王騰騰，趙永見，陳 巖，李金龍，王擁軍，施 杞，梁倩倩，徐 浩＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院 上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學脊柱病研究所 上海 200032）

二陳加桃紅四物湯改善類風濕關(guān)節(jié)炎的機理研究＊

王騰騰1，2，趙永見1，2，陳 巖1，2，李金龍1，2，王擁軍1，2，施 杞1，2，梁倩倩1，2，徐 浩1，2＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院 上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學脊柱病研究所 上海 200032）

目的：類風濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種累及全身小關(guān)節(jié)的自身免疫性疾病。前期研究發(fā)現(xiàn)，充足的淋巴回流功能有利于RA的恢復。本文主要探討二陳加桃紅四物湯治療本病的療效及其對淋巴管回流功能的影響。方法：本研究采用10周齡TNF轉(zhuǎn)基因（TNF-Tg）小鼠為模型，以二陳加桃紅四物湯灌胃治療12周，并選取同窩野生型小鼠作對照，采用Micro-CT觀測小鼠的踝關(guān)節(jié)骨量，采用近紅外-吲哚菁綠系統(tǒng)檢測小鼠下肢淋巴管功能。結(jié)果：Micro-CT三維成像顯示，與對照組相比，TNF-Tg組可見明顯的骨質(zhì)破壞，踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)嚴重受損。二陳加桃紅四物湯治療后，骨結(jié)構(gòu)得到了一定程度的保護。淋巴管回流功能檢測顯示，與對照組相比，TNF-Tg組的淋巴管清除率明顯下降；與TNF-Tg組相比，二陳加四物湯可促使受損的淋巴功能恢復。與對照組小鼠相比，TNF-Tg組的Pulse值明顯下降，與TNF-Tg組相比，二陳加桃紅四物湯可促進Pulse值明顯升高。結(jié)論：二陳加桃紅四物湯可以有效促進TNF轉(zhuǎn)基因小鼠模型下肢的淋巴回流功能，從而緩解關(guān)節(jié)炎癥，保護骨組織免受侵蝕。

類風濕關(guān)節(jié)炎 二陳加桃紅四物湯 TNF轉(zhuǎn)基因小鼠 淋巴回流功能

RA是一種自身免疫性疾病，多種炎性因子介導了該病的炎癥反應；替代醫(yī)學療法在治療RA方面具有較大的發(fā)展空間[1]。中醫(yī)認為，痰瘀既是RA的病理產(chǎn)物，又是其基本病機[3]，二陳加四物湯為治療痰瘀互結(jié)的常用方劑?，F(xiàn)代研究認為，淋巴管回流功能在RA的發(fā)病過程中起到重要的作用[4]；TNF轉(zhuǎn)基因（TNF-Tg）小鼠在闡釋炎癥反應中發(fā)揮了重要作用[2]，是研究RA常用的動物模型。本文主要探討二陳加四物湯對TNF-Tg模型小鼠淋巴管回流功能的影響以及對RA的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗采用的TNF-Tg小鼠（line 3647）來自1991年George Kollias實驗室，并由羅徹斯特大學贈送。TNF-Tg小鼠攜帶單人TNF拷貝基因，呈現(xiàn)自發(fā)慢性、進展性關(guān)節(jié)炎，與WT同窩對照小鼠一起飼養(yǎng)于上海模式動物中心，SPF級，自由飲水攝食。

1.2 實驗試劑

組織提取與DNA抽提（美國Sigma公司，貨號：051M8617V、SLBB1424V、041M6349），瓊脂糖（西班牙Biowest公司，批號：G-10111860），DNA Marker（北京TIANGEN公司，貨號：MD102），引物購自上海百力格生物技術(shù)有限公司。二陳加桃紅四物湯組成：半夏12 g、橘紅12 g、茯苓9 g、熟地12 g、當歸12 g、白芍9 g、川芎9 g、桃仁9 g、紅花6 g、炙甘草6 g，以上所有中藥均購自上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中藥房。異氟烷（深圳沃瑞德公司，批號：217140901），脫毛膏（印度利潔時公司，國妝特進字J20130140）。吲哚菁綠（Indocyanine Green，ICG）（美國Acorn公司，批號：081424）。近紅外成像系統(tǒng)（法國Hubtech公司，型號：Fluobeam Clinical System）。小動物麻醉機（美國VMR公司，型號：V1315267），Micro-CT（瑞士SCANCO公司，型號：uCT80）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物鑒定及分組

對3周齡小鼠剪尾，進行基因組DNA抽提。每個樣本加入提取液25.00 μL，制備液6.25 μL，25℃ 5 min→ 95℃ 10 min→ 25℃ 5 min，加入25.00 μL中和液混勻，室溫放置5 min。引物序 列F：5’-TACCCCCTCCTTCAGACACC-3’；R：5’-GCCCTTCATAATATCCCCCA-3’。PCR反應體系20 μL：Bioteke PCR mix 7 μL、水10 μL、DNA抽提產(chǎn)物1 μL、上下游引物各1 μL。94℃ 3 min、94℃30 s→60℃ 35 s→72℃ 1.5 min，30個循環(huán)，72℃7 min，4℃保存。配制2%的瓊脂糖膠，上樣量10 μL，電壓110 V，持續(xù)40 min。陽性條帶在200-300 bp之間。

采用SPSS軟件將陽性小鼠按體質(zhì)量隨機區(qū)組，分為TNF-tg組、中藥二陳加四物湯組（簡稱：中藥ECSWT組），每組10只。按照陽性小鼠平均體質(zhì)量，挑選體質(zhì)量相似、同窩飼養(yǎng)的陰性小鼠10只，為對照組。

1.3.2 動物給藥

根據(jù)《實驗動物藥理學》，將小鼠（20 g）與人（60 kg）的中藥計量進行換算（換算系數(shù)9.01），小鼠需服中藥煎劑濃度為1.09 g·mL-1，取上述中藥1付，加12倍水，浸泡30 min，煮沸后再煎30 min，趁熱過濾得煎液1；所余藥渣加8倍水，同樣方法得煎液2；合并兩次煎液，通風櫥中加熱濃縮至67 mL，每只小鼠灌胃0.2 mL。對照組和TNF-Tg組灌胃生理鹽水，每天1次，連續(xù)12周。

1.3.3 測量指標

小鼠氣體麻醉，下肢脫毛，采用30號針頭，10 μL ICG（0.1 μg·mL-1，蒸餾水溶解）注射小鼠足底皮膚，在近紅外下連續(xù)可觀察到熒光信號由集合淋巴管進入腘窩淋巴結(jié)，連續(xù)1 h并拍照，24 h后觀察5 min。采用Image J軟件定量測定圖片中ICG的信號強度。根據(jù)兩個時間點的足底信號強度可得出淋巴管的清除率，公式：清除率=（S24h-S1h）/S1h×100%。ICG注射1 h之后，淋巴管的信號趨于穩(wěn)定，連續(xù)觀測500 s淋巴管搏動情況，記錄Pulse值[5]。灌胃前與灌胃結(jié)束后各采集一次指標。

動物踝關(guān)節(jié)取材，置于75%酒精固定24 h；采用Micro-CT掃描，參數(shù)為：電壓55 kV、電流72 μA、分辨率10 μmpx。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計結(jié)果用平均值±標準差描述，多組間比較均用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 踝關(guān)節(jié)Micro-CT 3D成像

與WT小鼠相比，TNF-Tg組小鼠可見明顯的骨質(zhì)破壞，踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)嚴重受損，骨量降低；與TNF-Tg組相比，ECSWT組小鼠骨結(jié)構(gòu)受損得到了一定程度的緩解，骨量亦有所提高（圖1）。

圖1 不同組別小鼠踝關(guān)節(jié)Micro-CT 3D圖像

2.2 淋巴管清除率檢測

如圖2、圖3所示，藍色圓圈部分為足底部注射部位，注射后24 h，與對照組（清除率76.10%）相比，TNF-Tg組的淋巴管清除率明顯下降（清除率47.15%，P＜0.05）。與TNF-Tg組相比，ECSWT組清除率明顯增加（清除率80.16%，P＜0.05），促進了受損淋巴功能的恢復。

2.3 淋巴管Pulse檢測

圖4所示為ICG注射1 h后500 s內(nèi)淋巴管的信號強度變化情況，我們把峰值與谷值的變化次數(shù)轉(zhuǎn)化為Pulse個數(shù)。如圖5所示，對照組小鼠Pulse為每分鐘1.45e個信號強度，與之相比，TNF-Tg組明顯下降（每分鐘0.62e個信號強度，P＜0.05）。與TNF-Tg組相比，ECSWT組Pulse信號強度升高（每分鐘1.24e個信號強度，P＜0.05）。

圖2 不同組別小鼠ICG-NIR成像

圖3 不同組別小鼠下肢淋巴管清除率計量分析

圖4 不同組別小鼠下肢淋巴管信號強度情況

圖5 不同組別小鼠下肢淋巴管Pulse統(tǒng)計分析

3 討論

RA以關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、畸形為主要臨床表現(xiàn)，若治療不當，會導致全身多器官的的并發(fā)癥。“尪”義為骨骼彎曲，本病在中醫(yī)屬于“尪痹”范疇；痰瘀在本病的病機、診治中占有很大的比例，風寒濕邪侵襲經(jīng)絡(luò)，氣血阻滯，痰瘀膠著，遂成此證[6]。本病主要病理表現(xiàn)為多種炎性因子浸潤、滑膜細胞增生、血管翳的生成等[7]，與“痰瘀”的病機極為類似?！疤叼觥钡闹嗅t(yī)理論基礎(chǔ)實為“津血同源”，因此痰瘀同治的治療方法有著深厚的理論基礎(chǔ)和很長的發(fā)展歷程。

二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，主治“治痰飲為患”。《重樓玉鑰》有二陳湯可治“骨槽風等癥”的記載。目前二陳湯主要治療肋骨骨折并發(fā)癥[8]、坐骨滑膜囊腫[9]等病。桃紅四物湯，又名加味四物湯，出自《玉機微義·卷三十一》（引《醫(yī)壘元戎》），“桃紅四物”之名首見于《醫(yī)宗金鑒·卷四十四》，《正骨心法要旨》中用本方治療跌打損傷下法之后痛不止?，F(xiàn)代研究證明，桃紅四物湯具有舒張血管、保護血管內(nèi)皮[10]、治療骨關(guān)節(jié)炎[11]，促進成骨分化[12]、調(diào)節(jié)免疫功能[13]等作用。由此可見，以上兩方在骨病的臨床、基礎(chǔ)研究中均有應用，兩方相合而成二陳加桃紅四物湯，為痰瘀同治的經(jīng)典搭配，可用于治療酒精性脂肪肝、甲亢、卵巢囊腫等多種疾病的痰瘀阻滯型[14-16]。

前期研究證明，RA患者的關(guān)節(jié)滑膜中存在大量炎性因子的浸潤，而淋巴管在關(guān)節(jié)的透明質(zhì)酸、炎性因子、代謝產(chǎn)物等大分子[17]的回流中起到了重要作用。TNF-Tg小鼠的淋巴回流收到破壞，本研究通過二陳加桃紅四物湯治療TNF-Tg小鼠，證明該方可促進淋巴管回流功能的恢復，促進炎性產(chǎn)物的代謝，從而緩解關(guān)節(jié)骨的破壞，治療RA。

血管在RA的作用越來越受到重視，大量研究發(fā)現(xiàn)，RA患者存在微循環(huán)障礙，心血管事件增加[18]等情況。此外，淋巴管在腫瘤轉(zhuǎn)移、水腫、過敏性疾病、代謝性疾病等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用[19]，淋巴管在RA的作用也應得到同樣的關(guān)注。淋巴管在RA的研究才剛剛起步，尚有大量內(nèi)容有待探索和發(fā)現(xiàn)。淋巴管與炎癥、免疫關(guān)系密切，隨著免疫醫(yī)學的興起，淋巴管必將受到越來越多的關(guān)注。中醫(yī)素有“久病入絡(luò)”和“頑痹生痰”[20]之說，王清任亦提出“瘀血致痹”，痰瘀致病、病程纏綿、反復發(fā)作，與慢性、難治性RA等疾病相似。傳統(tǒng)的診斷技術(shù)、外科手術(shù)治療均忽略了淋巴管，淋巴管有可能是影響多種疾病愈后的關(guān)鍵所在。臨床中較棘手的并發(fā)癥或難治性疾病，包括對生物制劑無應答者，都有可能在淋巴管上找到突破點。中醫(yī)藥如何在淋巴管研究潮流中發(fā)揮自己的獨特優(yōu)勢，是值得我們深思的問題和未來的研究方向。

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Mechanisms Behind the Therapeutic Effects of Er Chen Combined with Tao Hong Si Wu Tang (ECSWT) on Rheumatoid Arthritis

Wang Tengteng1,2, Zhao Yongjian1,2, Chen Yan1,2, Li Jinlong1,2, Wang Yongjun1,2, Shi Qi1,2, Liang Qianqian1,2, Xu Hao1,2
(1. Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China; 2. Institute of Spine Diseases, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China)

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic autoimmune disorder primarily occurred in small joints. Our previous studies suggested that sufficient lymphatic drainage was favorable for the recovery of RA. This study aimed at exploring the effect of Er Chen combined with Tao Hong Si Wu Tang (ECSWT) on RA in TNF transgenic (TNF-Tg) mice. Ten-week old TNF-Tg mice and WT littermates were detected with indocyanine green-nearinfrared (ICG-NIR) lymphatic imaging system before and after accepting the 12-week intragastric administration of ECSWT. All ankle joints were assessed by micro-CT scanning. According to three dimensional images of Micro-CT, it was found that the ankle joints in the TNF-Tg group were much eroded compared with the control group. The bone mass and structure were protected after the treatment of ECSWT. ICG-NIR results showed that lymphatic clearance rate of the TNF-Tg group decreased compared with those of the control group. In comparison with the TNF-Tg group, ECSWT promoted the repair of lymphatic function. Compared with the control group, the pulse value of the TNF-Tg group declined; while this condition could be rescued by ERSWT. In conclusion, ECSWT mitigated bone erosion of astragalus bone area in TNF-Tg mice in contrast to the saline mice, while promoted the pulse value and clearance of lymphatic vessels afferent from footpad to popliteal lymph node, implying that ECSWT was a promising agent for treating RA through its promoting lymphatic drainage function effects.

Rheumatoid arthritis, TNF-Tg mice, Er Chen Combined Tao Hong Si Wu Tang, lymphatic drainage function

10.11842/wst.2016.11.007

R274

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-11-04

修回日期：2016-11-04

＊ 國家自然科學基金委重點項目（81330085）：痰瘀型類風濕性關(guān)節(jié)炎與淋巴關(guān)系的基礎(chǔ)研究，負責人：施杞；國家自然科學基金委重大國際合作項目（81220108027）：益氣祛濕法調(diào)控淋巴系統(tǒng)對炎癥性關(guān)節(jié)炎的影響，負責人：王擁軍；教育部高等學校全國優(yōu)秀博士學位論文作者專項資金資助項目（201276）：負責人：梁倩倩；上海市龍華醫(yī)院龍醫(yī)創(chuàng)新團隊（LYCX-01）：祛瘀化瘀防治頸痛和炎性關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)研究，負責人：梁倩倩；上海市衛(wèi)生與計劃生育委員會中醫(yī)藥三年行動計劃項目（ZY3-CCCX-2-1002）：國家中醫(yī)臨床研究基地建設(shè)項目，負責人：崔學軍；筋骨理論與治法教育部重點實驗室，負責人：王擁軍；上海市長寧區(qū)衛(wèi)生與計劃生育委員會"光華卓越PI工程"項目（2016-01），負責人：施杞；上海市教育委員會高校實驗技術(shù)隊伍建設(shè)計劃（LH01.24.001）：負責人：趙永見。

＊＊ 通訊作者：徐浩，助理研究員，主要研究方向：中醫(yī)藥治療關(guān)節(jié)炎癥性疾病的療效及機制研究。