葉 穎張文勝蘇惠斌王 樂,3*

（1 蘇州大學劍橋-蘇大基因組資源中心，江蘇 蘇州 215123；2 蘇州市立醫(yī)院東區(qū)麻醉科，江蘇 蘇州 215000；3 蘇州大學醫(yī)學部，江蘇 蘇州 215123）

凋亡在原發(fā)性肺損傷中的變化

葉 穎1張文勝1蘇惠斌2王 樂2,3*

（1 蘇州大學劍橋-蘇大基因組資源中心，江蘇 蘇州 215123；2 蘇州市立醫(yī)院東區(qū)麻醉科，江蘇 蘇州 215000；3 蘇州大學醫(yī)學部，江蘇 蘇州 215123）

目的氣管滴注法構建脂多糖（LPS）引起的大鼠原發(fā)性急性肺損傷(acute lung injury，ALI)模型，研究肺組織細胞凋亡的時間變化。方法30只雄性SD大鼠隨機均分為5組：對照組，LPS（1、6、12和24 h）組。LPS組氣管內滴注LPS，5 mg/kg，正常對照組氣管內注入等量生理鹽水。于1 h、6 h、12 h和24 h后處死，取肺組織，行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察病理變化；測定肺濕重/干重（W/D）比值；TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling）法，檢測細胞凋亡；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測凋亡蛋白cleaved-capase3的表達水平。結果HE染色可見，LPS滴注后肺泡間隔增寬、間質充血水腫、肺泡腔變窄、炎性細胞滲出及小氣道損傷隨著時間增加呈現(xiàn)趨勢性變化。LPS組肺W/D比對照組明顯增加。TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)，1 h、6 h、12 h和24 h實驗組肺組織細胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）較對照組明顯升高，且1～12 h內AI值隨時間增加而增加，其中12 h AI值最高，24 h時間點AI有所下降。對照組AI低于實驗組（P＜0.01）。Western blot發(fā)現(xiàn)，在1 h、6 h、12 h和24 h實驗組cleaved-caspase-3含量較對照組明顯升高，且1～12 h內隨時間增加而增加，其中12 h最高，24 h有所下降。對照組cleaved-caspase-3含量低于實驗組（P＜0.01）。結論LPS導致大鼠原發(fā)性肺損傷隨著時間的推移而逐漸加重，大鼠肺組織細胞大量凋亡，其凋亡程度對時間的延長呈現(xiàn)一先升后降的過程。

急性肺損傷；內毒素；凋亡；時程變化

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是各種直接或間接因素導致的肺泡上皮細胞和毛細血管內皮細胞損傷，導致急性低氧性呼吸功能不全[1]。ALI發(fā)病機制尚未完全明確，是近年來研究的重點[2]。肺性的ALI是病因對肺泡細胞的直接損傷效應，又稱為原發(fā)性肺損傷。直接和間接ALI肺內外器官損傷表現(xiàn)，發(fā)病程度，進程，致死率以及治療均有所差別，LPS致急性肺損傷進展快，發(fā)展至嚴重階段稱為急性呼吸窘迫綜合征，如不及時干預，致死率極高[3]。關于肺組織細胞在ALI發(fā)病進程的研究并不多見，本研究采用氣管內直接滴注LPS的方法建立原發(fā)性肺損傷，旨在觀察原發(fā)性肺損傷時肺組織的凋亡情況以及凋亡時程變化，為進一步探討原發(fā)性肺損傷發(fā)病機制以及早期干預時機提供實驗依據(jù)。

圖1 蘇木精-伊紅染色檢測肺組織病理變化（放大倍數(shù)×400）

圖2 蛋白印記檢測Cleavedcaspase-3在肺組織中的表達水平*P＜0.05 vs.對照組

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組：健康雄性SD大鼠（蘇州大學實驗動物中心）30只，體質量250～280 g，隨機分為對照組、LPS處理1 h、6 h、12 h、24 h組（每組6只）。5組動物均腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后做頸部正中切口，暴露氣管，將LPS用1 mL注射器注入氣管，制備ALI模型，對照組注射等量生理鹽水，注射LPS后分別于1 h、6 h、12 h、24 h經(jīng)頸動脈放血處死動物，剖胸取肺。

1.2 肺組織病理學觀察：取右肺下葉組織，10%甲醛固定后用石蠟包埋切片，片厚5 μm，HE染色，光鏡觀察肺組織形態(tài)。

1.3 肺水含量測定：取右肺中葉，吸水紙吸干表面水分及血液，稱量肺濕重。置于80 ℃烤箱72 h后，稱量肺干重，計算W/D。

1.4 TUNEL法肺組織細胞凋亡：步驟如TUNEL分析試劑盒說明。AI的計算方法：每個標本取2張切片，每張切片選擇4個具有代表性的視野（×400），計數(shù)500個細胞中明顯的TUNEL染色陽性細胞數(shù)并計算AI。AI=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.5 蛋白免疫印跡：注射LPS后，開胸取出左肺下葉，迅速凍存于液氮中。用BCA法測定蛋白濃度。等量蛋白樣品經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，以半干轉法電轉移至硝酸纖維素膜上。室溫封閉3 h后，加入一抗：抗cleaved-capase-3抗體（1∶800）4 ℃過夜。洗膜3遍后用相應的堿性磷酸酶標記的二抗室溫孵育2 h，最后用ECL顯色。

2 結 果

2.1 肺組織光鏡檢測：正常對照組肺泡結構完整，肺泡腔內清晰，胞壁光滑，肺泡腔及間質內無滲出；LPS組1 h即有肺泡腔及間質內炎性細胞浸潤，肺泡腔內有滲出液，肺泡隔增厚，肺泡及間質充血、出血，部分肺泡塌陷，這些變化在6 h、12 h逐漸加重，24 h時又有所下降，其中以12 h組改變最明顯（圖1）。

2.2 W/D比值：LPS可以誘導大鼠肺組織濕質量/干質量值升高，1 h（4.80±0.13）即開始升高，6 h（6.47±0.36）繼續(xù)升高，12 h（6.74 ±0.26）時W/D值升高顯著高于其他LPS組，24 h（4.71±0.57）有所下降。與對照組（4.35±0.37）比較，有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3 肺組織細胞凋亡的變化：TUNEL分析LPS處理后，肺組織中TUNEL陽性細胞明顯增加[1 h，（28.01±2.74）；6 h，（37.22± 2.95）；12 h，（48.13±1.88）；24 h，（15.85±1.99）]。與對照組（11.23±2.31）比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.4 肺組織cleaved-caspase-3蛋白表達：以?-actin作為內參，cleavedcaspase-3蛋白表達量的光密度掃描分析顯示，LPS組cleaved-caspase-3蛋白表達明顯上升（P＜0.05，圖2），與對照組組比較，有統(tǒng)計學意義。

3 討 論

目前ARDS的病死率仍高達40%～60%[4]。ALI是ARDS的早期階段，內源性ALI的主要病因有：吸入肺部感染，淹溺，有毒氣體吸入，肺創(chuàng)傷[5]。當LPS進入體內后激活炎性細胞釋放炎性介質，觸發(fā)局部炎性反應而產(chǎn)生肺損傷，且LPS本身對肺上皮和血管內皮也有直接損傷作用，可建立確切的直接肺損模型[6]。

在不同肺損傷中，凋亡起到了很大的作用。有報道顯示，與全身炎性反應不同，LPS可以直接導致肺泡上皮細胞，血管內皮細胞，支氣管上皮細胞凋亡[7]。研究顯示，在ALI的修復期，肺泡Ⅱ型細胞是以凋亡的方式參與其結構重建，同時大量凋亡細胞被吞噬細胞清除，故細胞凋亡是一個動態(tài)發(fā)展的過程。在凋亡信號通路中，cleavedcaspase-3作為最終末的凋亡蛋白，它的增加表示凋亡已經(jīng)不可逆轉[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在直接肺損傷時，肺組織的整體凋亡率的改變與病理組織形態(tài)改變呈現(xiàn)一致性改變，LPS滴注后1 h，肺損傷逐漸增加持續(xù)至24 h，損傷和凋亡率在12 h時達到峰值，隨后凋亡率開始下降，肺損傷減輕，所以我們認為，LPS導致了肺組織炎癥，細胞的凋亡，二者相輔相成，是一個先升后降的過程，該結果為肺源性肺損傷選擇藥物，呼吸支持的時機時間以及預后提供了一定的科學依據(jù)，但其具體凋亡發(fā)展機制仍待進一步研究。

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1671-8194（2016）33-0015-02

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