徐 朝，顧偉楨，鄧建平，許啟泰，許 君

（1.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南 鄭州450002；2.海南綠檳榔科技發(fā)展有限公司，海南萬寧 571500）

藥物親和反應的靶點穩(wěn)定性技術(shù)及其應用研究進展

徐 朝1，顧偉楨1，鄧建平2，許啟泰2，許 君1

（1.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南 鄭州450002；2.海南綠檳榔科技發(fā)展有限公司，海南萬寧 571500）

藥物靶標是指存在于組織細胞內(nèi)與藥物相互作用，并賦予藥物效應的特定分子，＞98%藥物靶標為蛋白質(zhì)。藥物與細胞內(nèi)靶標相互作用，是藥物發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。如何綜合運用多種研究方法發(fā)現(xiàn)和確證藥物作用新靶標是目前研究者面臨的重要挑戰(zhàn)。藥物親和反應的靶點穩(wěn)定性（DARTS）技術(shù)是根據(jù)小分子藥物與其靶標蛋白結(jié)合后導致對蛋白酶敏感性下降而發(fā)展起來的一項新技術(shù)，由于無需藥物保護性修飾且無藥物活性依賴性，因此可廣泛應用于藥物篩選與靶標鑒定。本文對DARTS技術(shù)的發(fā)現(xiàn)、技術(shù)原理及方法要點和應用進行綜述。

藥物親和反應的靶點穩(wěn)定性；藥物篩選；靶標鑒定；蛋白酶

藥物篩選是發(fā)現(xiàn)有效治療人類疾病藥物的基礎(chǔ)，而藥物靶標的發(fā)現(xiàn)和驗證是新藥研發(fā)的第一步，也是藥物篩選及藥物定向合成成敗的關(guān)鍵因素之一［1-2］。小分子藥物除能解除疾病給人們帶來的痛苦，提高健康水平之外，也在社會經(jīng)濟發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。這類進入細胞與特定的靶標分子結(jié)合、借助靶標分子起到特定防治作用，是藥物發(fā)揮作用的基礎(chǔ)［3-6］。此外，小分子藥物在病毒性疾病的治療中占據(jù)很重要的地位［6-7］。親和色譜、同位素示蹤法和紫外及熒光光譜等物理學或化學技術(shù)在藥物靶標尋找與鑒定中發(fā)揮重要作用［8］。但隨著對藥物研發(fā)要求的不斷提高，新藥研發(fā)與藥物靶標研究正面臨挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)的藥物篩選方法和藥物靶標鑒定技術(shù)亟待創(chuàng)新［9］。近年來，隨著基因組學［10］、蛋白質(zhì)組學［11-13］及生物信息學［14-15］等多項技術(shù)的應用和發(fā)展，先后出現(xiàn)了多種研究技術(shù)相結(jié)合的一些新技術(shù)。藥物親和反應的靶點穩(wěn)定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）技術(shù)就是新近發(fā)現(xiàn)的一項用于小分子藥物篩選及靶標尋找的新技術(shù)［16］。

1 DARTS技術(shù)的發(fā)現(xiàn)

DARTS的概念最初于2009年提出，根據(jù)基因啟動子研究中特異性的DNA結(jié)合位點與其相應的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后具有抗DNA酶降解這一特性，Lomenick等［16］推測藥物與靶標蛋白結(jié)合后可能使靶標具有蛋白酶抗性，并以K506結(jié)合蛋白12為研究對象，用兩種與之具有較強結(jié)合活性的免疫抑制劑他克莫司（普樂可復，tacrolimus，F(xiàn)K506）和西羅莫司（雷帕霉素，sirolimus，Rapamycin），將枯草桿菌（Bacillus subtilis）蛋白酶作為工具酶，證實了他們的推測。同時，這一推測又在低特異性藥物E4與雷帕霉素靶分子（mammalian target of rapamy?cin，mTOR）相互作用后具有抗嗜熱菌蛋白酶降解中得到證實。由此開啟了DARTS在藥物篩選和靶標鑒定的研究。

2 DARTS技術(shù)中常用的蛋白酶

DARTS反應體系中加入合適濃度的蛋白酶是該技術(shù)操作的關(guān)鍵點之一。目前報道的可應用于DARTS技術(shù)的蛋白酶主要有3類，分別是枯草桿菌蛋白酶［16］、嗜熱菌（B.kaustophilus）蛋白酶［17-19］和鏈酶菌（streptomyces）蛋白酶［6，20-23］。

2.1 枯草桿菌蛋白酶

枯草桿菌蛋白酶是最早從枯草芽孢桿菌中得到的一系列絲氨酸蛋白酶混合體，在一定條件下，通過活性位點絲氨酸殘基對肽鍵的親核進攻而快速地催化蛋白質(zhì)的水解，分子質(zhì)量為20～45 ku。此外，其他一些芽孢桿菌如解淀粉芽孢桿菌（B.amylo?liquefaciens）等也可分泌該蛋白酶。目前，該枯草桿菌蛋白酶廣泛應用于化工、醫(yī)藥和釀造等多個領(lǐng)域。由于其具有較強的蛋白水解活性且成分復雜，并要求堿性條件下操作，在DARTS中受到限制，后逐漸被嗜熱菌蛋白酶和鏈霉菌蛋白酶所取代。

2.2 嗜熱菌蛋白酶

嗜熱菌蛋白酶是由嗜熱細菌產(chǎn)生的一種具有低切割活性的胞外耐高溫金屬蛋白酶，結(jié)構(gòu)中有4個Ca2+，鈣和鋅為酶的輔因子，可水解蛋白N端疏水性氨基酸殘基，pH 5.0～9.5保持穩(wěn)定活性，最佳反應溫度為70℃，最適作用pH 8.0［17，24］。該酶僅能對非折疊狀態(tài)的蛋白多肽鏈進行有效切割，由于可產(chǎn)生短片段的一系列多肽，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸序列測定。在DARTS實驗中，嗜熱菌蛋白酶可在標準反應條件下水解細胞的多種蛋白，但在小分子與非靶標蛋白結(jié)合后其穩(wěn)定性大大提高，不利于降解，需更換為鏈酶菌蛋白酶。

2.3 鏈霉菌蛋白酶

鏈霉菌蛋白酶是從灰色鏈霉菌（S.griseus）中分離到的一種絲氨酸酶和酸性蛋白酶的胞外蛋白酶混合物，可特異性地切割折疊和非折疊態(tài)蛋白和多肽鏈的天冬氨酸和谷氨酸的羧基側(cè)肽鍵［25］，在中性pH下具有較強活性。在新型藥物靶標篩選實驗中，是DARTS技術(shù)發(fā)明者優(yōu)先推薦使用的蛋白酶。

3 DARTS操作流程

DARTS實驗的具體過程并不復雜，在蛋白酶水解細胞裂解前后，都需要一些特定的方法或技術(shù)檢測蛋白酶解效果，在實際操作中常借助一種甚至多種蛋白質(zhì)研究技術(shù)，如較為常用的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和考馬斯亮藍凝膠染色，以及蛋白二維電泳2D-PAGE、凝膠或非凝膠質(zhì)譜（gel-based or gel-free MS-based pro?teomics）和親核色譜等。現(xiàn)以哺乳動物細胞裂解的DARTS為例，具體操作技術(shù)路線見圖1。

3.1 主要試劑的準備

DARTS是一項較為靈敏的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)，對實驗條件的要求較高，實驗中的一些關(guān)鍵試劑的選擇尤為重要，蛋白酶、細胞裂解液和緩沖液的選擇和使用是決定DARTS是否成功的關(guān)鍵因素。為了保證實驗體系的穩(wěn)定性，最好采用商品化的緩沖液，如M-PER裂解緩沖液，適用于多種細胞系的小分子結(jié)合鑒定實驗，其他的如以NP-40溫和變性劑為成分的非變性裂解液也可用，要盡量避免使用含有強變性劑的RIPA裂解液。同時，反應中最好含有合適的蛋白酶抑制劑防止細胞裂解液自身降解。

圖1 利用藥物親和反應的靶點穩(wěn)定性技術(shù)鑒定細胞裂解液中藥物靶標的技術(shù)路線.

3.2 細胞收集和裂解

將培養(yǎng)好的細胞用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2～3次，然后加入預冷的M-PER緩沖液（含有磷酸化酶和蛋白酶抑制劑），用細胞刮鏟將細胞輕輕刮下，置于預冷的離心管內(nèi)上下顛倒幾次，混勻后于冰上靜置裂解10 min。

3.3 制備細胞裂解液

將預冷的細胞液于18 000×g低溫高速離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，按比例加入酶蛋白反應緩沖液，如鏈酶菌蛋白酶需含有鈣離子的TNC緩沖液（Tris 50 mmol·L-1，NaCl 140 mmol·L-1，CaCl210 mmol·L-1），用牛血清白蛋白測定試劑盒測定裂解液的蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)蛋白質(zhì)濃度，吸取適當裂解液，將裂解液蛋白質(zhì)濃度調(diào)整為4～6 g·L-1，然后將裂解液平分為2份。

3.4 藥物與裂解液孵育結(jié)合

對照管中加入二甲亞砜，藥品管中加入合適濃度的小分子藥物，混勻后于室溫結(jié)合1 h，或低溫過夜結(jié)合。

3.5 蛋白酶解

預先配好蛋白酶儲存液（10 g·L-1），臨用前用TNS稀釋至適當濃度（根據(jù)蛋白酶與裂解液中總蛋白質(zhì)的比例如1∶100，1∶1000和1∶2000等稀釋）。將每組樣品分為5份，每份樣品均留1/2作為非酶解對照，按比例加入蛋白酶后，用計時器精確計時1～30 min，30 min后加入20倍蛋白酶抑制劑或直接加入蛋白膠上樣緩沖液終止反應，將反應管置于冰上或放入開水中煮沸。

3.6 結(jié)合蛋白的鑒定

需依據(jù)實驗要求采用SDS-PAGE和Western蛋白質(zhì)印跡等多種方法檢測并鑒定結(jié)合蛋白。

4 DARTS技術(shù)在藥物靶標鑒定中的應用

4.1 抗癌藥物及其靶標研究

4.1.1 乳腺癌

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2（Her-2）均為陰性的乳腺癌，臨床上只能采用放療和化療。Robinson等［12］采用高通量篩選方法，從3185種化合物中篩選出雙硫侖（戒酒硫，disnlfiram）具有抑制多種TNBC細胞生長的作用。DARTS實驗結(jié)果揭示了其直接作用靶標為含IO基序的GTP酶激活蛋白1和肌球蛋白重鏈9。

4.1.2 直腸癌

葡萄籽提取物（grape seed extract，GSE）具有多種生物學活性。Derry等［26］利用人結(jié)直腸癌細胞（human colorectal cancer cells，CRC），采用DARTS技術(shù)與液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chroma?tography-mass spectrometry，LC/MS）和MASCOT（蛋白質(zhì)質(zhì)譜）數(shù)據(jù)分析方法，分析了GSE可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白導致翻譯相關(guān)蛋白的整體下調(diào)，并強烈抑制磷脂酰肌醇3-激酶-mTOR信號通路。

4.1.3 哌嗪類藥物抗癌機制研究

Kost等［18］利用DARTS技術(shù)和同位素標記法證實哌嗪類（piperazines）小分子RX-5902可通過與Y593磷酸化的p68 RNA解旋酶結(jié)合，從而下調(diào)了β-鏈蛋白信號通路中c-myc、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）和p-c-jun等一系列基因的表達，進而抑制癌細胞的生長，揭示了其抗癌效應的分子機制。

4.2 細胞自噬相關(guān)研究

4.2.1 α-酮戊二酸作用靶標研究

α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）是三羧酸循環(huán)中的重要的代謝中間產(chǎn)物。Chin等［23］發(fā)現(xiàn)，α-KG可延長線蟲的壽命；DARTS實驗結(jié)果顯示，α-KG的作用靶標為ATP合成酶的β亞基，α-KG與ATP酶亞基結(jié)合后，其ATP合成能力下降，減少了氧的消耗，增加了實驗中線蟲和哺乳動物細胞的自噬作用，揭示了α-KG這一關(guān)鍵代謝物介導長壽的機制。

4.2.2 二氯乙酸鹽作用靶標研究

二氯乙酸鹽（dichloroacetate，DCA）是丙酮酸脫氫酶的抑制劑。近來發(fā)現(xiàn)其有望作為無毒的抗腫瘤藥物，但具體機制仍不明確。Gong等［19］研究表明，DCA可誘導LoVo細胞自噬體的形成，將DARTS技術(shù)與電噴霧液質(zhì)聯(lián)用四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜并用，表明DCA可通過組織蛋白酶D和硫氧還蛋白樣蛋白1（thioredoxin-like protein 1）導致活性氧不正常聚集，以及自噬作用最重要的負性調(diào)控通路Akt-mTOR受到抑制。

4.3 抗病毒藥物作用靶標研究

Fleta-Soriano等［21］發(fā)現(xiàn)一種黏細菌代謝產(chǎn)物Ratjadone A具有體外抑制人免疫缺陷病毒HIV感染的作用，并采用DARTS技術(shù)分析其作用靶標。結(jié)果顯示，ratjadone A可通過結(jié)合核輸出蛋白1/染色體區(qū)域穩(wěn)定蛋白1（CRM1/Exportin1）從而抑制CRM1-蛋白表達調(diào)節(jié)因子-病毒顆粒蛋白表達調(diào)節(jié)因子（CRM1-Rev-ES）復合物的形成，干擾了CRM1/Exportin1對蛋白表達調(diào)節(jié)因子（Rev）蛋白中亮氨酸富集區(qū)信號的識別，從而抑制了HIV非剪接或部分剪接的mRNA基因組的核輸出。

5 結(jié)語

DARTS技術(shù)作為一種藥物篩選和靶標研究具有極其重要的意義，在生物醫(yī)學研究方面具有較好的應用前景。未來與之相關(guān)的研究將會融合基因組學、蛋白質(zhì)組學、色譜及質(zhì)譜等相關(guān)技術(shù)，在蛋白降解組學、反應條件研究和新藥篩選等多個方面開展，也必將有大批的科研成果出現(xiàn)。

［1］Zhou TT，Zeng HH，Qiu DW.Advance in methods of small molecular drug target discovery［J］.Curr Biotechnol（生物技術(shù)進展），2011，01（1）：38-44.

［2］Zhou W，Wang YH，Lu AP，Zhang G.Systems pharmacology in small molecular drug discovery［J］.Int J Mol Sci，2016，17（2）：246.

［3］Tsuji A.Small molecular drug transfer across the blood-brain barrier via carrier-mediated transport systems［J］.NeuroRx，2005，2（1）：54-62.

［4］Smith TK， Young BL，Denton H，Hughes DL，Wagner GK.First small molecular inhibitors ofTry?panosoma bruceidolicholphosphate mannose syn?thase（DPMS），a validated drug target in African sleeping sickness［J］.Bioorg Med Chem Lett，2009，19（6）：1749-1752.

［5］Grünberger C，Wyles DL，Kaihara KA，Schooley RT. 3-Drug synergistic interactions of small molecular inhibitors of hepatitis C virus replication［J］.J Infect Dis，2008，197（1）：42-45.

［6］Karpus WJ，Reynolds N，Behanna HA，Watterson DM.Inhibition of experimental autoimmune enceph?alomyelitis by a novel small molecular weight proin?flammatory cytokine suppressing drug［J］.J Neuro?immunol，2008，203（1）：73-78.

［7］Zeng XY，Lu L，Jiang SB，Liu SW.Small molecular agents againstMERS-CoV infection［J］.Acta Pharm Sin（藥學學報），2015，50（12）：1520-1526.

［8］Chen GQ，Xu YB，Guo M.Innovative drugs and drug targets:Opportunities and Challenges［J］.Foreign Med Sci Physiol Pathol Clin Med（國外醫(yī)學·生理、病理科學與臨床分冊），2004，24（3）：205-207.

［9］Guo ZR.Drug innovation and reverse thinking［J］.Acta Pharm Sin（藥學學報），2016，51（3）：325-331.

［10］Hoon S， Smith AM，Wallace IM，Suresh S，Miranda M，F(xiàn)ung E，et al.An integrated platform of genomic assays reveals small-molecule bioactiviti［J］.Nat Chem Biol，2008，4（8）：498-506.

［11］Huang J，Zhu H，Haggarty SJ，SpringDR，Hwang HA，Snyder M，et al.Finding new compo?nents of the target of Rapamycin（TOR）signaling network through chemical genetics and proteome chips［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（47）：16594-16599.

［12］Robinson TJ，Pai M，Liu JC，Vizeacoumar F，Sun T，Egan SE，et al.High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breastcancercells Interaction with IQ motifcontaining factors［J］.Cell Cycle，2013，12（18）：3013-3024.

［13］Geng Y，Deng ZP.Application of proteomics to screening biomarkers of drug-induced liver injury［J］.Chin J Pharmacol Toxicol（中國藥理學與毒理學雜志），2016，30（4）：381-388.

［14］Jiang Z，Zhou Y.Using bioinformatics for drug target identification from the genome［J］.Am J Pharmacogenom，2005，5（6）：387-396.

［15］Haag N,Velk K,McCune T,Wu C.Bioinformatics and molecular biological characterization of a hypo?thetical protein SAV1226 as a potential drug target formethicillin/vancomycin-Staphylococcus aureusinfections［J］.World Acad Sci Eng Technol，2015，9(6):587-591.

［16］Lomenick B，Jung G，Wohlschlegel JA，Huang J. Target identification using drug affinity responsive target stability（DARTS）［J］.Curr Protoc Chem Biol，2011，3（4）：163-180.

［17］Conejerolara F，Mateo PL.Presence of a slow dimerization equilibrium on the thermal unfolding of the 205-316 thermolysin fragment at neutral pH［J］.Biochemistry，1996，35（11）：3477-3486.

［18］Kost GC，Yang MY，Li LW，Zhang YW，Liu CY，Kim DJ，et al.A novel anti-cancer agent，1-（3，5-dimethoxyphenyl）-4-〔（6-fluoro-2-methoxyquinoxalin-3-yl）aminocarbonyl〕piperazine（RX-5902），inter?feres with-catenin function through Y593 phosphop68 RNA helicase［J］.J Cell Biochem，2015，116（8）：1595-1601.

［19］Gong F，Peng X，Sang Y，Qiu M，Luo C，He Z，et al.Dichloroacetate induces protective autophagy in LoVo cells：involvement of cathepsin D/thioredoxinlike protein 1 and Akt-mTOR-mediated signaling［J］.Cell Death Dis，2013，4：e913.

［20］Kobet RA,Pan X,Zhang B,Pak SC,Asch AS，Lee MH.A model system for anti-cancer drug discovery and therapeutic targe tidentification［J］.Biomol Ther（Seoul），2014，22（5）：371-383.

［21］Fleta-Soriano E， Martinez JP， Hinkelmann B，Gerth K，Washausen P，Diez J，etal.The myxobacterial metabolite ratjadone A inhibits HIV infection by blocking the Rev/CRM1-mediated nuclear export pathway［J］.Microb Cell Fact，2014，13：17.

［22］Chin RM，F(xiàn)u XD，Pai MY，Vergnes L，Hwang H，Deng G，et al.The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR［J］.Nature，2014，510（755）：397-401.

［23］Lomenick B，Olsen RW，Huang J.Identification of direct protein targets of small molecules［J］.ACS Chem Biol，2011，6（1）：34-46.

［24］Inouye K，Lee SB，Tonomura B.Effect of amino acid residues at the cleavable site of substrates on the remarkable activation of thermolysin by salts［J］.Biochem J，1996，315（Pt 1）：133-138.

［25］Bauer CA,L?fqvist B.Studies of the heterogeneity ofStreptomyces griseusprotease.Isolation and char?acterization of an alkaline serine protease from commercial pronase-P derived fromStreptomyces griseusK1［J］.Acta Chem Scand，1973，27（9）：3147-3166.

［26］Derry MM，Somasagara RR，Raina KA，Gomez J，Patel M，Agarwal RA.Target identification of grape seed extract in colorectal cancer using drug affinity responsive target stability（DARTS）tech?nique：role of endoplasmic reticulum stress response proteins［J］.Curr Cancer Drug Targets，2014，14（4）：323-336.

Drug affinity responsive target stability and its application：review

XU Zhao1，GU Wei-zhen1，DENG Jian-ping2，XU Qi-tai2，XU Jun1
（1.School of Life Sciences，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；2.Hainan Green Areca Technology Development Co.，Ltd，Wanning 571500，China）

A drug target refers to specific molecules that exist within tissue cells and interact with a drug to produce the drug effect.More than 98%of drug targets belong to protein.The interactions between a drug and the target in cells play a key role in the drug effect.How to use various methods to find and confirm the new target of a drug is one of the important challenges facing researchers.Drug affinity responsive target stability（DARTS）is a new technique based on the principle that when a small molecule compound binds to a protein，the interaction stabilizes the target protein′s structure so that it becomes protease resistant.This technique is universally applicable to drug screening and target identification because it requires no modification of the drug and is independent of the mechanism of drug action.This paper reviews the discovery of DARTS method，technical principles，methodology and its applications in researches.

drug affinity responsive target stability；drug screening；target identification；protease

XU Jun，E-mail：xujun0828@126.com，Tel：（0371）63555790

R966

A

1000-3002-（2016）11-1225-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.011.015

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（31201332）；Scientific and Technological Project of Henan Province（112300410088）；Scientific and Technological Project of Henan Province（112102310324）；Scientific and Technological Project of Henan Province（132102310033）；and Natural Science Fund Guidance Program Education of Bureau of Henan Province（12B230007）

2016-06-01 接受日期：2016-11-04）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學基金（31201332）；河南省科技攻關(guān)項目（112300410088）；河南省科技攻關(guān)項目（112102310324）；河南省科技攻關(guān)項目132102310033）；河南省教育廳自然基金指導計劃（12B230007）

徐朝，碩士研究生，主要從事病毒以及抗病毒機理的研究。

許 君，E-mail：xujun0828@126.com，Tel：（0371）63555790