獲得陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)際樣品的檢測(cè)及分離鑒定結(jié)果表明，所有分離株均來(lái)源于熒光定量PCR陽(yáng)性樣品，且aerA基因拷貝數(shù)高的樣品目的菌的分離率較高，進(jìn)一步驗(yàn)證了本方法的實(shí)用性。本研究建立的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法可用于致病性嗜水氣單胞菌感染的診斷、疾病防控及流行病學(xué)研究。

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Establishment and application of a duplex real-time fluorescence quantitative PCR assay for detection ofAeromonashydrophila

GAO Zhi-ling1,2, JI Xue1, GUO Xue-jun1, CHEN Ping2, LIU Yan-jing3, LIU Jun1,ZHU Ling-wei1, ZHOU Wei1, FENG Shu-zhang1, SUN Yang1

(1.InstituteofMilitaryVeterinary,AMMS,theKeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl,Changchun130122,China;2.CollegeofFoodScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;3.TheAffiliatedHospital,ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130021,China)

To establish a method of duplex real-time fluorescence quantitative PCR assay for detectingAeromonashydrophilaand pathogenicA.hydrophilasimultaneously, two sets of primers and TaqMan probes were designed based on the sequences of the 16S rDNA and aerolysin (aerA) gene. Then the method was constructed and optimized. The specificity, sensitivity and reproducibility of the method were tested, and the clinic samples were detected. Results showed the sensitivity of the duplex real-time TaqMan PCR assay for testing of recombinant plasmids was 10 copies per reaction, which was 100 times higher than ordinary PCR method. No specific amplification was presented when twelve species of other bacteria genera were tested. The detection results of clinic samples showed that the sensitivity was also higher than that of ordinary PCR. And the gene copy numbers of quantitative detection were proportional to the rate separation. The method was highly sensitive, specific and practical, and could be used for the diagnosis, disease prevention and control and epidemiologic study of pathogenicA.hydrophila.

Aeromonashydrophila; fluorescent quantitative PCR; detection; application

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.016

國(guó)家科技部傳染病重大專(zhuān)項(xiàng)(No.2013ZX10004-217-002)和吉林省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.20140101032JC，20150101110JC)聯(lián)合資助

孫 洋，Email: sunyang10@hotmail.com

1. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130122； 2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130118； 3. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長(zhǎng)春 130021

S852.61；R378

B

1002-2694(2016)12-1126-05

2016-05-01；

2016-07-22