鐘淮欽,林榕燕,黃敏玲*,林 兵,陳南川
(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,福建 福州 350013;2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究中心,福建 福州 350013;3.福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心,福建 福州 350013;4.福建百秾生態(tài)科技有限公司,福建 詔安 363500)
雜交蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析
鐘淮欽1,2,3,林榕燕1,2,3,黃敏玲1,2,3*,林 兵1,2,3,陳南川4
(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,福建 福州 350013;2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究中心,福建 福州 350013;3.福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心,福建 福州 350013;4.福建百秾生態(tài)科技有限公司,福建 詔安 363500)
采用SRAP 技術(shù)對(duì)24份雜交蘭種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行分析。篩選出的11對(duì)引物組合共擴(kuò)增出119條譜帶,其中102條為多態(tài)帶,多態(tài)性比率86.1%,平均每對(duì)引物組合產(chǎn)生9.3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。各種質(zhì)之間的相似系數(shù)變化范圍為0.43~0.98,平均為0.67。UPGMA 聚類(lèi)分析表明:在遺傳相似系數(shù)0.69處將24份供試材料劃分為5個(gè)類(lèi)群,較好地揭示了雜交蘭種質(zhì)間的遺傳多樣性與親緣關(guān)系,可為雜交蘭種質(zhì)資源利用、雜交育種親本選擇及雜種后代鑒定提供科學(xué)依據(jù)。
雜交蘭;SRAP;遺傳多樣性;聚類(lèi)分析
雜交蘭Cymbidiumhybrid是蘭屬CymbidiumSw.地生蘭和附生蘭種間雜交培育而成的蘭花新種類(lèi),集地生蘭的植株小巧、幽香、典雅和附生蘭的花大、色純靚麗等優(yōu)異特性,花期長(zhǎng),有花觀花、無(wú)花觀葉,觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高,逐漸成為消費(fèi)市場(chǎng)的新寵,開(kāi)發(fā)潛力巨大[1-2]。目前,國(guó)內(nèi)雜交蘭品種的選育研究尚處于起步階段,親本及商業(yè)應(yīng)用品種主要來(lái)源于韓國(guó)、日本、美國(guó)等國(guó)家和我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)。且隨著產(chǎn)業(yè)的不斷開(kāi)發(fā),不同地域間相互引種,出現(xiàn)了“同物異名”和“同名異物”的現(xiàn)象。因此,建立一種快速、準(zhǔn)確的種質(zhì)鑒定評(píng)價(jià)方法,對(duì)雜交蘭種質(zhì)資源保存、種質(zhì)創(chuàng)新、品種規(guī)范管理、知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)及推廣應(yīng)用等具有重要的理論依據(jù)和應(yīng)用價(jià)值。
SRAP(sequence-related amplified polymor-phism,相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性)是一種新型的PCR 分子標(biāo)記技術(shù)[3]。該標(biāo)記結(jié)合了RAPD 和AFLP 的優(yōu)點(diǎn),具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可重復(fù)、高共顯性、譜帶易分離及測(cè)序、在基因組中分布均勻等特點(diǎn)[4-5],已應(yīng)用于國(guó)蘭[6-8]、大花蕙蘭[9]、文心蘭[10]、矮牽牛[11]、苦瓜[12]、花椰菜[13]、油菜[14]、荔枝[15]、棉花[16]和紅麻[17]等多種植物種質(zhì)遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、重要性狀標(biāo)記及比較基因組學(xué)研究等。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)雜交蘭的研究主要集中在種子無(wú)菌播種與組培快繁[18-21]、種苗培育[22]、栽培生理[23]和染色體研究[24]等方面,而應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的文章未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究通過(guò)對(duì)收集、保存的24份不同類(lèi)型的雜交蘭種質(zhì)進(jìn)行SRAP分析,探究其種質(zhì)資源遺傳多樣性水平,以期為品種鑒定、雜交育種中的親本選配和種質(zhì)資源的科學(xué)合理利用提供科學(xué)依據(jù)與技術(shù)基礎(chǔ)。
1.1 試驗(yàn)材料
供試品種的試樣采集于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所蘭花種質(zhì)資源圃,共24份,其編號(hào)及品種名等詳見(jiàn)表1。試驗(yàn)在福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心花卉分子育種實(shí)驗(yàn)室完成。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 DNA的提取 取不同種質(zhì)同一生長(zhǎng)期幼嫩葉片,采用改良的CTAB法[25]提取基因組DNA。提取的DNA 原液經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度后,稀釋至100 ng·μL-1,于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>
表1 雜交蘭供試材料Table 1 Cymbidium hybrids examined
1.2.2 SRAP-PCR擴(kuò)增 參考Budak 等[26]的引物,由8 條正向引物和10條反向引物,隨機(jī)組成80對(duì)引物組合;SRAP-PCR 反應(yīng)體系25.0 μL,其中10×Buffer 溶液(含Mg2+)2.5 μL、dNTPs 溶液(2.5 mmol·L-1)2.0 μL、Taq DNA 聚合酶0.25 μL、正反引物(10 mmol·L-1)各1.0μL、模板DNA (100 ng) 1.0 μL、超純水17.25 μL;采用變溫復(fù)性反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性4 min,前5個(gè)循環(huán)35℃復(fù)性,后30個(gè)循環(huán)50℃復(fù)性;最后72℃延伸10 min。反應(yīng)在ABI-9700 PCR 儀上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠、120 V 恒壓電泳,以DL2000 DNA marker為對(duì)照,溴化乙啶染色后紫外凝膠成像儀觀察照相。
1.3 數(shù)據(jù)處理
根據(jù)電泳結(jié)果,每個(gè)樣品中存在的穩(wěn)定條帶記作1,缺失的記作0,強(qiáng)帶和可重復(fù)弱帶均記作1,采用Excel 統(tǒng)計(jì)軟件建立原始二元數(shù)據(jù)矩陣。采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析,按類(lèi)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析構(gòu)建聚類(lèi)圖,并計(jì)算遺傳相似性系數(shù)(GS)。
2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析
從80對(duì)引物組合中篩選出條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性好的引物11對(duì),對(duì)24份雜交蘭種質(zhì)進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增(圖1為引物組合Me3+Em3和Me6+Em2的擴(kuò)增圖譜)。11對(duì)引物共擴(kuò)增出119條清晰條帶,DAN 片段大小為200~2 000 bp,平均每對(duì)引物獲得DNA 條帶10.8條;其中多態(tài)性譜帶102條,多態(tài)性比率為86.1%(表2)。表明SRAP 標(biāo)記在雜交蘭種質(zhì)中具有較為豐富的遺傳多態(tài)性。
2.2 遺傳相似性分析
根據(jù)SRAP 標(biāo)記的分析結(jié)果,24份供試材料間的遺傳相似系數(shù)GS 為0.43~0.98,平均為0.67。表明雜交蘭種質(zhì)間有著豐富的遺傳多樣性?!G翡翠’與‘立葉大鳳’、‘韓國(guó)小姐’與‘爪藝韓國(guó)小姐’、‘櫻花’與‘K40-2櫻花’之間的遺傳相似系數(shù)GS 很高,分別達(dá)到0.96和0.98,遺傳距離很近;‘櫻花’與‘綠翡翠’、‘黃金龍’的遺傳相似系數(shù)GS 最低為0.43,遺傳距離最遠(yuǎn);而大部分種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.50~0.90。結(jié)果表明,多數(shù)雜交蘭品種間表現(xiàn)出一定的遺傳相似性,少數(shù)品種間存在中等程度的遺傳差異。
表2 SRAP 引物組合的擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Results and polymorphism of SRAP primer combinations
2.3 聚類(lèi)分析
利用UPGMA法對(duì)24份雜交蘭種質(zhì)的SRAP 擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析,建立親緣關(guān)系聚類(lèi)圖(圖2)。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.69時(shí),供試材料可劃分為5個(gè)類(lèi)群:第Ⅰ類(lèi)群主要由5個(gè)黃色系和3個(gè)紅色系種質(zhì)組成,春節(jié)前后開(kāi)花;第Ⅱ類(lèi)群由6個(gè)紅色系和1黃色系中花種質(zhì)組成;第Ⅲ類(lèi)群由2個(gè)花瓣暗紅色、唇瓣黃喉的單株組成;第Ⅳ類(lèi)群由4個(gè)黃色系種質(zhì)組成;第Ⅴ類(lèi)群由3個(gè)粉紅色系種質(zhì)組成。
當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.78時(shí):第Ⅰ類(lèi)群種質(zhì)可分為4個(gè)亞類(lèi),第1亞類(lèi)為品種‘金龍爪’,花朵深黃色,葉片爪藝;第2亞類(lèi)由‘立葉大鳳’、‘綠翡翠’、‘玉鳳’和‘黃金龍’等4個(gè)種質(zhì)組成,黃色素花,微香;‘韓國(guó)桃花’單獨(dú)為第3亞類(lèi),花瓣銅紅色帶暗紅斑紋;第4亞類(lèi)由來(lái)源于同一親本的品種‘華韻丹霞’和‘華韻紅霞’組成,花瓣紅色帶胭脂紅斑。第Ⅱ類(lèi)群種質(zhì)可分為3個(gè)亞類(lèi),第1亞類(lèi)包括‘爪藝韓國(guó)小姐’、‘韓國(guó)小姐’、‘紫元素’和‘西施’等4個(gè)紅花系品種;第2亞類(lèi)由‘醉美人’和‘金玉滿(mǎn)堂’組成,橘紅或橙紅花瓣帶胭脂紅斑紋;第3亞類(lèi)為‘黃金美人’,金黃色素花,花大,香氣濃。第Ⅳ類(lèi)群可分為3個(gè)亞類(lèi),第1亞類(lèi)為品種‘十八格格’,青黃色花瓣,白色唇瓣帶淡粉色虎斑;第2亞類(lèi)由‘夏日香水’和‘東方快車(chē)’組成,花瓣青黃或米黃色,唇瓣帶深紅斑塊,秋季花;第3亞類(lèi)為‘黃金小神童’,金黃色素花,濃香。第Ⅴ類(lèi)群‘臺(tái)北小姐’與‘櫻花’花型、葉型完全不同,為什么會(huì)聚為一類(lèi),還有待進(jìn)一步確認(rèn)。
雜交蘭已成為消費(fèi)市場(chǎng)的新寵,具有很高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。掌握種質(zhì)資源的遺傳多樣性,可以減少新品種選育中親本選配的盲目性,提高育種效率;同時(shí)也可以對(duì)一些‘同物異名’或‘同名異物’的品種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。因此,開(kāi)展雜交蘭種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析具有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。
SRAP分子標(biāo)記主要針對(duì)基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)進(jìn)行擴(kuò)增,因物種以及個(gè)體不同,內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔長(zhǎng)度不等而產(chǎn)生豐富的多態(tài)性,不但集中了RAPD、SSR、AFLP 等常用分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn),還彌補(bǔ)了這些標(biāo)記各自的缺點(diǎn),已在多種植物上廣泛應(yīng)用[27-29]。應(yīng)用DNA 分子標(biāo)記研究蘭屬植物遺傳多樣性的文獻(xiàn)也顯示了SRAP 標(biāo)記的多態(tài)率高且穩(wěn)定[5-9,30]。本研究利用SRAP 標(biāo)記對(duì)24份雜交蘭種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果顯示11對(duì)多態(tài)性引物共擴(kuò)增出DNA條帶119條,其中多態(tài)性條帶102 條,多態(tài)性百分率達(dá)86.1%,說(shuō)明SRAP 標(biāo)記在國(guó)蘭雜交蘭的遺傳多樣性研究中有較高的檢出率。種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)為0.43~0.98,表明種質(zhì)間具有豐富的遺傳多樣性。
SRAP 標(biāo)記的UPGMA 聚類(lèi)分析結(jié)果表明,供試的24份種質(zhì)可以較為清楚地區(qū)分開(kāi)來(lái)。在遺傳相似系數(shù)0.78時(shí),種質(zhì)間的親緣關(guān)系與來(lái)源、花色、花型等有一定的相關(guān)性。如第Ⅰ類(lèi)群第2亞類(lèi)的‘立葉大鳳’、‘綠翡翠’、‘玉鳳’和‘黃金龍’均為小黃花素心品種,‘玉鳳’是從‘綠翡翠’群體中的變異單株選育而來(lái);第Ⅰ類(lèi)群第4亞類(lèi)的‘華韻丹霞’和‘華韻紅霞’是同一父母本的姐妹品系。第Ⅱ類(lèi)群第1亞類(lèi)的‘韓國(guó)小姐’、‘紫元素’和‘西施’等3個(gè)紅色系品種來(lái)源于韓國(guó),而‘爪藝韓國(guó)小姐’是‘韓國(guó)小姐’的葉片突變品系。第Ⅲ類(lèi)群的‘紅美人’和‘K33a紅美人’是來(lái)源于不同的母株組培快繁獲得的2個(gè)群體,DNA水平上存在的遺傳差異可能與植株的抽芽及開(kāi)花性相關(guān)。同一個(gè)國(guó)家或地區(qū)的不同品種因親本重復(fù)利用、種間雜交,基因交換頻繁,品種遺傳基礎(chǔ)較為狹窄,品種間遺傳相似性相對(duì)較高。聚類(lèi)結(jié)果中也有不同來(lái)源地或不同花色、花型等類(lèi)型的品種聚在一起,如第Ⅴ類(lèi)群的‘臺(tái)北小姐’與‘櫻花’來(lái)源地不同,在花型、葉型等形態(tài)上也完全不同,這有待于今后研究中進(jìn)行更多的驗(yàn)證。
對(duì)雜交蘭品種間親緣關(guān)系的SRAP 多態(tài)性分析還未見(jiàn)報(bào)道,關(guān)于其結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性還需要進(jìn)一步結(jié)合形態(tài)評(píng)價(jià)、增加樣本量深入的研究。從本研究的結(jié)果來(lái)看,效果較好,可將SRAP分子標(biāo)記技術(shù)運(yùn)用到雜交蘭種質(zhì)遺傳關(guān)系分析、種質(zhì)鑒定等,為雜交蘭品種改良、分類(lèi)命名及雜種后代鑒定等提供依據(jù)。
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(責(zé)任編輯:黃愛(ài)萍)
SRAP-marker Based Genetic Diversity of Germplasms ofCymbidiumHybrids
ZHONG Huai-qin1,2,3,LIN Rong-yan1,2,3,HUANG Min-ling1,2,3*,LIN Bing1,2,3,Chen Nan-chuan4
(I.InstituteofCropSciences,FujianAcademyofAgriculturalScience,Fuzhou,Fujian350013,China; 2.FlowersResearchCenter,FujianAcademyofAgriculturalScience,Fuzhou,Fujian350013,China;3.FujianEngineeringResearchCenterforCharacteristicFloriculture,Fuzhou,Fujian350013,China;
4.FujianBainongEcologicalTechnologyLimitedCompany,Zhaoan,Fujian363500,China)
SRAP was applied for the determination of the genetic diversity of 24 hybrid cultivars ofCymbidium. Eleven polymorphic primer combinations were screened to result in 119 amplified DNA bands. Of the amplified DNA, 102 were polymorphic, at a ratio of 86.1%. The average number of polymorphic loci amplified by each primer was 9.3. The genetic similarity among the 24 germplasms ranged from 0.43 to 0.98, averaging 0.67. The UPGMA cluster analysis classified the germplasms with a similarity coefficient of 0.69 into 5 groups clearly showing the genetic diversity and relationship among the hybrids.
Cymbidiumhybrid; SRAP; genetic diversity; cluster analysis
2016-05-26初稿;2016-07-30修改稿
鐘淮欽(1979-),男,副研究員,主要從事觀賞植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與創(chuàng)新利用研究(E-mail:zhqeeast@163.com) *通訊作者:黃敏玲(1960-),女,研究員,主要從事花卉品種選育與生物技術(shù)研究(E-mail:huangm1618@163.corn)
福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目——省屬公益類(lèi)科研院所基本科研專(zhuān)項(xiàng) (2014R1025-5);福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)PI項(xiàng)目(2016PI-39);福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目——星火計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目 (2014S0014)
S 68
:A
:1008-0384(2016)11-1193-05
鐘淮欽,林榕燕,黃敏玲,等.雜交蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,31(11):1193-1197.
ZHONG H-Q,LIN R-Y,HUANG M-L,et al.SRAP-marker Based Genetic Diversity of Germplasms ofCymbidiumHybrids[J].FujianJournalofAgriculturalSciences,2016,31(11):1193-1197.