郭曉強

深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518035

CRISPR-Cas9技術(shù)發(fā)展史：25年的科學歷程

郭曉強?

深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518035

CRISPR-Cas是一種重要的原核生物獲得性免疫系統(tǒng)。CRISPR序列可轉(zhuǎn)錄并加工為非編碼RNA——crRNA，而Cas利用其DNA核酸外切酶完成RNA介導的靶DNA剪切，從而抵御噬菌體和質(zhì)粒等DNA的入侵。在這一系統(tǒng)基礎(chǔ)上改進并發(fā)明目前生命科學領(lǐng)域廣泛應用的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)。通過對CRISPR序列發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)命名、功能預測、實驗證實、機制研究和系統(tǒng)改進等的描述，以期能對CRISPR-Cas9技術(shù)的誕生過程有一個全面的了解。

獲得性免疫系統(tǒng)；原核生物；基因編輯；CRISPR-Cas9

1953年，DNA雙螺旋模型的提出確立了DNA在分子生物學乃至整個生命科學的“中心”地位。由于DNA是遺傳信息載體，因此對DNA進行精確操作(DNA編輯)進而調(diào)控生物學性狀的研究，其重要性不言而喻。三位在DNA編輯技術(shù)——基因敲除方面做出奠定性貢獻的科學家分享了2007年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。然而，傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)盡管在闡明某些基因的功能方面發(fā)揮了重要作用，但操作過程較為繁瑣，周期長，費時費力，亟需進一步完善。隨后出現(xiàn)一系列DNA編輯技術(shù)，如ZFN(zinc fnger nuclease)和TALEN(transcription activator-like (TAL) effector nuclease)等，尤其是2012年出現(xiàn)的CRISPR-Cas9技術(shù)更是以操作簡便、快速、高效而迅速成為實驗室的必備技術(shù)之一，對推動生命科學的發(fā)展具有重要意義。此外，CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明也是一個具有傳奇色彩的歷程。

1 CRISPR序列的發(fā)現(xiàn)

這項技術(shù)發(fā)明在一定程度上可追溯到20世紀50年代開始的微生物遺傳學、生物化學和基因組學，三位大師級科學家萊德伯格(Joshua Lederberg)、科恩伯格(Arthur Kornberg)和桑格(Frederick Sanger)為此做出了奠基性貢獻。萊德伯格奠定細菌遺傳學基礎(chǔ)，從而使簡單的細菌成為分子生物學模式生物[1]；科恩伯格則奠定細菌分子生物學酶學基礎(chǔ)，開創(chuàng)酶學研究科學范式[2]；桑格則于1977年發(fā)明基因測序方法[3]，從而使基因測序成為常規(guī)研究內(nèi)容。CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)則開始于細菌測序。

1987年，日本微生物學家石野良純(Yoshizumi Ishino)在但中田(Atsuo Nakata)實驗室對大腸桿菌的堿性磷酸酶同工酶(alkaline phosphatase isozyme, iap)進行測序，為更好地理解基因表達調(diào)節(jié)的機制，在對編碼區(qū)進行檢測的同時順便對基因上游和下游序列完成了測序。在常規(guī)報道iap基因編碼序列的同時，他們意外地發(fā)現(xiàn)終止密碼子后的非編碼區(qū)存在一些異常重復序列[4]。之所以異常源于兩個原因：一方面原核生物如細菌的DNA利用率較高，因此它的重復序列較少(真核生物存在大量重復序列)；另一方面?zhèn)鹘y(tǒng)的重復序列常為串聯(lián)重復，而這次發(fā)現(xiàn)卻是“重復-居間序列(spacer)-重復”這一排列特征(圖1)。論文最后一句話是：“到目前為止，在其他原核生物未發(fā)現(xiàn)同源序列，并且這些序列的生物學意義尚不清晰。”[4]對這段重復序列的討論說明他們也部分意識到這一現(xiàn)象，但就當時有限的知識而言，不可能對其有進一步理解。然而這一發(fā)現(xiàn)存在一個缺陷，就是尚不知這種現(xiàn)象是否具有普適性。如果僅僅是大腸桿菌iap基因特有，則重要性就大打折扣，因此科學界首先需要解決的是這種“詭異”的序列是否普遍存在。然而，后續(xù)研究進入一個緩慢發(fā)展期，很少有人對此現(xiàn)象進行研究(石野良純等也轉(zhuǎn)向翻譯機制的研究)。

圖1 CRISPR序列的發(fā)現(xiàn)

20世紀80年代末，西班牙阿利坎特大學(University of Alicante)的博士生莫伊察(Francisco Mojica)在一種嗜鹽古菌(Haloferax mediterranei)中也發(fā)現(xiàn)一類“重復-居間序列-重復”特征序列[5]。莫伊察對這種現(xiàn)象非常感興趣，因此進一步在其他微生物中尋找類似結(jié)構(gòu)，基因組測序技術(shù)的突飛猛進為這項研究提供了極大便利。莫伊察通過對多種已完成基因組測序的原核生物進行序列比對分析發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象非常普遍，到2000年，已在20多種不同微生物中發(fā)現(xiàn)這種特異序列。為便于進一步研究，將其命名為短規(guī)律間隔重復(short regularly spaced repeat, SRSR)[6]。

2002年，荷蘭烏得勒支大學(Utrecht University)的詹森(Ruud Jansen)進一步發(fā)現(xiàn)多個微生物中存在這種特殊結(jié)構(gòu)，并且不同物種的重復序列堿基數(shù)存在巨大差異，從21到37不等，如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)為21，而化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)為37。此外，他還發(fā)現(xiàn)這種序列只在原核生物存在，而病毒和真核生物均缺乏。為更好地規(guī)范相關(guān)研究，詹森在和莫伊察溝通后，將這種特殊結(jié)構(gòu)重新定義為成簇規(guī)律性間隔短回文重復(clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)[7]。詹森還發(fā)現(xiàn)CRISPR序列附近還存在多個編碼序列，推測它們參與了CRISPR的生理功能，因此將其命名為CRISPR相關(guān)基因(CRISPR-associated gene, Cas)(這種推測主要基于原核生物基因組多以操縱子形式存在，即功能相關(guān)基因串聯(lián)分布在一起)。至此，在原核生物(包括細菌和古菌)中發(fā)現(xiàn)一個由特殊DNA序列(CRISPR)和多個編碼基因(Cas)構(gòu)成的獨特系統(tǒng)，當然這個系統(tǒng)的作用尚一無所知。隨后研究人員提出多種假說來解釋這一系統(tǒng)，但大多基于一種想當然的推測，并未有太多的邏輯推理和數(shù)據(jù)支持。

2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物學作用

2005年，CRISPR研究出現(xiàn)一個根本轉(zhuǎn)折。來自西班牙和法國的三個研究小組幾乎同時報道了一個重大發(fā)現(xiàn)：通過對CRISPR居間序列的系統(tǒng)分析，意外發(fā)現(xiàn)它們并非原核生物自身序列，而是來自病毒或質(zhì)粒[8-10]。這一發(fā)現(xiàn)提出了一個重要問題：那就是原核生物獲取這些序列的目的何在？

美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)進化生物學家?guī)鞂?Eugene Koonin)很早就對CRISPR-Cas系統(tǒng)擁有濃厚興趣，但苦于無法理解它的生物學意義。當獲悉CRISPR的居間序列來自病毒DNA后，庫寧立刻意識到細菌可利用CRISPR作為一種防御病毒侵染的重要武器。在自然界，細菌時刻面臨噬菌體(細菌病毒)等的攻擊，但它們絕非被動受害者，而是在進化過程中形成多種防御措施，著名的如修飾-限制系統(tǒng)(對自身DNA堿基進行甲基化修飾，再利用限制性內(nèi)切酶對入侵DNA進行剪切從而實現(xiàn)防御目的)。

早在2002年就發(fā)現(xiàn)原核生物中不編碼蛋白質(zhì)的CRISPR序列也可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA[5]，而1998年在真核生物中發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象，即非編碼的小RNA可影響mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。基于這些事實，庫寧提出解釋CRISPR-Cas作為獲得性免疫系統(tǒng)的作用機制：細菌通過特定方式獲取噬菌體DNA片段并將其整合到自身CRISPR重復序列之間形成居間序列，從而對外源入侵病毒產(chǎn)生“記憶”；這些序列可被轉(zhuǎn)錄出非編碼RNA；當噬菌體再次感染時，這些RNA可依靠居間序列信息識別并破壞入侵者(圖2)[11]。

圖2 CRISPR干擾假說的提出

在庫寧提出這一假說時，科學界對CRISPR和Cas蛋白的作用還知之甚少，但這一思想激發(fā)了法國微生物學家巴蘭古(Rodolphe Barrangou)的動力，他決定驗證這一假說的可靠性。巴蘭古之所以會驗證這一假說，動力來源不僅僅在于假說的迷人魅力，更重要是出于工作需要。巴蘭古在著名的酸奶公司丹尼斯克(Danisco)工作，時常面臨的一大問題是產(chǎn)酸奶的嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)有時會爆發(fā)噬菌體感染而導致死亡，最終影響酸奶生產(chǎn)。庫寧假說意味著可利用CRISPR-Cas系統(tǒng)來實現(xiàn)增強細菌抵抗噬菌體的目的。

巴蘭古在霍瓦特(Philippe Horvath)等協(xié)助下首先利用兩株噬菌體(P1和P2)侵染鏈球菌，結(jié)果殺死大部分細菌，但仍有部分“幸運”細菌保留下來，且當它們被進一步培養(yǎng)時獲得噬菌體抗性。對這些抗性細菌的基因組分析表明，其CRISPR居間序列中出現(xiàn)噬菌體序列，并且與P1序列一致則對P1產(chǎn)生抗性，若與P2序列一致則對P2產(chǎn)生抗性，而如果為兩株噬菌體公用序列，則對兩株噬菌體均產(chǎn)生抗性(圖3)。當將抗性細菌去除噬菌體序列則導致抗性消失，相反直接將噬菌體序列整合到未感染過噬菌體的細菌CRISPR中，細菌對首次噬菌體感染產(chǎn)生抗性[12]。這是首次在實驗上證實CRISPR-Cas是一種細菌獲得性免疫系統(tǒng)。

3 CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機制

巴蘭古等的發(fā)現(xiàn)既是CRISPR-Cas系統(tǒng)研究的一個里程碑，也是一個轉(zhuǎn)折點和分水嶺。許多團隊也開始意識到這一系統(tǒng)的重要性，從而促進這一領(lǐng)域的快速進展。

圖3 CRISPR與細菌獲得性免疫

2008年，荷蘭瓦赫寧恩大學的范德歐斯特(John van der Oost)等通過研究大腸桿菌的CRISPR-Cas系統(tǒng)(Ⅰ型)發(fā)現(xiàn)CRISPR序列可轉(zhuǎn)錄并加工出非編碼RNA——crRNA(CRISPR RNA)，而crRNA介導了隨后的干擾機制[13]。同一年，西北大學的松特海默爾(Erik Sontheimer)等則在表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的CRISPR-Cas系統(tǒng)(Ⅲ型)中發(fā)現(xiàn)，crRNA發(fā)揮干擾作用的靶點是DNA，而不像真核生物作用靶點為RNA[14]。這一發(fā)現(xiàn)不僅糾正了庫寧假說，更重要的是為DNA編輯埋下伏筆。

2010年，對CRISPR-Cas系統(tǒng)的基本生物學作用和分子機制已有較清晰的理解，并將其應用于減少細菌噬菌體感染和細菌進化分析等。然而，CRISPR-Cas系統(tǒng)的應用范圍極為有限，主要原因在于當時已研究的兩種類型(Ⅰ型和Ⅲ型)都過于復雜，因此，尋找更為簡單的體系成為一個重要方向。

卡彭蒂耶(Emmanuelle Marie Charpentier)是一位法國微生物學家，最初愛好為鋼琴和舞蹈，但對醫(yī)學的熱愛使她最終投身于生命科學的研究。在巴黎皮埃爾和瑪麗居里大學完成本科學業(yè)后，卡彭蒂耶來到附近的巴斯德研究所攻讀博士學位。在這里她對基礎(chǔ)科學產(chǎn)生了濃厚興趣，特別是對細菌耐藥機制尤為熱愛。博士畢業(yè)后，卡彭蒂耶進入美國洛克菲勒大學開展博士后研究，重點關(guān)注肺炎鏈球菌的耐藥性。后來她又在紐約大學醫(yī)學院開展哺乳動物基因調(diào)控研究。在此過程中她一方面發(fā)現(xiàn)哺乳動物過于復雜，因此決定重回細菌研究；另一方面也意識到當時過于繁瑣的哺乳動物基因編輯技術(shù)亟待改進。

2002年，卡彭蒂耶回到歐洲，首先在奧地利維也納大學獲得一份職位，并擁有獨立的小實驗室。盡管主要依賴短期基金項目支持，但仍孜孜不倦開展科學實驗。隨著哺乳動物RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，卡彭蒂耶也開始關(guān)注細菌中非編碼RNA的作用。在德國馬普感染生物學研究所分子生物學家沃格爾(J?rg Vogel)協(xié)助下，卡彭蒂耶結(jié)合生物信息學方法在化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)發(fā)現(xiàn)多種非編碼RNA，特別是一類在CRISPR序列附近的新型小RNA，將其命名為反式激活CRISPR來源RNA(trans-activating CRISPR-derived RNA, tracrRNA)，并推測它們與CRISPR系統(tǒng)有密切關(guān)系[15]。

由于當時已鑒定crRNA參與基因組DNA剪切，因此卡彭蒂耶推測tracrRNA可能通過與crRNA相互作用來引導酶發(fā)揮功能?？ㄅ淼僖倪@一假說非常激進，與傳統(tǒng)觀念相差甚遠。一般認為特定序列DNA的識別由蛋白質(zhì)如限制性內(nèi)切酶、轉(zhuǎn)錄因子(ZFN和TELEN技術(shù)原理就是依據(jù)轉(zhuǎn)錄因子特異識別DNA序列實現(xiàn)剪切)等完成，尚未發(fā)現(xiàn)RNA介導?？ㄅ淼僖@一“離經(jīng)叛道”的想法嚇壞了很多人，大部分研究生都不愿接手這一項目，最終德爾切瓦(Elitza Deltcheva)主動要求通過實驗來驗證卡彭蒂耶的假說。

2009年6月，卡彭蒂耶離開奧地利，加入新建的瑞典于默奧大學(Ume? University)微生物研究中心，但仍在維也納大學保留實驗室。德爾切瓦的實驗進展比較順利，不久就證實了卡彭蒂耶當初的推測。為避免文章被拒或延遲發(fā)表，他們花費一年多時間重復和完善實驗以保證每一個結(jié)果的可靠性。2011年，卡彭蒂耶的發(fā)現(xiàn)在《自然》雜志發(fā)表，首次闡明tracrRNA在crRNA加工中的作用(圖4)：tracrRNA與轉(zhuǎn)錄出的CRISPR重復序列互補結(jié)合，這種結(jié)合在Cas9因子存在前提下被RNA酶Ⅲ識別和剪切，最終產(chǎn)生成熟crRNA[16]。這一發(fā)現(xiàn)具有十分重要的意義，相對于其他CRISPR系統(tǒng)往往需要一種crRNA但同時需多種Cas9蛋白參與，這一系統(tǒng)(Ⅱ型)則需兩種RNA(crRNA和tracrRNA)，雖增加RNA數(shù)量，卻只需一種Cas9蛋白完成。這個系統(tǒng)如此簡單，卡彭蒂耶意識到可將其改造為一種強有力的遺傳操作工具用作基因編輯。

2011年，在波多黎各首都圣胡安(San Juan)舉辦的美國微生物會議上，卡彭蒂耶與美國加州大學伯克利分校結(jié)構(gòu)生物學家杜德娜(Jennifer Anne Doudna)相遇。通過交流她們都對tracrRNA這一發(fā)現(xiàn)很感興趣，隨后決定合作開展進一步工作。

圖4 tracrRNA生物作用的發(fā)現(xiàn)

4 CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)

杜德娜有著輝煌的學術(shù)背景，可稱得上一位名副其實的“學術(shù)二代”。她從小就對科學發(fā)現(xiàn)充滿巨大興趣，1985年從波莫納大學獲得化學學士后進入哈佛大學跟隨紹斯塔克(Jack Szostak，2009年由于端粒發(fā)現(xiàn)分享諾貝爾生理學或醫(yī)學獎)進行博士學習。20世紀80年代，核酶(具有催化功能的RNA)的發(fā)現(xiàn)使科學界開始重新審視RNA的生物學功能，并越來越意識到RNA遠比當初克里克中心法則中“遺傳信息傳遞的中介”(三種RNA負責將DNA遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì))這一作用重要的多。因此，杜德娜開始關(guān)注RNA廣泛的生物學作用，并在博士期間制備成功具有催化自我復制能力的RNA。

杜德娜在RNA方面的重要工作引起科羅拉多大學切赫(Tom Cech，1989年由于核酶發(fā)現(xiàn)而分享諾貝爾化學獎)的注意，因此邀請杜德娜加入實驗室開展博士后研究——借助結(jié)構(gòu)生物學工具研究核酶的作用機制。1991年，杜德娜成功制備出第一個核酶(四膜蟲I類核酶)晶體，并采用X射線衍射技術(shù)獲得這種RNA的三維結(jié)構(gòu)，對理解核酶機制具有重要幫助。1994年，杜德娜加入耶魯大學，繼續(xù)與切赫合作開展核酶研究，同時她也逐漸成長為一位在RNA研究領(lǐng)域冉冉升起的科學新星。2002年，杜德娜從耶魯大學轉(zhuǎn)到加州大學伯克利分校，更為先進的技術(shù)平臺使研究更加得心應手，她開始研究病毒RNA的作用。1998年，RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)進一步使科學家意識到RNA還是一類重要的基因表達調(diào)節(jié)分子，而杜德娜也將研究領(lǐng)域拓展到RNA干擾，研究參與這一過程的RNA酶如Argonaute和Dicer等的作用機制。杜德娜的學術(shù)貢獻獲得了科學界的高度認可，2004年當選為美國科學院院士[17]。

2005年，杜德娜也獲悉原核生物CRISPRCas系統(tǒng)，并對此產(chǎn)生濃厚興趣。由于當時推測采用RNA干擾方式殺死病毒，但詳細機制可能不同于真核細胞。2007年，巴蘭古等發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas系統(tǒng)的細菌免疫作用進一步堅定了杜德娜的決心，打算借助結(jié)構(gòu)生物學方法探索這一新型“RNA干擾”中酶的作用機制。為此她專門成立一個細菌CRISPR-Cas系統(tǒng)的青年研究小組，主要包括博士后韋登赫福特(Blake Wiedenheft)和伊內(nèi)克(Martin Jinek)等。該小組的優(yōu)勢在于擁有堅實的分子生物學、結(jié)構(gòu)生物學和生物化學等基礎(chǔ)，可將多種Cas蛋白完成純化、結(jié)晶和結(jié)構(gòu)測定，同時借助其他手段闡述酶的作用機制。他們先后確定Cas蛋白擁有DNA酶活性、RNA序列依賴的DNA核酸內(nèi)切酶活性、crRNA加工活性[18]等。通過這些研究，杜德娜小組確定CRISPR-Cas是一種可對特定DNA序列進行定向剪切的細菌防御系統(tǒng)，但鑒于已研究的系統(tǒng)過于復雜，因此限制了這種系統(tǒng)的其他應用。

2011年之所以非常愉快地達成合作，原因在于杜德娜對這種簡單的Ⅱ型系統(tǒng)特別是tracrRNA很著迷，而卡彭蒂耶則對Cas9作用機制更感興趣。一位RNA專家(卡彭蒂耶)與一位酶學專家(杜德娜)的鼎力合作實現(xiàn)了最大程度的優(yōu)勢互補，而CRISPR-Cas9技術(shù)簡單而言就是RNA(sgRNA)和酶(Cas9)。為盡快解決科學難題，合作溝通由杜德娜博士后伊內(nèi)克和卡彭蒂耶博士后黑林斯基(Krzysztof Chylinski)具體負責，巧合的是他們都來自波蘭，因此交流非常順暢。他們合作純化了Cas9蛋白，并證明Cas9具有依賴兩種RNA的DNA核酸內(nèi)切酶活性。Cas9擁有兩個內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，可分別對兩條鏈進行切割。這個發(fā)現(xiàn)一方面拓展了卡彭蒂耶最初的發(fā)現(xiàn)，使tracrRNA擁有了雙重作用(crRNA加工和靶DNA切割)；另一方面還發(fā)現(xiàn)tracrRNA可與crRNA形成特殊二級結(jié)構(gòu)來指導DNA剪切。這一現(xiàn)象立刻激發(fā)了研究激情，他們在保留二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，將tracrRNA與crRNA兩種RNA連接成一種RNA，稱為單鏈引導RNA(single guide RNA，sgRNA)，體外實驗表明sgRNA也可指導Cas9蛋白完成對靶DNA的雙鏈剪切(圖5)。這一發(fā)現(xiàn)最終于2012年6月發(fā)表，它預示著可利用CRISPRCas9系統(tǒng)實現(xiàn)對目標DNA剪切，從而達到基因編輯的目的[19]。

卡彭蒂耶和杜德娜的發(fā)現(xiàn)既是細菌獲得性免疫系統(tǒng)領(lǐng)域研究的里程碑，又是基因編輯領(lǐng)域的里程碑。CRISPR-Cas9 DNA精確剪切系統(tǒng)迅速成為多個實驗室追逐的研究對象。

圖5 CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明

5 CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)展與應用

早在2011年，立陶宛維爾紐斯大學的斯克尼斯(Virginijus Siksnys)小組首次將嗜熱鏈球菌的CRISPR-Cas9系統(tǒng)導入大腸桿菌，結(jié)果可使大腸桿菌獲得噬菌體抵抗能力[20]。這一發(fā)現(xiàn)意味著CRISPR-Cas9系統(tǒng)可在不同物種內(nèi)發(fā)揮相同功能，為將來應用于哺乳動物基因組編輯奠定堅實基礎(chǔ)。此外，斯克尼斯小組也于2012年下半年實現(xiàn)體外DNA編輯[5]。2013年初，哈佛大學張鋒和丘齊(George Church)則進一步在哺乳動物細胞內(nèi)完成特定基因的編輯[21-22]，特別是可利用多個sgRNA而實現(xiàn)多基因同時敲除，從而極大提升編輯效率和適用范圍。2013年，先后有多家實驗室成功利用CRISPR-Cas9完成基因編輯，引起了一場持續(xù)至今的研究熱潮[23-24]。

CRISPR-Cas9技術(shù)已在全世界上千家實驗室得到廣泛應用。最主要的應用領(lǐng)域是基因組編輯，已在人細胞系和多種模式生物如酵母、果蠅、線蟲、斑馬魚、小鼠、大鼠、豬和猴等完成感興趣基因的編輯，并在此基礎(chǔ)上建立多種疾病模型，為闡明疾病發(fā)生的分子機制和藥物篩選提供重要平臺。天然Cas9酶還被進行人工改造，一方面可減少基因編輯過程的脫靶效應，另一方面還被應用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控(激活或抑制)等研究。隨著CRISPR-Cas9技術(shù)的完善和安全性的改進，也可能在將來疾病治療方面發(fā)揮重要作用[24-25]。

CRISPR-Cas9技術(shù)本身不僅取得巨大成功，還推動基因編輯新工具的層出不窮，出現(xiàn)了一系列改進版和更新版。Cpf1與Cas9類似，也是一種RNA依賴的DNA核酸內(nèi)切酶，但在剪切靶DNA時只需crRNA參與，而無需tracrRNA輔助[26]，用做基因編輯時可大大縮短引導RNA長度，因此CRISPR-Cpf1系統(tǒng)將更為簡單。2009年，庫寧等進一步提出假說，原核生物除CRISPR-Cas系統(tǒng)外，Argonaute蛋白(Ago)系統(tǒng)(不同于CRISPRCas系統(tǒng)只存在于原核生物，Argonaute蛋白從原核生物到真核生物都普遍存在，并且在真核生物RNA干擾過程中的作用機制已得到全面研究)也可發(fā)揮免疫作用以抵御質(zhì)粒等外源DNA入侵，暗示著也可被改造為基因編輯工具。2014年，范德歐斯特等首次利用古菌——噬熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的Ago蛋白(TtAgo)完成單鏈DNA(single stranded DNA，ssDNA)指導的靶DNA剪切[27]，然而這種蛋白只能在65℃以上才發(fā)揮活性，從而限制了細胞及機體內(nèi)的應用。這三種系統(tǒng)采用類似策略完成對目的基因的編輯(圖6)，隨著技術(shù)的完善，將在基礎(chǔ)研究和實際應用方面有著廣闊的發(fā)展空間。

圖6 三種編輯方法的比較

6 重大意義

CRISPR-Cas9技術(shù)的廣泛應用證明了這項發(fā)明的重要意義，這一技術(shù)也于2013和2015年兩次入選美國《科學》評選的十大科學突破，許多為此技術(shù)發(fā)明做出卓越貢獻的科學家特別是卡彭蒂耶和杜德娜等已獲得多項科學大獎[28]?？茖W界普遍認為，這項發(fā)明將來獲得諾貝爾獎是毋容置疑的[15]。從獲獎類別上講，類似DNA重組、聚合酶鏈式反應等技術(shù)授予化學獎的可能性更高。但無論如何，這一突破對生命科學、醫(yī)學等發(fā)展具有極大的推動作用。

CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明歷程為我們提供了三個方面的思考。

首先，重視微生物研究。這是科恩伯格在酶學研究“十誡”中的名言[29]。微生物基礎(chǔ)生命現(xiàn)象的生物化學機制研究為生物技術(shù)提供了思想源泉和操作工具。聚合酶鏈式反應(PCR)和桑格法測序來源于對微生物復制研究基礎(chǔ)上DNA聚合酶純化和機制研究，基因工程的突破來自微生物限制-修飾系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶，而CRISPR-Cas9技術(shù)則是對細菌獲得性免疫系統(tǒng)的深入研究。因此，一系列重大生物技術(shù)的突破可稱得上是微生物學與生物化學的完美結(jié)合。

其次，重視基礎(chǔ)科學研究。這是科學發(fā)展的一般規(guī)律。科學與技術(shù)發(fā)展往往相輔相成，互相促進。科學理論突破為技術(shù)發(fā)明提供了思想源泉，而技術(shù)革新則為科學進步提供實驗保證。科學的真諦原本就是為了探索自然界奧秘，在認識世界的基礎(chǔ)上最終達到改造世界的目的，從而為人類生產(chǎn)能力提高和生活水平改善提供重要幫助。CRISPR-Cas9技術(shù)就是通過對細菌奇異序列的深入探索發(fā)現(xiàn)了新型的細菌獲得性免疫系統(tǒng)，而進一步的機制研究觸發(fā)了改造該系統(tǒng)應用于基因編輯的靈感。

最后，重視科學發(fā)展規(guī)律?？茖W研究一個重要特點就在于“前人植樹，后人乘涼”。從最初不經(jīng)意的發(fā)現(xiàn)(1987年)，到沉默十幾年的過渡(1987年到2005年)，再到一朝突破(2007年和2011年)引發(fā)科學快速發(fā)展，到最終的技術(shù)發(fā)明(2012年)，前后跨越25年(圖7)。CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明是一種水到渠成的結(jié)果，而非刻意為之可達到的效果?？茖W研究充滿了巨大的不確定性，因此應更多地鼓勵和支持“看不到明顯效益”的基礎(chǔ)研究。目前科研領(lǐng)域過多關(guān)注研究的應用價值和市場潛力，然而欲速則不達，這種短視的眼光束縛了科學更好的發(fā)展。

圖7 CRISPR-Cas9技術(shù)發(fā)展的重大事件時間表

(2016年5月24日收稿)■

[1] 郭曉強. 細菌遺傳學之父——喬舒亞·萊德伯格[J]. 自然雜志, 2012, 34(2): 119-124.

[2] 郭曉強. DNA酶學之父——科恩伯格[J]. 自然雜志, 2009, 31(4): 245-248.

[3] 郭曉強. 基因組學之父: 桑格[J]. 科學, 2014, 66(5): 59-62.

[4] SHINO Y, SHINAGAWA H, MAKINO K, et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identifcation of the gene product [J]. J Bacteriol, 1987, 169(12): 5429-5433.

[5] LANDER E S. The heroes of CRISPR [J]. Cell, 2016, 164(1/2): 18-28.

[6] MOJICA F J, DíEZ-VILLASE?OR C, SORIA E, et al. Biological signifcance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria [J]. Mol Microbiol, 2000, 36(1): 244-246.

[7] JANSEN R, EMBDEN J D, GAASTRA W, et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes [J]. Mol Microbiol, 2002, 43(6): 1565-1575.

[8] MOJICA F J, DíEZ-VILLASE?OR C, GARCíA-MARTíNEZ J, et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements [J]. J Mol Evol, 2005, 60(2): 174-182.

[9] POURCEL C, SALVIGNOL G, VERGNAUD G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies [J]. Microbiology, 2005, 151(3): 653-663.

[10] BOLOTIN A, QUINQUIS B, SOROKIN A, et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin [J]. Microbiology, 2005, 151(8): 2551-2561.

[11] MAKAROVA K S, GRISHIN N V, SHABALINA S A, et al. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action [J]. Biol Direct, 2006, 1: 7.

[12] BARRANGOU R, FREMAUX C, DEVEAU H, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes [J]. Science, 2007, 315(5819): 1709-1712.

[13] BROUNS S J, JORE M M, LUNDGREN M, et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes [J]. Science, 2008, 321(5891): 960-964.

[14] MARRAFFINI L A, SONTHEIMER E J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA [J]. Science, 2008, 322(5909): 1843-1845.

[15] ABBOTT A. The quiet revolutionary: How the co-discovery of CRISPR explosively changed Emmanuelle Charpentier’s life [J]. Nature, 2016, 532(7600): 432-434.

[16] DELTCHEVA E, CHYLINSKI K, SHARMA C M, et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III [J]. Nature, 2011, 471(7340): 602-607.

[17] MARINO M. Biography of Jennifer A. Doudna [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(49): 16987-16989.

[18] HAURWITZ R E, JINEK M, WIEDENHEFT B, et al. Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease [J]. Science, 2010, 329(5997): 1355-1358.

[19] JINEK M, CHYLINSKI K, FONFARA I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity [J]. Science, 2012, 337(6096): 816-821.

[20] SAPRANAUSKAS R, GASIUNAS G, FREMAUX C, et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli [J]. Nucleic Acids Res, 2011, 39(21): 9275-9282.

[21] CONG L, RAN F A, COX D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems [J]. Science, 2013, 339(6121): 819-823.

[22] MALI P, YANG L, ESVELT K M, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9 [J]. Science, 2013, 339(6121): 823-826.

[23] PENNISI E. The CRISPR craze [J]. Science, 2013, 341(6148): 833-836.

[24] DOUDNA J A, CHARPENTIER E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9 [J]. Science, 2014, 346(6213): 1258096.

[25] HSU P D, LANDER E S, ZHANG F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering [J]. Cell, 2014, 157(6): 1262-1278. [26] ZETSCHE B, GOOTENBERG J S, ABUDAYYEH O O, et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system [J]. Cell, 2015, 163(3): 759-771.

[27] SWARTS D C, JORE M M, WESTRA E R, et al. DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute [J]. Nature, 2014, 507(7491): 258-261.

[28] 郭曉強, 黃衛(wèi)人, 蔡志明. 一種全新DNA編輯工具——CRISPR-Cas9技術(shù)[J]. 科學通報, 2015, 60(30): 2833-2835.

[29] KORNBERG A. Ten commandments: lessons from the enzymology of DNA replication [J]. J Bacteriol, 2000, 182(13): 3613-3618.

(編輯：沈美芳)

The invention of CRISPR-Cas9 technology: 25-years scientific journey

GUO Xiaoqiang

Shenzhen Second People’s Hospital, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China

CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeat-CRISPR-associated) is an important acquired immune system for prokaryotes. CRISPR sequences can be transcribed and processed into non-coding RNA, crRNA (CRISPRRNA). These Cas proteins can complete the RNA mediated target DNA cut using their DNA exonuclease, which is important for bacteriophage and plasmid DNA invader defense in prokaryotes. The CRISPR-Cas9 gene editing was invented on the system, which is widely used in life science. In the article, the following knowledge was described including discovery of CRISPR sequence, nomenclature of CRISPR, prediction of biological role, confrmation of experiment, research on mechanism and improvement of system. It is important for the comprehensive understanding of CRISPR-Cas9 technology invention.

acquired immune system, prokaryote, gene editing, CRISPR-Cas9

10.3969/j.issn.0253-9608.2016.04.008

?通信作者，E-mail: xiaoqiangguo123@163.com