文|鄭美麗（北京市畜牧總站）

豬GPS2基因的克隆及表達(dá)分析

文|鄭美麗（北京市畜牧總站）

G蛋白途徑抑制因子2（G-protein pathway suppressor,GPS2）是近年來新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，是一種多功能蛋白質(zhì)，參與了多個細(xì)胞的進(jìn)程，能夠抑制酵母中由于G-蛋白信號通路持續(xù)激活引起的死亡。目前，GPS2基因的研究領(lǐng)域主要分布在人、小鼠等。在人的領(lǐng)域，有最新研究表明GPS2基因調(diào)控細(xì)胞核中的基因表達(dá)。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)GPS2在細(xì)胞膜水平上負(fù)調(diào)控腫瘤壞死因子-α激活(TNF-α)的信號級聯(lián)反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。他們發(fā)現(xiàn)增加GPS2的水平會損害細(xì)胞對TNF-α的反應(yīng)，降低炎癥反應(yīng)。鑒于此信息，研究人員分析假如脂肪組織中有更多GPS2的話，是否有助于降低肥胖患者胰島素抵抗的發(fā)展。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中的胰島素信號被大大改善。然而在核中過表達(dá)的GPS2對肝功能也有負(fù)面影響。另外其研究表明GPS2在減輕炎癥反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)功能。這些研究結(jié)果揭示了一個針對2型糖尿病和代謝綜合征等疾病治療的潛在的新方向。本實(shí)驗(yàn)則是基于實(shí)驗(yàn)室前期全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）工作，篩選出GPS2基因，針對目前GPS2基因的研究成果，考慮到該基因可能與豬的脂肪沉積有所關(guān)聯(lián)，因而進(jìn)行初步的基因克隆和序列分析，并研究其在長白豬種的不同組織表達(dá)情況差異，從而確定該基因是否對豬的脂肪沉積有確定的規(guī)律性影響，為后期的深入工作做探索。

GPS2；基因克隆；序列分析；熒光定量PCR

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料。所選品種為長白豬，樣品為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳資源實(shí)驗(yàn)室群體樣品中隨機(jī)抽取。選取樣品為脂肪、肌肉、心、肝、脾、肺、腎、腦。

2.實(shí)驗(yàn)方法。

（1）RNA的提取和cDNA的合成。利用動物組織總RNA提取試劑盒，分別對長白豬的脂肪、肌肉、心、肝、脾、肺、腎、腦的樣品進(jìn)行了mRNA的提取，通過NANODROP2000濃度測定儀測定RNA溶液濃度，并檢測其提取質(zhì)量。利用瓊脂糖凝膠電泳的方法進(jìn)一步檢測所提取的mRNA溶液的質(zhì)量。利用提取的mRNA，進(jìn)行cDNA的合成，試劑盒為第一鏈合成試劑盒（去基因組）。

（2）CDS區(qū)的克隆測序及結(jié)構(gòu)分析。通過PCR克隆測序技術(shù)，得到GPS2基因的CDS區(qū)，引物序列為：F: TAAGCTAGCGGAGAAAGCGACGAGAAGAC；R: CGAATTCCTGGGAGCGAGGTTGATAGAC；退火溫度為58℃。對擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接轉(zhuǎn)化后，提取質(zhì)粒，送到測序公司進(jìn)行測序，從而得到GPS2基因的CDS區(qū)序列。然后利用ProtParam（http://web.expasy.org/ protparam/）、Jpred（http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/index.html）、Robetta（http://robetta.bakerlab. org/）等軟件及平臺，對其進(jìn)行初步的結(jié)構(gòu)分析。

（3）GPS2基因的表達(dá)分析。根據(jù)GPS2基因的CDS區(qū)序列，設(shè)計引物，進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，引物序列為F：TCAGAGCACCTTCGGCATTT；R: AGCCAGTTTGTTGGTTAGCG；退火溫度為60℃，退火時間為10秒，測定GPS2基因在長白豬不同組織的表達(dá)情況并分析。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.GPS2基因的CDS區(qū)序列。本實(shí)驗(yàn)通過對GPS2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一明亮條帶（圖1）。將產(chǎn)物回收純化并連接轉(zhuǎn)化后，測序并將所得到的無載體序列與NCBI上序列比對分析，獲得了豬GPS2基因的CDS區(qū)準(zhǔn)確序列（圖2）。

◎圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

◎圖2 GPS2基因的CDS區(qū)序列測定結(jié)果

2.GPS2基因的一級結(jié)構(gòu)分析。ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）軟件能檢索蛋白質(zhì)序列理化參數(shù)，包括分子質(zhì)量、理化等電點(diǎn)、氨基酸組成、原子組成、半衰期等，GPS2基因的CDS區(qū)所對應(yīng)氨基酸序列見圖3。通過軟件分析其一級結(jié)構(gòu)。

3.GPS2基因的二級結(jié)構(gòu)分析。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指氨基酸殘基形成的α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲及模體等組件。二級結(jié)構(gòu)是通過骨架上的羰基和酰胺基團(tuán)之間形成的氫鍵維持的。各種蛋白質(zhì)依其一級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在其多肽鏈的不同區(qū)段可形成不同的二級結(jié)構(gòu)。Jpred（http://www. compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/index. html），由Barton Group創(chuàng)建于1998年，應(yīng)用Jnet神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，平均準(zhǔn)確率達(dá)到81%。通過登陸此二級結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)器，分析得到GPS2基因蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，預(yù)測該蛋白在21～26、31～77、83～125、128、169～171、236～240、272～276區(qū)域可能為α螺旋結(jié)構(gòu)；在129～131、146～151、163～164區(qū)域可能為β折疊結(jié)構(gòu)（圖4）。

4.GPS2基因的三級結(jié)構(gòu)分析。在一些較小的蛋白質(zhì)分子中一般只具有單結(jié)構(gòu)域，這時，其三級結(jié)構(gòu)就是它的結(jié)構(gòu)域。在較大的蛋白質(zhì)分子中，則由兩個或者多個相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)與組合并折疊成在空間上可明顯區(qū)分的三維結(jié)構(gòu)。Robetta（http:// robetta.bakerlab.org/）是由華盛頓大學(xué)baker實(shí)驗(yàn)室開放和維護(hù)的網(wǎng)絡(luò)計算平臺，用于非商業(yè)性的ab initio 和比較建模，提供自動化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果。通過該平臺得到蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)構(gòu)（圖5）。

5.GPS2基因在長白豬不同組織的表達(dá)分析。利用實(shí)時熒光定量PCR對心、肝、脾、肺、腎、肌肉、腹脂、腦各組織的GPS2基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測，以目的基因和內(nèi)標(biāo)基因的比值作為目的基因的表達(dá)量，得到表達(dá)結(jié)果（圖6），發(fā)現(xiàn)在長白豬不同組織中，GPS2基因在腹脂中表達(dá)量顯著高于其他組織。

◎圖3 GPS2基因的CDS區(qū)所對應(yīng)的氨基酸序列

◎圖4 JalView二級結(jié)構(gòu)圖形結(jié)果

◎圖5 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

◎圖6 GPS2基因在各組織中的表達(dá)檢測

三、討論

本實(shí)驗(yàn)共分為三個部分：GPS2基因的克隆、序列分析及不同組織的表達(dá)分析。其中，通過克隆GPS2基因，測得該基因CDS區(qū)序列，為序列的分析提供了材料，此外，由于PCR擴(kuò)增過程中選擇了高保真酶，減少了堿基的突變，增加了所得序列的可信度。將所測得的序列與NCBI上查找的豬GPS2基因預(yù)測序列比較，相似性達(dá)到97%。分析蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)并預(yù)測二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，從預(yù)測結(jié)構(gòu)來看，本研究所克隆的豬GPS2基因的CDS區(qū)序列可靠性較高，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)最后部分對該基因進(jìn)行了熒光定量PCR，長白豬是優(yōu)良的外來品種，生長速度快，脂肪沉積能力弱，但繁殖性能低下。因此，試驗(yàn)以長白豬為實(shí)驗(yàn)樣品，通過熒光定量PCR方法，研究GPS2基因在不同組織間的表達(dá)差異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GPS2基因在脂肪中的表達(dá)量顯著高于其他組織，因此初步推斷GPS2基因可能與豬的脂肪沉積有一定聯(lián)系，但由于目前GPS2基因在豬上的研究進(jìn)展較少，并且，實(shí)驗(yàn)?zāi)壳叭灾皇蔷窒抻诜肿铀?，不具備有力的?shí)驗(yàn)證據(jù)，因此，究竟GPS2基因是否與豬脂肪沉積有一定聯(lián)系，其中具體的機(jī)制又是如何，還需后期大量實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步探索。