李瑞端，張建軍

1.吉林化工學(xué)院，吉林 吉林 132022；

2.北京化工大學(xué)，北京 100029

聚乳酸-羥基乙酸聚合物載入羥基喜樹堿載藥納米粒子的制備及表征

李瑞端1，張建軍2

1.吉林化工學(xué)院，吉林 吉林 132022；

2.北京化工大學(xué)，北京 100029

以抗癌藥物羥基喜樹堿作為模型藥物，可降解材料聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）為藥物負(fù)載體，采用溶劑-抗溶劑沉淀法制備聚乳酸-羥基乙酸/羥基喜樹堿的載藥納米微球，考察不同溶劑-反溶劑體系對載藥包封效果的影響。結(jié)果表明，以丙酮-水為溶劑體系制備的載藥微球性能較好，形貌外觀呈圓球形，球表面圓潤光滑，粒度均一，分散效果良好，平均粒徑為160 nm，載藥微球包封率隨著載藥量的增加而減小，實測載藥量為7.83%的PLGA載藥微球，其載藥包封率為87.68%，在28 d后溶出累計量約50%，可見以聚乳酸-羥基乙酸為載體制備的羥基喜樹堿劑型，緩釋作用良好。

羥基喜樹堿 聚乳酸-羥基乙酸 納米粒子

羥基喜樹堿（簡稱HCPT）具有廣譜抗腫瘤療效，對頭頸部腫瘤、腹水型肝癌、胃癌及白血病等多種腫瘤具有治療效果[1-5]。但由于HCPT本身是非水溶性藥物，其在水中溶解度極低，且其自身的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)是pH值依賴性的，在生理pH值條件下，其內(nèi)酯結(jié)構(gòu)自動開環(huán)形成羧酸鹽形式，該鹽極其不穩(wěn)定，見光易分解，分解會降低其療效，還會增加不良反應(yīng)[6,7]。目前臨床使用的HCPT制劑多為HCPT羧酸鹽形式，其結(jié)構(gòu)開環(huán)后，其抗腫瘤活性降低90%，限制了其實際臨床應(yīng)用[8,9]。為了改善難溶藥物的水溶性和抗腫瘤活性，許多研究將HCPT制備成不同緩釋劑型，如脂質(zhì)體、納米微乳、納米微球和納米粒等[10,11]。其中，常用的是以二甲基亞砜作溶劑，用復(fù)乳法和溶劑蒸發(fā)法[12,13]制備HCPT緩釋微球。而復(fù)乳法制備的緩釋微球顆粒較大，溶劑蒸發(fā)法溫度變化會影響溶解度的變化，因此這兩種方法均不太適合聚合物載藥粒子的制備。溶劑-反溶劑重結(jié)晶法制備微球，是將藥物溶解在溶解度大的溶劑中，以難以溶解該藥物的溶劑作反溶劑，將溶液與反溶劑迅速混合，迅速形成的濃度差使得藥物顆粒瞬間析出，該方法工藝簡單，且較好分離。目前，聚乳酸-羥基乙酸聚合物（PLGA）是制備緩釋微球和組織工程的常用材料，已經(jīng)通過美國食品和藥物管理局（FDA）認(rèn)證，可作為藥用輔料收錄入美國藥典，PLGA本身生物相容性良好，并且可自然生物降解，最終產(chǎn)物為CO2和H2O，隨代謝排出體外，對機(jī)體無毒無副作用[14,15]。因此，本工作選擇具有良好生物相容性和可生物降解性的PLGA為HCPT載體，以溶劑-反溶劑重結(jié)晶法制備載藥微球。

1 實驗部分

1.1 納米微球的制備

在室溫（25 ℃）下，稱量10 mg PLGA（數(shù)均分子量為50 000），乳酸與羥基乙醇酸（物質(zhì)的量之比為75∶25）和一定量的HCPT溶于1 mL有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑分別是四氫呋喃（THF），丙酮，N,N-二甲基甲酰胺（DMF），二甲基亞砜（DMSO）和二氯甲烷，PLGA/HCPT溶液作為溶劑，溶有一定量泊洛沙姆的水溶液作為反溶劑，通過溶劑-抗溶劑沉淀法，制備PLGA/HCPT載藥粒子，通過真空冷凍干燥PLGA/HCPT懸浮液收集納米粒子。

1.2 表征與分析

1.2.1 掃描電鏡分析

掃描電鏡分析（SEM）在日本電子公司JSM670掃描電鏡上進(jìn)行，將合適濃度的分散液滴在載玻片上，用濾紙吸干多余溶劑，通過導(dǎo)電膠將玻璃片置于銅臺上，自然晾干后，噴金，在掃描電鏡上觀察顆粒形貌和大小。

1.2.2 粒度分析

粒度分析（DLS）在英國Malvern公司ZetaSizer-3000HS型激光粒度電位儀上進(jìn)行，選用氬離子激光源，定義散射角90°，測試溫度25 ℃，分散劑選擇水相。

1.2.3 載藥微球包封率、載藥量和溶出累計量的測定

采用紫外-可見分光光度計（UV）測定HCPT在檢測波長265 nm處的吸光度，利用其標(biāo)準(zhǔn)曲線計算包封率、載藥量及溶出累計量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：以乙醇為溶劑，HCPT溶液在濃度為0.03～25.00 μg/mL時，其吸光度（A）與濃度（C）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線為A= 0.066 58C-0.007 17。

載藥量和包封率按以下公式計算：

式中：L為載藥量；E為包封率；M0為載藥微球質(zhì)量；M1為微球中藥物的質(zhì)量；M2為投入總藥物的質(zhì)量。

溶出累計量的測定：以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）為緩沖液（pH值為7.4）作為體外溶出介質(zhì)，以5 mg載HCPT/PLGA微球凍干樣品，分散在2 mL PBS的透析袋中，放進(jìn)恒溫37 ℃，恒速攪拌的50 mL PBS中，按一定時間間隔取出一定量的PBS，紫外-可見分光光度計檢測其在265 nm處的吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算藥物釋放量，同時要及時補(bǔ)充等溫等量的新鮮介質(zhì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溶劑對顆粒和形貌的影響

溶劑-反溶劑重結(jié)晶法主要原理是以溶質(zhì)在液相中飽和溶解度的變化作為傳質(zhì)推動力來促使溶質(zhì)析出，分別以丙酮，THF，DMF，DMSO和二氯甲烷為溶劑，水為反溶劑，PLGA濃度為10 mg/mL，考察不同溶劑-反溶劑體系成球性的情況，結(jié)果表明，分別以DMF，DMSO和二氯甲烷做為溶劑制備納米微粒時，成球性較差，都是成片、粘連的，以THF和丙酮作溶劑的體系制備出的HCPT/PLGA微粒綜合效果好，其形貌如圖1所示。由圖可看出，丙酮和THF作溶劑制備的微球粒度較均一并且較小。綜合考慮THF和丙酮作為溶劑對于顆粒的形貌和穩(wěn)定性的影響，選擇丙酮為溶劑，去離子水為反溶劑，制備PLGA納米微球。

2.2 PLGA濃度對微球的影響

PLGA濃度對微球粒徑和包封率起主要影響因素，考察PLGA濃度對微球粒徑和形貌的影響，結(jié)果見圖2。由圖可知，隨著PLGA濃度的增加微球粒徑尺度明顯增大，這主要是由于PLGA的濃度增大后，PLGA初乳的黏度也隨之增加，在相同攪拌轉(zhuǎn)速下乳液越黏稠越不易分散，因而形成微球的粒徑尺度有所增大，但是相差不是很大。綜合考慮，后續(xù)實驗選擇PLGA的濃度為10 mg/mL。

圖1 不同溶劑-反溶劑體系制備的PLGA納米顆粒SEM照片F(xiàn)ig.1 SEM images of PLGA nanoparticles by different solvent-anti-solvent systems a-THF; b-acetone

圖2 不同濃度的PLGA顆粒的SEM照片F(xiàn)ig.2 SEM images of PLGA nanoparticles at different concentrations

2.3 HCPT/PLGA載藥微球的形貌分析

采用溶劑-反溶劑法制備的負(fù)載HCPT的PLGA微球，冷凍干燥后為微黃色絮狀粉末，圖3a和b分別為SEM和DLS的測試結(jié)果。由圖可知，微球呈圓球形，外表面光滑，分散性良好，平均粒徑大小為160 nm。

圖3 HCPT/PLGA納米顆粒的掃描電鏡照片和粒度分布Fig.3 SEM image and DLS distribution graph of HCPT/PLGA nanoparticles

2.4 載藥量對HCPT/PLGA載藥粒子包封率的影響

分別考察不同的理論載藥量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.76%，9.09%，16.67%和23.08%）對實際包封效果的影響，對應(yīng)的包封率分別為99.36%，87.68%，78.82%和65.54%，即隨著載藥量的增加，HCPT/PLGA載藥粒子的包封率減小。綜合考慮載藥量和包封率的關(guān)系，選擇理論載藥量9.09%較合適，經(jīng)測量其實際載藥量為7.83%。

2.5 體外溶出實驗

負(fù)載藥物的HCPT/PLGA粒子體外釋放累計溶出量測定結(jié)果見圖4。由圖可知，前5 d的溶出速率較快，有突釋現(xiàn)象，之后溶出速率逐漸放緩，至28 d累計溶出量約為50%。這是由于在溶出實驗的初期，載藥納米粒子表面吸附的藥物以及包載不牢的藥物分子快速釋放，導(dǎo)致溶出初期藥物釋放較快。據(jù)前期研究[15]可知，由納米化HCPT粒子和原料藥HCPT的體外溶出曲線可以看出，納米化HCPT溶出速率遠(yuǎn)大于未納米化原料藥的溶出速率，納米化HCPT在30 min的溶出累計量已近于100%，而原料藥HCPT在30 min的溶出量僅為11.6%。因此說明本實驗制備的載藥微球具有一定的緩釋作用。

圖4 溶出曲線Fig.4 Release graph

3 結(jié) 論

聚乳酸-羥基乙酸濃度為10 mg/mL，采用溶劑-抗溶劑技術(shù)制備聚乳酸-羥基乙酸包載羥基喜樹堿載藥微球，其表面光滑，粒度均一，HCPT/PLGA粒子包封率隨著載藥量的增加而減小，其在28 d溶出累計量約50%，具有一定的緩釋作用。

[1] Guo S, Zheng J, Dong J, et al. Iron/dextran sulfate multilayered microcapsules for controlled release of 10-hydroxycamptothecin[J]. Int J Biol Macromol, 2011, 49(3): 409-415.

[2] Lee Y, Cui F D, Cun D M, et al. Preparation, characterization and biodistribution of the lactone form of 10-hydroxycamptothecin (HCPT)-loaded bovine serum albumin (BSA) nanoparticles[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2007, 340(3): 163-172.

[3] Markman M. Topotecan as second-line therapy for ovarian cancer: dosage versus toxicity[J]. Oncologist, 2005, 10(9): 695-697.

[4] Pu X H, Sun J, Wang Y, et al. Development of a chemically stable 10-hydroxycamptothecin nanosuspension[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2009, 379(1), 167-173.

[5] 龔明濤, 張鈞壽, 戴曉鳴. 羥基喜樹堿納米乳在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報, 2004, 35(4): 324-327. Gong Mingtao, Zhang Junsho, Dai Xiaoming. Pharmacokinetics of hydroxycamptothecin microemulsions in rats[J]. Journal of China Pharmaceutical University, 2004, 35(4): 324-327.

[6] Hong M H, Zhu S J, Jiang Y Y, et al. Efficient tumor targeting of hydroxycamptothecin loaded PEGylated niosomes modified with transferring[J]. Journal of Controlled Release, 2009, 133(2): 96-102.

[7] 董 雋, 郭建新, 平其能. 羥基喜樹堿脂肪乳的制備及其在人血漿中穩(wěn)定性考察[J]. 中國新藥雜志, 2005, 14(6): 720-723. Dong Jun, Guo Jianxin, Ping Qineng. Preparation and stability of hydroxycamptothecin lipid emulsion[J]. Chinese Journal of New Drugs, 2005, 14(6): 720-723.

[8] Wani M C, Ronman P E, Lindley J T, et al. Plant antitumor agents 18: synthesis and biological activity of camptothecin analogues[J].Journal of Medicinal Chemistry, 1980, 23: 554-560.

[9] Zhang L Y, Yang M, Wang Q, et al. 10-hydroxycamptothecin loaded nanoparticles: preparation and antitumor activity in mice[J]. J Control Rel, 2007, 119: 153-162.

[10] 黃 毅, 劉松青, 林 彩, 等. 羥基喜樹堿自制脂質(zhì)體注射液與市售注射液家兔體內(nèi)藥代動力學(xué)行為的比較[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2004, 26(6): 517-519. Huang Yi, Liu Songqing, Lin Cai, et al. Comparison of the pharmacokinetic characteristics of hydroxycamptothecin liposomes injection with market hydroxycamptothecin injection in rabbits after intravenous administration[J]. Journal of Third Military Medical University, 2004, 26(6): 517-519.

[11] 陸 彬. 納米粒給藥系統(tǒng)[J]. 中國藥師, 2003, 6(7): 399-401. Lu B. Nanoparticles drug delivery system[J]. China Pharmacist, 2003, 6(7): 399-401.

[12] Shenderova A, Burke T G, Schwendeman S P. Stabilization of 10-hydroxycamptothecin in poly(lactide-co-glycolide) microsphere delivery vehicles[J]. Pharm Res, 1997, 14: 1406-1414.

[13] Shenderova A, Burke T G, Schwendeman S P. The acidic microclimate in poly(lactide-co-glycolide) microspheres stabilizes camptothecins[J]. Pharm Res, 1999, 16: 241-248.

[14] Toti U S, Guru B R, Hali M, et al. Targeted delivery of antibiotics to intracellular chlamydial infections using PLGA nanoparticles[J]. Biomaterials, 2011, 32(27): 6606-6613.

[15] 李瑞端, 張建軍, 陳建峰, 等. 10-羥基喜樹堿納米微球的制備及表征[J]. 北京化工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）, 2014, 5: 83-88. Li Ruiduan, Zhang Jianjun, Chen Jianfeng, et al. Preparation and characterization of 10-hydroxycamptothecin nanoparticles[J]. Journal of Beijing University of Chemical Technology (Natural Science), 2014, 5: 83-88.

Preparation and Characterization of Poly(lactic-co-glycolic acid) Nanoparticles Containing Hydroxycamptothecin

Li Ruiduan1, Zhang Jianjun2
1. Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China; 2. Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China

The poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nano-microspheres containing hydroxycamptothecin (HCPT) was prepared using solvent and anti-solvent precipitation method with HCPT as the model drug, degradable PLGA as the carrier. The effects of different solvents and anti-solvents system on the drug loading capacity and entrapment efficiency were investigated. The results showed that the microspheres prepared with acetone-water as solvent system had better performance, spherical appearance, round and smooth surface, uniform particle size (the average particle size of 160 nm) and good dispersion. The entrapment efficiency of drug-loaded microspheres decreased with the increase of drug loading. It was found that the entrapment efficiency was 87.68% in the HCPT/PLGA microspheres when drug loading was 7.83%. The cumulative release amount was 50% after 28 days. This HCPT/PLGA drug delivery system clearly demonstrated its good sustained-release effect.

hydroxycamptothecin; poly(lactic-co-glycolic acid); nanoparticle

R917

：A

1001—7631 ( 2016 ) 06—0542—05

2016-10-31；

：2016-12-09。

李瑞端（1983—），女，博士；張建軍（1980—），男，副教授，通訊聯(lián)系人。E-mail: zhangjj@mail.buct.edu.cn。

吉林省教育廳項目（2013324）；吉林市科技局青年基金項目（20156421）。