禹良國，王崇高，陸志斌，蔡華忠，徐三榮

（1江蘇建康職業(yè)學(xué)院，2南京市浦口區(qū)中心醫(yī)院，江蘇南京211800；3江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江212001）

維拉帕米對梗阻性黃疸大鼠肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探討

禹良國1，王崇高2，陸志斌2，蔡華忠3，徐三榮3

（1江蘇建康職業(yè)學(xué)院，2南京市浦口區(qū)中心醫(yī)院，江蘇南京211800；3江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江212001）

目的：探討梗阻性黃疸時大鼠肝組織細(xì)胞凋亡與NF-κB表達(dá)的變化，并研究維拉帕米對大鼠肝臟損傷的保護(hù)作用.方法：選取80只雄性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（Sham組）、膽總管結(jié)扎組（BDL組）、膽總管結(jié)扎后不同劑量維拉帕米干預(yù)組（BDL＋V1－3組），分別于術(shù)后第7天、14天將大鼠處死，比較各組大鼠肝組織中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量的變化、細(xì)胞凋亡及NF-κB P65蛋白的表達(dá)，以及血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的變化.結(jié)果：各維拉帕米干預(yù)組MDA低于BDL組而SOD高于BDL組，維拉帕米可不同程度下調(diào)肝組織NF-κB的表達(dá)，并減輕細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性.結(jié)論：鈣通道阻滯劑維拉帕米可減輕梗阻性黃疸大鼠肝損害，NF-κB的活化可能是介導(dǎo)肝臟功能損害的重要因素.

維拉帕米；梗阻性黃疸；核因子-κB；細(xì)胞凋亡；肝損傷

0 引言

梗阻性黃疸（obstructive jaundice，OJ）是一種較為普遍的外科疾病，其會引起肝臟等機(jī)體各系統(tǒng)器官發(fā)生損害以及一系列的病理生理改變.有報道［1－3］表明，梗阻性黃疸患者有較高的死亡率和術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率，這主要與其內(nèi)促炎細(xì)胞因子的過度釋放、毒素血癥以及氧化應(yīng)激等密切相關(guān).肝組織核因子-κB（NF-κB）能高效參與誘導(dǎo)，可高效誘導(dǎo)參與TNF-α、IL-6、iNOS以及自由基等免疫和炎癥反應(yīng)的炎癥介質(zhì)［4］，在多種免疫炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起核心作用［5］.本研究以自制梗阻性黃疸大鼠模型作為研究對象，探討梗阻性黃疸時大鼠肝組織細(xì)胞凋亡與NF-κB表達(dá)的變化，并研究維拉帕米對大鼠肝臟損傷的保護(hù)作用，現(xiàn)報道如下.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組選取江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心80只體重為250～300 g的健康雄性SD大鼠作為研究對象，將其通過隨機(jī)分組的方法分成5組：假手術(shù)組（Sham組），膽總管結(jié)扎組（BDL組），膽總管結(jié)扎后腹腔注射1 mg維拉帕米干預(yù)組（BDL＋V1組），2 mg維拉帕米組（BDL＋V2組），5 mg維拉帕米組（BDL＋V3組），每組16只.

1.2 動物模型的建立大鼠在可自由飲水的條件下，禁食12 h后進(jìn)行手術(shù)，麻醉方法為腹腔注射氯胺酮，劑量為100 mg/kg，在無菌環(huán)境中取上腹部正中縱切口進(jìn)腹，用3－0號絲線在膽總管完全游離進(jìn)行雙重結(jié)扎，結(jié)間橫斷膽總管后逐層關(guān)腹.Sham組大鼠不進(jìn)行結(jié)扎和切斷，只游離膽總管.

1.3 處理方法BDL＋V1－3組動物模型建立后第1天直至處死，分別給予維拉帕米（美國Sigma公司）1、2、5 mg/kg，腹腔注射.其余兩組則同期給予等量生理鹽水，腹腔注射.分別于給藥后第7天、14天將動物處死（n＝8），下腔靜脈采血，留存血清備用；將大鼠右葉肝組織，部分置于4%多聚甲醛溶液固定，其余迅速置液氮再轉(zhuǎn)存－70℃深低溫冰箱.

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 肝臟組織病理學(xué) 將固定好的肝臟組織常規(guī)石蠟包埋，HE染色制片后于光鏡下觀察.

1.4.2 肝功能測定 通過全自動生化分析儀（日本Olympus AU2700）檢測大鼠血清各項(xiàng)肝功能指標(biāo)包括總膽紅素（TB）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）以及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）.

1.4.3 肝組織MDA和SOD的檢測 取1.3方法下制備的大鼠肝組織200 mg，通過內(nèi)切式勻漿機(jī)制備成10%肝組織勻漿（重量體積比加生理鹽水），離心后取組織勻漿上清按說明書進(jìn)行檢測.MDA、SOD測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所.

1.4.4 NF-κB P65蛋白的表達(dá)的檢測 選擇的方法為免疫組化Envision二步法，空白對照為以PBS代替一抗.兔抗大鼠NF-κB P65多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司），Envision試劑盒（丹麥Dako公司）.取1.3項(xiàng)下制備的肝組織（4%多聚甲醛固定），進(jìn)行石蠟包埋后切片.根據(jù)光鏡所見，陽性信號為細(xì)胞核和/或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒.每張切片隨機(jī)取5個高倍鏡不重復(fù)視野，計算陽性細(xì)胞百分率.1.4.5 TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，以PBS代替一抗.凋亡細(xì)胞在光鏡下細(xì)胞核中棕黃著色.每例切片計數(shù)5個400倍視野，凋亡指數(shù)（AI）為平均每100個細(xì)胞核中含凋亡細(xì)胞個數(shù).

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，計量資料用±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理學(xué)改變根據(jù)肉眼觀察，除Sham組外，其余各組大鼠第7天、14天處死后，肝臟均呈黃褐色，且明顯腫大，膽總管近端出現(xiàn)顯著擴(kuò)張，且張力較大.根據(jù)光鏡所見，BDL組大鼠第7天標(biāo)本出現(xiàn)小膽管增生，匯管區(qū)改變明顯，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，第14天標(biāo)本小膽管增生明顯，部分區(qū)域肝細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死；BDL＋V1－3組大鼠肝臟病理改變較BDL組輕；Sham組大鼠則無顯著肝臟病理改變.

2.2 各組大鼠肝功能指標(biāo)變化情況比較Sham組的血清TB水平顯著低于BDL＋V1－3組和BDL組；BDL組的7 d、14 d血清ALT和AST水平均顯著高于BDL＋V1－3組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）.

表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)的變化（n＝16，±s）

表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)的變化（n＝16，±s）

bP＜0.01 vs Sham組；aP＜0.05 vs BDL組，dP＜0.01 vs BDL組.

組別TB（ummol·L－1）ALT（U·L－1）AST（U·L－1）Sham組7 d4.28±1.1041.13±11.00146.75±25.19 14 d3.09±0.8737.50±11.82143.25±27.05 BDL組7 d179.83±16.99b171.88±21.61b758.25±33.35b14 d173.65±32.10b164.75±36.96b802.13±35.87bBDL＋V1組7 d167.25±20.65b145.75±19.30bd617.75±45.57bd14 d171.61±23.03b144.62±29.86b763.88±26.00baBDL＋V2組7 d164.50±21.06b139.50±20.58bd618.63±32.62bd14 d169.84±22.58b143.63±32.40b763.63±26.47baBDL＋V3組7 d165.55±20.90b137.50±18.65bd601.13±39.83bd14 d170.06±19.35b140.63±30.81b759.25±26.37ba

2.3 各組大鼠肝組織MDA及SOD含量變化情況比較Sham組的血清MDA含量明顯低于其它各組，但SOD含量明顯高于其它各組；但在BDL＋V1－3組7 d、BDL＋V2－3組14 dMDA含量低于BDL組；而在BDL＋V2－3組7 d、BDL＋V1－3組14 dSOD含量高于BDL組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）.

2.4 肝組織NF-κB P65蛋白表達(dá)及凋亡指數(shù)比較

Sham組肝組織僅出現(xiàn)少量淡黃色細(xì)胞胞漿，未發(fā)現(xiàn)胞核著色；BDL組胞漿染色加深，為棕黃色，且出現(xiàn)胞核著色；BDL組NF-κB P65蛋白在7 d和14 d的表達(dá)均顯著高于BDL＋V1－3組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3）.

表2 各組大鼠肝組織MDA及SOD含量變化情況比較（n＝16，±s）

表2 各組大鼠肝組織MDA及SOD含量變化情況比較（n＝16，±s）

aP＜0.05 vs Sham組，bP＜0.01 vs Sham組；cP＜0.05 vs BDL組，dP＜0.01 vs BDL組.

組別MDA（nmoL/mgprot）SOD（U/mgprot）Sham組7 d1.94±0.58198.90±26.04 14 d1.88±0.24205.71±24.52 BDL組7 d4.36±0.82b141.95±25.04b14 d5.63±1.49b118.29±14.96bBDL＋V1組7 d3.33±0.66bc169.26±24.00a14 d4.46±0.97b137.09±12.77bcBDL＋V2組7 d3.25±0.72bd170.49±30.55ac14 d4.45±1.05bc139.51±12.72bcBDL＋V3組7 d3.22±0.66bd173.36±27.30ac14 d4.36±0.98bc143.62±11.90bc

表3 各組大鼠肝臟NF-κB P65蛋白表達(dá)及凋亡指數(shù)比較（n＝16，±s）

表3 各組大鼠肝臟NF-κB P65蛋白表達(dá)及凋亡指數(shù)比較（n＝16，±s）

bP＜0.01 vs Sham組；aP＜0.05 vs BDL組，dP＜0.01 vs BDL組.

組別NF-κB P65蛋白AI Sham組7 d5.13±0.923.25±1.04 14 d4.30±1.393.88±1.36 BDL組7 d15.48±3.27b32.63±5.80b14 d21.45±3.58b41.63±5.78bBDL＋V1組7 d12.18±3.23ba25.88±5.77ba14 d17.23±2.86bd36.75±5.68baBDL＋V2組7 d11.53±3.11bd25.50±4.81bd14 d16.95±3.17bd35.88±5.44baBDL＋V3組7 d11.45±2.60bd25.13±4.94bd14 d16.28±3.23bd33.75±6.16bd

2.5 肝細(xì)胞凋亡的檢測Sham組僅出現(xiàn)少量凋亡肝細(xì)胞，其余各組均出現(xiàn)大量凋亡肝細(xì)胞；但BDL組凋亡肝細(xì)胞顯著高于BDL＋V1－3組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表3）.

2.6 NF-κB P65蛋白的表達(dá)與凋亡指數(shù)相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果表明，梗阻性黃疸大鼠肝組織NF-κB p65蛋白的表達(dá)與細(xì)胞凋亡正相關(guān)（7 d：r＝0.733，P＜0.01；14 d：r＝0.679，P＜0.01）.

3 討論

NF-κB作為一種廣泛存在于多種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，嚴(yán)重影響著機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng).NF-κB在非激活狀態(tài)下主要存在于胞漿中，其存在形式為與其抑制蛋白IκB結(jié)合成三聚體復(fù)合物.當(dāng)其受到外界因素包括細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激以及細(xì)菌產(chǎn)物等刺激時被激活，然后進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致相關(guān)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄［4］.正常情況下肝細(xì)胞中無活性NF-κB存在，但在肝枯否細(xì)胞中可以檢測到NF-κB.相關(guān)研究［6－7］報道中指出，在肝枯否細(xì)胞中，NF-κB最初被激活，但是如果肝細(xì)胞受到白介素和腫瘤壞死因子等刺激，引起其NF-κB活性增強(qiáng).相關(guān)研究［8－9］報道，梗阻性黃疸時肝臟的炎性損傷與NF-κB及其下游調(diào)控的炎癥因子的高表達(dá)密切相關(guān).

梗阻性黃疸時肝臟損害的重要特征為肝細(xì)胞的凋亡，而細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制尚未充分闡明.目前的研究認(rèn)為，梗阻性黃疸時細(xì)胞凋亡可能受到多種因素包括促炎細(xì)胞因子、氧自由基、線粒體功能障礙及胞內(nèi)鈣超載等的影響［5，10］.目前臨床上治療梗阻性黃疸及其圍手術(shù)期護(hù)理的主要內(nèi)容為提高患者肝功能，避免肝細(xì)胞發(fā)生凋亡.Han等［11］報道表明，肝細(xì)胞凋亡在梗阻性黃疸早期開始出現(xiàn)，且其數(shù)量隨著黃疸的加重而顯著上升，但由于梗阻性黃疸后期患者的凋亡調(diào)控機(jī)制被激活，同時肝臟纖維組織出現(xiàn)增生，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸下降.細(xì)胞凋亡是梗阻性黃疸肝損害發(fā)生和發(fā)展變化的重要機(jī)制之一，同時其可能是梗阻性黃疸時肝臟損害的早期事件.

Hoesel等［4］報道表明，NF-κB參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的具體機(jī)制尚未十分明確，但其能夠調(diào)控多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，能夠起到抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的雙重作用.Kucharczak等［12］報道因活化的NF-κB在不同時間、不同部位組成不同的二聚體，能夠調(diào)控其相應(yīng)靶基因以及轉(zhuǎn)錄相應(yīng)蛋白質(zhì)，所以能夠在細(xì)胞凋亡的最終效應(yīng)中起到雙重作用，同時可能還受到同時激活的其他轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞環(huán)境及外界刺激物種類等因素的影響.

正常機(jī)體內(nèi)會有少量不同種類自由基產(chǎn)生，其中具有活性的氧自由基是作用最為廣泛的一種.Aliomrani等［13］報道表明，氧自由基在患者發(fā)生膽道梗阻的早期就參與進(jìn)來.Badger等［14］報道，膽道梗阻時細(xì)胞內(nèi)、外活性氧量上升，其能夠使細(xì)胞生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，同時能夠激活NF-κB，最終導(dǎo)致炎癥蛋白基因以及促炎細(xì)胞因子的過度表達(dá)，這又能促進(jìn)活性氧的生成形成正反饋環(huán)，進(jìn)而使肝臟組織的炎性損傷加重.相關(guān)研究［15－16］報道表明，谷胱甘肽（GSH）、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）以及超氧化物歧化酶（SOD）等能夠通過抑制氧自由基的生成來實(shí)現(xiàn)抑制NF-κB活性的目的，同時還能抑制IL-1β和IL-6基因的表達(dá).

生理情況下，鈣離子在細(xì)胞內(nèi)外存在巨大的濃度差，此為其信息傳遞的物質(zhì)基礎(chǔ).如果細(xì)胞內(nèi)Ca2＋的釋放增加或者細(xì)胞外Ca2＋發(fā)生內(nèi)流，則胞漿Ca2＋濃度會上升，此時細(xì)胞即被激活.Collage等［17－18］報道細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)被打破是細(xì)胞發(fā)生炎性損傷的重要機(jī)制之一，Ca2＋活動在各種炎癥以及免疫性疾病的發(fā)生中起著非常重要的作用.研究［19－21］報道梗阻性黃疸引起的多種損傷因素如內(nèi)毒素血癥、缺血、缺氧以及氧化應(yīng)激等均能導(dǎo)致肝細(xì)胞出現(xiàn)ATP缺乏，胞膜受損，Ca2＋發(fā)生非正常跨膜內(nèi)流，最終出現(xiàn)胞漿內(nèi)鈣超載現(xiàn)象.肝細(xì)胞、枯否細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞均可出現(xiàn)鈣超載現(xiàn)象.維拉帕米是一種鈣通道阻滯劑，其作用的發(fā)生依賴于L型電壓，其減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載的機(jī)制主要為與鈣通道α亞單位兩個不同的位點(diǎn)相結(jié)合，使通道蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，最終實(shí)現(xiàn)阻滯胞外Ca2＋內(nèi)流的目的.

本研究結(jié)果顯示，梗阻性黃疸時，活性氧以及丙二醛的含量上升，但是抗氧化酶SOD含量下降；大量肝組織NF-κB被激活，同時凋亡肝細(xì)胞數(shù)量上升，兩者呈正相關(guān).腹腔注射不同劑量的維拉帕米后，ALT、AST、肝組織NF-κB P65蛋白及細(xì)胞凋亡較BDL組均顯著下降，其下降程度與維拉帕米劑量相關(guān).這提示維拉帕米能夠通過抑制梗阻性黃疸時肝組織NF-κB的激活，降低肝臟損害程度.細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)及氧化/抗氧化等平衡狀態(tài)被打破可能與NF-κB和細(xì)胞凋亡的變化密切相關(guān).因鈣通道阻滯劑能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，所以能夠避免活性氧的生成、調(diào)控NF-κB.同時，Steffan等［22］報道細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度與IκB的降解呈正相關(guān)，鈣通道阻滯劑能夠通過避免IκB的降解，來實(shí)現(xiàn)抑制NF-κB活化轉(zhuǎn)位的目的.

綜上所述，NF-κB的激活在梗阻性黃疸時肝臟等器官損害的多種致病機(jī)制中起到紐帶的作用［23］，其持續(xù)、過度的激活能夠增加肝臟損傷及各種并發(fā)癥的發(fā)生率.將抑制NF-κB的表達(dá)與及早解除消除梗阻性黃疸始動環(huán)節(jié)結(jié)合起來，能夠提高膽道梗阻患者的臨床療效，改善患者的預(yù)后.

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Protective effect and mechanism of verapamil on liver injury of obstructive jaundice rats

YU Liang-Guo1，WANG Chong-Gao2，LU Zhi-Bin2，CAI Hua-Zhong3，XU San-Rong3

1Jiangsu Jiankang Vocational College，2Nanjing Pukou Central Hospital，Nanjing 211800，China；3Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang 212001，China

AIM：To investigate the role of NF-κB and apoptosis in liver injury of rats with obstructive jaundice and the protective effect of verapamil.METHODS：A total of 80 SD male rats were randomly divided into Sham group，BDL group and BDL＋V1－3group，with 16 rats in each group.The rats were sacrificed at 7th and 14th day after operation，then the changes of MDA and SOD in hepatic tissue，hepatic NF-κB activities and cell apoptosis，ALT and AST of each group were compared.RESULTS：Compared with BDL group，lower MDA and higher SOD were found in different dose of verapamil group，verapamil can down-regulate the expression of NF-κB and reduce the apoptosis at different levels，presenting dose dependence.CONCLUSION：The activation of NF-κB may be one of the most important factors in liver injury.Verapamil can protect against the liver injury in rats with obstructive jaundice through reducing the expression of NF-κB and cell apoptosis.

verapamil；obstructive jaundice；NF-κB；apoptosis；liver injury

R96

A

2095-6894（2016）12-07-04

2016－10－22；接受日期：2016－11－10

南京市科技發(fā)展計劃項(xiàng)目（201402061）；南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金項(xiàng)目（2012NJMU236）

禹良國.碩士，主治醫(yī)師.研究方向：普通外科的基礎(chǔ)與臨床.E-mail：yu_lg＠126.com