袁娜娜，李 偉，陳余清，張佳秀，洪 磊，蔣 鵬，周繼紅，王效靜，朱茂祥，潘秀頡，楊陟華，顧永清

（蚌埠醫(yī)學(xué)院1.第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，安徽呼吸系病臨床基礎(chǔ)省級實(shí)驗(yàn)室，3.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，安徽蚌埠 233004；2.阜陽市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽阜陽 236015；4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3通路參與卷煙煙氣凝集物誘導(dǎo)永生化人支氣管上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化

袁娜娜1，2，李 偉1，陳余清1，張佳秀1，洪 磊1，蔣 鵬1，周繼紅3，王效靜1，朱茂祥4，潘秀頡4，楊陟華4，顧永清4

（蚌埠醫(yī)學(xué)院1.第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，安徽呼吸系病臨床基礎(chǔ)省級實(shí)驗(yàn)室，3.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，安徽蚌埠 233004；2.阜陽市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽阜陽 236015；4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

目的 檢測肺鱗癌組織、鱗狀細(xì)胞不典型增生組織和癌旁組織中磷酸化信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3（pSTAT3）蛋白的表達(dá)，比較其表達(dá)與吸煙的關(guān)系；探討STAT3通路在煙草誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用。方法 免疫組化法檢測288例肺鱗癌組織、108例鱗狀細(xì)胞不典型增生組織、112例癌旁組織中pSTAT3蛋白的表達(dá)，比較其表達(dá)與吸煙的相關(guān)性。構(gòu)建卷煙煙氣凝集物（CSC）誘導(dǎo)第10，20，30，40，50，60及70代細(xì)胞（P10，P20，P30，P40，P50，P60及P70）永生化人支氣管上皮細(xì)胞（BEP2D）惡性轉(zhuǎn)化模型。從血清抗性及錨著獨(dú)立性等方面對CSC誘導(dǎo)各代BEP2D細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化特征進(jìn)行鑒定。Western蛋白印跡法檢測CSC誘導(dǎo)各代BEP2D細(xì)胞中pSTAT3的表達(dá)。MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測JSI-124 0.25～10 μmol·L-1對P70細(xì)胞存活及凋亡的影響。JSI-124處理CSC誘導(dǎo)P70 24 h后檢測存活蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 pSTAT3蛋白在肺鱗癌組織中表達(dá)高于鱗狀細(xì)胞不典型增生和癌旁組織（P＜0.05）；pSTAT3在目前吸煙者中的表達(dá)均高于曾經(jīng)吸煙者和從不吸煙者（P＜0.05），且隨著吸煙指數(shù)增加兩者表達(dá)水平逐漸升高（P＜0.01）。隨著轉(zhuǎn)化代數(shù)的增高，細(xì)胞血清抗性增加，錨著獨(dú)立性增強(qiáng)，P30細(xì)胞以后尤為明顯。pSTAT3在正常對照組和乙醇對照組中弱表達(dá)，且兩者之間無顯著性差異；CSC誘導(dǎo)的各組BEP2D細(xì)胞中，pSTAT3的表達(dá)均顯著高于正常對照組和乙醇對照組（P＜0.05），并隨細(xì)胞代數(shù)的增高而增高。JSI-124抑制P70細(xì)胞增殖、促進(jìn)P70細(xì)胞凋亡呈濃度及時間依賴性。JSI-124 1 μmol·L-1作用P70細(xì)胞24 h后，存活蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論 STAT3信號通過調(diào)控存活蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，參與煙草誘導(dǎo)永生化人支氣管上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。

信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3；卷煙煙氣凝集物；永生化人支氣管上皮細(xì)胞

吸煙是肺癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素［1］。點(diǎn)煙后可產(chǎn)生4-甲基亞硝胺基-3-吡啶-1-丁酮〔4-（methylni?trosamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanone，NNK）、尼古丁和多環(huán)芳烴等70多種致癌物［2］。研究表明，卷煙煙氣中的致癌物可活化絲裂原活化蛋白激酶（mito?gen-activated protein kinase，MAPK）［3］，絲蘇氨酸蛋白激酶蛋白激酶B/哺乳動物西羅莫司（雷帕霉素）靶蛋白〔protein kinase B/mammalian target of sirolimus（Rapamycin），Akt/mTOR〕［4-5］及酪氨酸激酶Janus激酶/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3（Janus kinase/signal transducer and activator of tran?scription 3，JAK/STAT3）［6］等信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常和凋亡障礙等，從而誘發(fā)癌癥的發(fā)生發(fā)展。STAT3是白細(xì)胞介素6/酪氨酸激酶和表皮生長因子受體等多個致癌性酪氨酸激酶信號通路匯聚的焦點(diǎn)，其磷酸化表達(dá)與肺癌和胃癌等多種腫瘤細(xì)胞的異常增殖密切相關(guān)［2，7］。Guo等［8］報(bào)道，尼古丁和NNK能上調(diào)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中磷酸化STAT3（pSTAT3）表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)其生長潛能。通過對靶基因的調(diào)控，STAT3參與腫瘤的免疫逃逸、細(xì)胞凋亡、增殖分化、血管新生及侵襲轉(zhuǎn)移等活動［9-12］。Nagpal等［13］發(fā)現(xiàn)，STAT3活化是煙草相關(guān)的口腔鱗癌發(fā)生的早期事件。Liu等［6］發(fā)現(xiàn)，即STAT3水平在煙草凝集物作用支氣管上皮細(xì)胞24 h顯著增高。目前，煙草致癌機(jī)制研究多采用短期誘導(dǎo)細(xì)胞模型，本研究利用卷煙煙氣凝集物（ciga?rette smoke condensate，CSC）長期誘導(dǎo)的細(xì)胞模型觀察STAT3通路在煙草誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用并通過組織研究加以驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

LHC-8無血清培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；HAM′S/F-12培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；鼠抗人STAT3單克隆抗體、兔抗人磷酸化Y705單克隆抗體和兔抗人存活蛋白單克隆抗體購自美國Abcam公司；STAT3特異性抑制劑JSI-124購自美國Calbiochem公司；兔抗β肌動蛋白IgG多克隆抗體和山羊抗小鼠單克隆二抗和山羊抗兔單克隆二抗均購自中國武漢博士德公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司；PCR試劑盒購自中國天根生化科技有限公司；AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自中國碧云天生物公司；引物由中國上海生工生物工程有限公司合成。芙蓉王香煙購自湖南中煙工業(yè)公司常德卷煙廠。PCR儀、UV凝膠成像系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司。Flour Chem FC3型多功能凝膠成像分析系統(tǒng)購于美國Protein Simple公司。Alpha View圖像分析軟件為美國Al?pha公司產(chǎn)品。

1.2 臨床組織樣本檢測

1.2.1 組織標(biāo)本

收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2008.1-2013.7經(jīng)纖支鏡活檢（84例）和手術(shù)切除肺鱗癌標(biāo)本（204例）共288例、癌旁正常組織標(biāo)本112例，氣管鏡活檢鱗狀細(xì)胞不典型增生標(biāo)本108例。所有患者采集標(biāo)本前均未經(jīng)放療、化療、靶向治療及免疫治療。所有標(biāo)本均有完整的臨床病理資料如性別、年齡、吸煙狀況、吸煙指數(shù)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、組織學(xué)分級。所有確診肺癌患者的臨床分期情況根據(jù)影像學(xué)資料（胸部CT、PET-CT和全身骨ECT等）、臨床體格檢查及EBUS-TBNA等綜合評價。參照相關(guān)文獻(xiàn)［14］將吸煙者按吸煙狀況不同分為從不、曾經(jīng)和現(xiàn)在吸煙者。從不吸煙者定義為終生吸煙劑量＜100支；戒煙＞1年者為曾經(jīng)吸煙者；目前吸煙者是指目前仍吸煙者或著戒煙＜1年者。吸煙指數(shù)是指每天吸煙的包數(shù)（1包=20支）和吸煙年數(shù)的乘積。本研究獲得了蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，同時標(biāo)本采集得到了患者的知情同意。

1.2.2 免疫組化染色檢測肺鱗癌組織、鱗狀細(xì)胞不典型增生組織及癌旁組織中pSTAT3蛋白的表達(dá)

對所有石蠟包埋標(biāo)本，4 μm連續(xù)切片。石蠟切片經(jīng)脫蠟，水化，PBS沖洗，滴加一抗50 μL（陰性對照采用PBS代替一抗），4℃過夜，PBS沖洗；滴加二抗，37°C孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，蒸餾水洗，復(fù)染（蘇木精染色，1%鹽酸分化，自來水沖洗），脫水，透明，封片。采用雙盲法，由2名病理科醫(yī)師分別觀察切片。采用半定量積分法［14］判定結(jié)果，首先按照著色強(qiáng)度評分：標(biāo)本無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再按照陽性細(xì)胞在所觀察細(xì)胞中所占比例評分：陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分。每張切片最后的得分為兩次評分的乘積（1～12分），≥3分為陽性，＜3分為陰性。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 永生化人支氣管上皮細(xì)胞（immortalized human bronchial epithelial cells，BEP2D）的培養(yǎng)

由美國國立癌癥研究所Hatris教授提供，由美國哥倫比亞大學(xué)放射生物研究中心Dr.Hei TK處引進(jìn)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所朱茂祥教授饋贈。該細(xì)胞是經(jīng)人乳頭狀瘤病毒（human palilloma-viruses 18，HPV-18）轉(zhuǎn)染的正常成人支氣管上皮細(xì)胞（normal adult human bronehiall epithelia cells，NHBE），均具有無限增殖能力，但無惡性轉(zhuǎn)化的表型特征。細(xì)胞用LHC-8無血清培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞傳代時，用含0.25%胰酶和0.02%EDTANa2的PBS液消化。2 d換液1次，每5～6 d傳代。

1.3.2 CSC的提取及細(xì)胞染毒液的配制

實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HRH-SM120型單通道吸煙機(jī)，條件設(shè)定為：抽吸支數(shù)為1支，抽吸時間為20 s，抽吸周期為30 s，連接2個密封的玻璃收集管，第1管內(nèi)裝有5 mL 95%乙醇，第2管內(nèi)裝有5 mL LHC-8培養(yǎng)液，點(diǎn)煙（焦油標(biāo)識量為每支11 mg，尼古丁量為每支1.2 mg），將卷煙的主流煙氣連續(xù)導(dǎo)入玻璃收集管。按照設(shè)定的條件，連續(xù)點(diǎn)燃10支煙，待最后1支煙吸完，玻璃管內(nèi)氣體變淡以后，將2個玻璃管中的收集液混在一起，充分混勻后分裝在2 mL凍存管中，收集的CSC濃度為每支煙1 mL，作為母液放液氮中儲藏備用。

卷煙煙氣經(jīng)過95%乙醇（有機(jī)相）和LHC-8培養(yǎng)液（無機(jī)相），分別溶解煙氣中的有機(jī)和無機(jī)成分，采用LHC-8稀釋到染毒所需濃度后進(jìn)行細(xì)胞染毒，這樣CSC在一定程度上代表了主流煙氣中的主要成分［14］。

1.3.3 細(xì)胞染毒

從液氮罐中取出CSC母液，待其完全融化，用0.22 mm過濾器過濾原液后，使用LHC-8培養(yǎng)液把CSC原液分次稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度，加入待染毒細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中。在37℃，5%CO2飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，經(jīng)PBS洗滌細(xì)胞后，換用不含CSC的LHC-8培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞長滿后傳代，即完成一代細(xì)胞的染毒，每染毒10代留取細(xì)胞株，分別為第10代（P10），P20，P30，P40，P50，P60和P70。實(shí)驗(yàn)同時設(shè)BEP2D細(xì)胞（正常對照組）和乙醇5 mL·L-1處理組（乙醇對照組），共9組細(xì)胞。

1.3.4 血清抗性

常規(guī)消化指數(shù)生長期的1.3.3中9組細(xì)胞，用LHC-8培養(yǎng)液梯度稀釋成單個細(xì)胞懸液后，精確計(jì)數(shù)；分別以每皿300個細(xì)胞接種到60 mm平皿中，每組設(shè)6個平行樣，其中3個皿加入5.0 mL含10%胎牛血清的LHC-8培養(yǎng)液，另外3個皿加入5.0 mL不含血清的LHC-8培養(yǎng)液；在37℃，5%CO2和95%濕度環(huán)境下靜止培養(yǎng)6 d；終止培養(yǎng)后無水甲醇固定，姬姆薩染色，沖洗晾干后顯微鏡下計(jì)數(shù)各平皿克隆數(shù)，按下式計(jì)算接種效率：接種效率（PE）（%）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%；血清抗性= 10%血清培養(yǎng)時PE/無血清培養(yǎng)時PE。

1.3.5 錨著獨(dú)立性

利用LHC-8培養(yǎng)液配制1.4%的瓊脂糖，高溫高壓滅菌，41℃水浴鍋中保溫，加入預(yù)溫的LHC-8培養(yǎng)液將其稀釋為0.7%瓊脂糖，以每皿3 mL 0.7%瓊脂糖倒進(jìn)60 mm培養(yǎng)皿中，鋪制底層，待其凝固后備用。常規(guī)消化指數(shù)生長期1.3.3中的9組細(xì)胞，制備相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液懸液。與保溫的0.7%瓊脂糖1∶1混勻，稀釋為0.35%細(xì)胞瓊脂混合液，加在培養(yǎng)皿0.7%瓊脂糖膠上（細(xì)胞密度為每皿1.5×104），待細(xì)胞瓊脂混合液凝固后，每皿中加入2 mL LHC-8培養(yǎng)液。每組設(shè)5皿；在5%CO2，37℃和飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)，3 d換液1次；4周后鏡下計(jì)數(shù)，細(xì)胞＞50個或直徑＞75 mm的克隆數(shù)，按以下公式計(jì)算克隆形成率（clone form efficiency，CFE），CFE（%）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.3.6 RT-PCR檢測CSC誘導(dǎo)BEP2D細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中STAT3和存活蛋白mRNA表達(dá)

采用TRIZOL A+法提取細(xì)胞總RNA。按照Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以新合成的cDNA為模板，建立PCR反應(yīng)體系，STAT3 PCR反應(yīng)步驟如下：94℃3 min，（94℃30 s，53.5℃30 s，72℃25 s）×26循環(huán)，72℃10 min，4℃5 min。存活蛋白PCR反應(yīng)步驟如下：94℃3 min，（94℃30 s，53.5℃ 30 s，72℃ 25 s）×26循環(huán)，72℃10 min，4℃5 min。β肌動蛋白PCR反應(yīng)步驟如下：94℃3 min，（94℃30 s，63.2℃30 s，72℃25 s）×30循環(huán)，72℃10 min，4℃5 min。數(shù)據(jù)采用Alpha View圖像分析軟件分析。以目的條帶和β肌動蛋白吸光度值的比值表示目的基因的相對表達(dá)水平。

引物由生工生物工程有限公司合成。STAT3（86 bp）上游引物為5′-AGGAGGCGTCACTTTCACTT-3′，下游引物為5′-GCTGCTGCTTTGTG?TATGGT-3′；存活蛋白（139 bp）上游引物為5′-GCACCACTTCCAGGGTTTAT-3′，下游引物為5′-CTCTGGTGCCACTTTCAAGA-3′；β肌動蛋白（205 bp）上游引物為5′-TGACGTGGACATCCG?CAAAG-3′，下游引物為5′-CTGGAAGGTGGA?CAGCGAGG-3′。

1.3.7 Western蛋白印跡檢測CSC誘導(dǎo)BEP2D細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中STAT3，pSTAT3和存活蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解液提取全細(xì)胞蛋白。經(jīng)SDS-PAGE后半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液封閉1.5 h，加入一抗（STAT3，pSTAT3，存活蛋白，β肌動蛋白一抗用一抗稀釋液分別以1∶5000，1∶15 000，1∶7500和1∶400稀釋），4℃過夜；加山羊抗兔或鼠二抗（1∶4000），孵育90 min。ECL顯影，凝膠成像儀下照相，以β肌動蛋白為內(nèi)參，Alpha View圖像分析軟件目的條帶和內(nèi)參條帶的吸光度值，以目的蛋白和β肌動蛋白積分吸光度值比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3.8 MTT法檢測細(xì)胞存活

用胰酶消化指數(shù)生長期的CSC染毒后P70 BEP2D細(xì)胞，用LHC-8培養(yǎng)液稀釋成細(xì)胞懸液，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；以每孔6×l03細(xì)胞接種于3塊96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL，邊緣孔用PBS填充，另外設(shè)置調(diào)零孔，只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞；將培養(yǎng)板放入CO2孵箱中，在5%CO2，37℃和飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)24 h；以稀釋成不同濃度的STAT3特異性抑制劑JSI-124（0，0.25，0.5，1，1.25和5 μmol·L-1）對P70細(xì)胞分別處理24，48和72 h，每個濃度設(shè)4個平行樣，終體積保持200 μL；待每塊板JSI-124處理時間分別達(dá)到24，48和72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 g·L-1），繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去各組每孔液體，每孔加入150 μL DMSO，避光置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測定各孔吸光值（absorbance，A490nm）計(jì)算各組細(xì)胞存活抑制率。細(xì)胞存活抑制率（%）=〔1-（實(shí)驗(yàn)組A490nm-調(diào)零組A490nm）/（DMSO對照組A490nm-調(diào)零組A490nm〕×100%。

1.3.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將處于指數(shù)生長期的P70細(xì)胞分別加入JSI-124 0.5，1和5 μmol·L-1分別培養(yǎng)24，48和72 h；并分別將培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi)，1000×g離心5 min，棄上清，收集已懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞；PBS洗滌培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時，將消化終止液加入培養(yǎng)瓶中，稍混勻以終止胰酶消化；將細(xì)胞混合液加入到之前的離心管中，1000×g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)；取1×105重懸的細(xì)胞，1000×g離心5 min，棄上清，加入195 μL AnnexinⅤ-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞；再加入7 μL AnnexinⅤ-FITC，輕輕混勻；最后加入6 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫避光孵育15 min，孵育過程中可重懸細(xì)胞2～3次以改善染色效果。隨后置于冰浴中。1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)表示為x±s，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，用χ2線性趨勢檢驗(yàn)檢測組間是否存在線性關(guān)系。兩變量相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析檢測，均作雙側(cè)檢驗(yàn)。計(jì)量資料兩組之間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析，若總體均數(shù)有差異，進(jìn)行組間兩兩比較的q檢驗(yàn)。P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的界值。

2 結(jié)果

2.1 pSTAT3蛋白在鱗狀細(xì)胞不典型增生組織和肺鱗癌組織中表達(dá)及與吸煙程度的關(guān)系

圖1結(jié)果顯示，pSTAT3蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，在肺鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常支氣管上皮細(xì)胞中低表達(dá)或者不表達(dá)。表1結(jié)果顯示，pSTAT3蛋白在正常支氣管上皮組織、鱗狀細(xì)胞不典型增生組織和肺鱗癌組織中陽性表達(dá)率分別為2.7%（3/112），37.0%（40/108），55.6%（160/288），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著支氣管上皮組織癌變過程的變化，pSTAT3蛋白的表達(dá)呈逐漸增高趨勢（χ2=94.464，P＜0.05）。表2和表3結(jié)果顯示，pSTAT3蛋白在肺鱗癌中表達(dá)與吸煙狀況和吸煙指數(shù)有關(guān)（P＜0.05）。曾經(jīng)吸煙者和現(xiàn)在吸煙者中pSTAT3表達(dá)水平高于從不吸煙者（χ2=36.754，P＜0.05）。隨著吸煙指數(shù)增高，pSTAT3表達(dá)量逐漸升高（χ2=83.751，P＜0.05）。

Tab.1 Expression of pSTAT3 in normal bronchial epithelial tissue,squamous dysplasia and squamous cell car?cinoma of lungs

Tab.2Relationships between incidence of pSTAT3 protein and smoking status in patients with lung squamous cell carcinoma

Tab3.Relationships between incidence of pSTAT3 pro?tein and smoking index in patients with lung squa?mous cell carcinoma

2.2 CSC誘導(dǎo)及傳代次數(shù)對細(xì)胞血清抗性的影響

在有血清的條件下，正常對照組及乙醇對照組細(xì)胞生長明顯受抑制，而CSC誘導(dǎo)各代細(xì)胞則有更高的接種效率。同正常對照及乙醇對照組相比，P30，P40，P50，P60和P70細(xì)胞均出現(xiàn)顯著的對血清促分化能力的抗性（P＜0.05）（表4）。

Tab.4 Effect of cigarette smoke condensate（CSC）induction and times of passage on plating efficiency and resistance to serum-induced terminal differentiation

2.3 CSC誘導(dǎo)及傳代次數(shù)對細(xì)胞錨著獨(dú)立性的影響

圖2和表5結(jié)果顯示，P10和P20細(xì)胞錨著獨(dú)立性還較低，P30代以后細(xì)胞，錨著獨(dú)立性顯著升高，且所形成克隆形態(tài)明顯增大，其克隆形成率與正常和乙醇對照組比較明顯增加（P＜0.05）。

Fig.2 Effect of CSC induction and times of passage on clone morphology in soft agar（×200）.

Tab.5 Effect of CSC induction and times of passage on clone morphology in soft agar

2.4 CSC誘導(dǎo)及傳代次數(shù)對存活蛋白的mRNA水平的影響

圖3結(jié)果顯示，存活蛋白mRNA在正常對照組及乙醇對照組中不表達(dá)，在P20，P30，P40，P50，P60及P70細(xì)胞中表達(dá)呈逐漸增高趨勢。

Fig.3 Effect of CSC induction and times of passage on level of survivin mRNA.B was the semi-quantitative re?sult of A.IA：integrated absorbance.±s，n=9.*P＜0.05，com?pared with normal group；#P＜0.05，compared with alcohol group.

2.5 CSC誘導(dǎo)及傳代次數(shù)對pSTAT3和存活蛋白表達(dá)的影響

圖4結(jié)果顯示，STAT3蛋白在各組細(xì)胞中表達(dá)的總體均數(shù)無顯著性差異。STAT3磷酸化水平在正常對照組和乙醇對照組中最低，兩組之間無差異。在CSC誘導(dǎo)各組BEP2D細(xì)胞中顯著高于正常對照組和乙醇對照組（P＜0.05）。STAT3磷酸化水平在各組間隨染毒代數(shù)的增加而增加。存活蛋白在正常對照組和乙醇對照組中不表達(dá)，在P20，P30，P40，P50，P60和P70細(xì)胞中表達(dá)呈逐漸增高趨勢。

2.6 JSI-124抑制P70細(xì)胞增殖

圖5結(jié)果顯示，當(dāng)以同一濃度JSI-124處理P70細(xì)胞24，48和72 h，JSI-124對細(xì)胞的抑制率隨時間增加而增高。當(dāng)不同濃度（0.25，0.5，1.0，1.25，5.0和10 μmol·L-1）JSI-124處理P70細(xì)胞同一時間時，JSI-124對細(xì)胞的抑制率隨濃度增加而增高。說明JSI-124抑制P70細(xì)胞存活呈濃度依賴性（r24h= 0.933，P＜0.01；r48h=0.97，P＜0.01；r72h=0.968，P＜0.01；n=18）及時間依賴性，r0.25μmol·L-1=0.811，P＜0.01；r0.5μmol·L-1=0.813，P＜0.01；r1μmol·L-1=0.87，P＜0.01；r1.25μmol·L-1=0.912，P＜0.01；r5μmol·L-1=0.971，P＜0.01；r10μmol·L-1=0.97，P＜0.01；n=9）。

Fig.4 Effect of CSC induction and times of passage on expression of STAT3（A），pSTAT3（B）and survivin（C）protein.±s，n=9.*P＜0.05，compared with normal group；#P＜0.05，compared with alcohol group.

Fig.5 Effect of JSI-124 on P70 cell survival by MTT assay.±s，n=18（for different time）；n=9（for different concentration）.

2.7 JSI-124促進(jìn)P70細(xì)胞凋亡

圖6結(jié)果顯示，當(dāng)不同濃度JSI-124處理P7024h時，P70的總凋亡率分別是（6.8±0.8）%（0 μmol·L-1），（10.2±0.6）%（0.5μmol·L-1），（12.8±0.9）%（1μmol·L-1）和（17.0±1.5）%（5μmol·L-1），表明P70的總凋亡率隨處理濃度的增加而增加（P＜0.05）。圖7結(jié)果顯示，當(dāng)處理時間不同，濃度為1 μmol·L-1，P70細(xì)胞的總凋亡率分別是（6.5±0.6）%（0 h），（12.8±0.9）%（24 h），（28.2±0.8）%（48 h）和（51.2±1.3）%（72 h），表明P70的總凋亡率隨處理時間的增加而增加（P＜0.05）。說明JSI-124促進(jìn)P70凋亡呈濃度（r=0.961，P＜0.01，n=12）及時間（r=0.968，P＜0.01，n=12）依賴性。

Fig.6 Effect of JSI-124 on apoptosis of P70 treated for 24 h.

Fig.7 Effect of JSI-124 1 μmol·L-1on apoptosis of P70 for different length of time.

2.8 JSI-124對P70細(xì)胞存活蛋白和STAT3基因和蛋白表達(dá)的影響

圖8和圖9結(jié)果顯示，與正常對照組相比，JSI-124 1 μmol·L-1作用P70細(xì)胞24 h，STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)無顯著變化，但pSTAT3蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），存活蛋白mRNA及蛋白表達(dá)均下降（P＜0.05）。

Fig.8 Effect of JSI-124 on mRNA level of STAT3（A）and survivin（B）in P70 by RT-PCR.Lane 1：JSI-124 1 μmol·L-1；Lane 2：JSI-124 0 μmol·L-1.C was the semi-quanti?tative result of A and B.±s,n=3.*P＜0.05，compared with normal control（0）group.

Fig.9 Effect of JSI-124 on STAT3，pSTAT3 and survivin protein in P70 by Western blotting(A).B was the semiquantitative result of A.±s,n=3.*P＜0.05，compared with normal control（0）group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著支氣管上皮組織癌變程度增加，pSTAT3蛋白表達(dá)呈逐漸增高趨勢，在肺鱗癌組織中表達(dá)最高。提示pSTAT3在肺鱗癌發(fā)生中起著重要作用，這在食管癌和宮頸癌研究中也有類似的報(bào)道。pSTAT3表達(dá)與患者吸煙暴露密切相關(guān)。肺鱗癌中pSTAT3蛋白表達(dá)與吸煙狀態(tài)和吸煙劑量呈正相關(guān)，且曾經(jīng)吸煙者和現(xiàn)在吸煙者中pSTAT3表達(dá)均高于不吸煙者者，此外隨著吸煙指數(shù)增加其表達(dá)水平逐漸升高。結(jié)合早期研究［15］，證實(shí)了STAT3通路在煙草相關(guān)的頭頸部腫瘤中發(fā)揮至關(guān)重要作用，提示pSTAT3參與煙草誘導(dǎo)肺癌過程。

STAT3在早期胚胎發(fā)育、器官形成和許多正常組織分化中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。pSTAT3是STAT3的活化形式，具有生物學(xué)活性。有研究證實(shí)，持續(xù)活化的STAT3能促使v-Src轉(zhuǎn)染的小鼠成纖維細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，并在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤，阻斷STAT3則會阻止Src對該細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化；pSTAT3的過表達(dá)能增加乳頭狀瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［16］；在良性前列腺上皮細(xì)胞株中導(dǎo)入持續(xù)活化的STAT3基因會導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)惡性表型［17］；阻斷黑色素瘤細(xì)胞中STAT3信號能抑制該細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡［18］；說明pSTAT3在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化方面起著重要的作用。

進(jìn)一步模擬人吸煙的過程，通過有機(jī)相和無機(jī)相分別凝集濃縮煙氣中的各種化合物，建立CSC誘導(dǎo)BEP2D細(xì)胞慢性惡性轉(zhuǎn)化模型。BEP2D細(xì)胞是無血清條件下培養(yǎng)的細(xì)胞系，一般在有血清的條件下，由于血清的誘導(dǎo)分化作用，細(xì)胞總體生長狀態(tài)會受到抑制，致使細(xì)胞接種效率下降［19］。由于CSC對細(xì)胞遺傳性狀的作用，CSC誘導(dǎo)細(xì)胞對血清的誘導(dǎo)分化作用呈現(xiàn)明顯的抗性，因此可在含血清培養(yǎng)液中生長。本研究中CSC誘導(dǎo)細(xì)胞隨著誘導(dǎo)代數(shù)增加血清抗性增強(qiáng)，提示轉(zhuǎn)化細(xì)胞對環(huán)境的選擇性和依賴性逐漸降低，生存能力增加，逐步具有轉(zhuǎn)化的趨勢。錨著獨(dú)立實(shí)驗(yàn)是檢測在低密度條件下所轉(zhuǎn)化細(xì)胞在半固體瓊脂上形成克隆的能力，是評價轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生癌變程度的重要標(biāo)準(zhǔn)［20］。由于具有錨著獨(dú)立性生長能力，轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞間通訊及血清的依賴性降低，能在低密度條件下在半固體瓊脂上形成克隆。此外，轉(zhuǎn)化干細(xì)胞在軟瓊脂中的生長能力較為接近細(xì)胞在體內(nèi)實(shí)際的生長狀態(tài)（表現(xiàn)立體空間結(jié)構(gòu)），因此也是轉(zhuǎn)化細(xì)胞能否在體內(nèi)接種生長的一種反映。本研究中CSC誘導(dǎo)細(xì)胞隨轉(zhuǎn)化代數(shù)增加錨著獨(dú)立性增高。值得一提的是P30細(xì)胞以后，錨著獨(dú)立性顯著升高，且所形成克隆形態(tài)明顯增大，P70細(xì)胞最為明顯，說明CSC誘導(dǎo)細(xì)胞具備了一定的惡性化趨勢。在CSC誘導(dǎo)BEP2D細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，與細(xì)胞對照組相比，CSC染毒組STAT3的表達(dá)無明顯差異，而STAT3隨細(xì)胞染毒代數(shù)升高而逐漸升高，提示STAT3活化是煙草誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞癌變的早期事件，抑制pSTAT3活性可能是一種預(yù)防煙草相關(guān)肺癌的有效策略。

JSI-124作為高選擇性JAK/STAT3抑制劑，具有易穿過細(xì)胞膜和酪氨酸激酶抑制功能［21］。有研究證明，JSI-124能直接有效地抑制STAT3磷酸化水平，阻斷JAK/STAT3信號傳導(dǎo)［22］。本研究選取細(xì)胞惡性表型較為明顯的P70作為對象，使用JSI-124觀察其對細(xì)胞生物學(xué)特性及相關(guān)基因的影響。

JSI-124抑制P70細(xì)胞增殖、促進(jìn)P70細(xì)胞凋亡，均呈時間及濃度依賴性。作為IAP家族最強(qiáng)的凋亡抑制因子，存活蛋白在分化成熟的正常組織中均不表達(dá)，而在絕大部分惡性腫瘤中高表達(dá)［23］，被認(rèn)為是個重要的潛在腫瘤預(yù)測因子。本研究在CSC誘導(dǎo)BEP2D細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)現(xiàn)，存活蛋白在正常對照組和乙醇對照組中均不表達(dá)，在P10，P30，P40，P50，P60和P70細(xì)胞中表達(dá)逐漸升高，P70細(xì)胞最高，顯示細(xì)胞抗凋亡能力隨著染毒代數(shù)增加而增強(qiáng)。抑制pSTAT3可顯著降低存活蛋白基因及蛋白水平的表達(dá)。說明在CSC誘導(dǎo)BEP2D細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，STAT3信號調(diào)控存活蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

綜上所述，STAT3信號通過調(diào)控存活蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，參與煙草誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果為闡明吸煙誘發(fā)肺癌的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為高危人群的早期干預(yù)提供靶點(diǎn)。

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STAT3 signaling pathway participates in malignant transformation of Immortalized human bronchial epithelial cells induced by cigarette smoke condensate

YUAN Na-na1，2，LI Wei1，CHEN Yu-qing1，ZHANG Jia-xiu1，HONG Lei1，JIANG Peng1，ZHOU Ji-hong3，WANG Xiao-jing1，ZHU Mao-xiang4，PAN Xiu-jie4，YANG Zhi-hua4，GU Yong-qing4
（1.Department of Respiratory Disease，the First Affiliated Hospital，Provincial Key Laboratory of Respiratory Disease in Anhui，3.Department of Biochemistry and Molecular Biology，Bengbu Medical Colloge，Bengbu 233004，China；2.Department of Respiratory Disease，No.2 People′s Hospital of Fuyang，F(xiàn)uyang 236015，China；4.Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTIVE To detect the expression of pSTAT3 protein in lung specimens of squa?mous cell carcinoma，squamous dysplasia and normal bronchial epithelial tissues，analyze the rela?tionship between its expression and smoking，and to explore the role of STAT3 signaling in the process of lung cancer induced by smoking.METHODS pSTAT3 protein expression was assessed by immunohistochemistry in 288 samples of lung specimens of squamous cell carcinoma，108 samples of squamous dysplasia and 112 samples of normal bronchial epithelial tissues.The relationship between its expression and smoking was analyzed.Immortalized human bronchial epithelial cells induced by CSC were divided to 9 groups.Malignant transformation was assessed by resistance to serum-induced terminal differentiation and anchorage-independence growth.pSTAT3 protein expression was detected by Western blotting.The proliferation and apoptosis of P70 treated with JSI-124 0.25-10 μmol·L-1were explored by MTT assay and flow cytometry，respectively.Survivin expression in P70 treated with JSI-124 was detect?ed by reverse transcription PCR and Western blotting，respectively.RESULTS Expression of pSTAT3 protein showed a significant upward trend from normal bronchial epithelial tissues were compared to squamous dysplasia and lung specimens of squamous cell carcinoma.pSTAT3 expression wa closely relate to the smoking exposure of patients.With the increase in transformation generation，the resis?tance to serum-induced terminal differentiation and anchorage-independence growth were enhanced，especially after P30.pSTAT3 protein expression in normal untreated control and alcohol-treated control groups had no significant difference.pSTAT3 protein expression in BEP2D induced by CSC was higher than that in the two control groups（P＜0.05）and their expression increased gradually with the increase in transformation generation.JSI-124 inhibited proliferation and promoted apoptosis in a concentrationand time-dependent manner.The expression of survivin mRNA and protein in P70 treated with JSI-124 1 μmol·L-1was significantly higher than that in DMSO group（P＜0.05）.CONCLUSION STAT3 signaling may participate in the malignant transformation of human bronchial epithelial cells induced by tobacco by inhibiting apoptosis of cells through regulation of survivin.

STAT3；cigarette smoke condensate；immortalized human bronchial epithelial cells

CHEN Yu-qing，E-mail：bbmccyq@126.com

R994.6

A

1000-3002-（2016）11-1182-10

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.11.009

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81172213）；Natural Science Foundation of Anhui Province（1408085MH14）；Key Laboratory Performance Assessment Subsidy Program of Anhui Province（1506c085013）；Key Project of Natural Science Research Project in Higher Education of Anhui（KJ2016A487）；and Key Laboratory Project on Department of Science and Technology of Anhui Province（12010402127）

2015-12-28接受日期：2016-07-04）

（本文編輯：喬 虹）

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81172213）；安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（1408085MH14）；安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室績效考核補(bǔ)助項(xiàng)目（1506c085013）；安徽省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2016A487）；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（12010402127）

袁娜娜，女，碩士研究生，住院醫(yī)師，主要從事煙草相關(guān)肺癌研究。

陳余清，E-mail：bbmccyq@126.com