何 芳，盧金霞，馮 峰，周學章，2＊

（1.寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川750021；2.寧夏智弘生物科技有限公司，銀川750021）

奶牛乳房炎白色念珠菌的分離鑒定及生物學特性研究

何 芳1，盧金霞1，馮 峰1，周學章1，2＊

（1.寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川750021；2.寧夏智弘生物科技有限公司，銀川750021）

摘 要：試驗旨在了解寧夏地區(qū)奶牛真菌性乳房炎的發(fā)生情況，為診斷和治療真菌性奶牛乳房炎提供有效依據(jù)。采集寧夏周邊地區(qū)各奶牛場使用抗生素治療無效的乳房炎奶樣，對奶樣中的真菌進行分離鑒定，并對分離菌進行生物學特性研究。通過選擇性培養(yǎng)基從乳房炎奶樣中獲得真菌，進一步應(yīng)用生物化學和分子生物學手段鑒定出樣品中的真菌為白色念珠菌。通過溶血性、磷脂酶活性及產(chǎn)膜等方面的研究，證實其具有不同毒力，分離菌株對試驗動物有較強的致病性。同時，采用藥敏紙片法對分離株進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，菌株對臨床常用抗生素耐藥，對臨床常用抗真菌藥物敏感。結(jié)果表明，寧夏地區(qū)真菌性乳房炎奶樣中分離出的致病菌均為白色念珠菌，感染率為43%，分離株具有較強的毒力，對常用抗生素耐藥，對抗真菌藥物和中藥敏感。

關(guān)鍵詞：白色念珠菌；乳房炎；致病性；溶血性

隨著廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，奶牛真菌性乳房炎呈上升趨勢，真菌性乳房炎多由白色念珠菌引起，主要由被白色念珠菌污染的灌注導管、注射器或經(jīng)多次乳房灌注引起［1］。白色念珠菌是一種人畜共患的深部條件致病性真菌，具有較強的毒力和致病性。其毒力主要表現(xiàn)為對環(huán)境變化的適應(yīng)性、對宿主細胞的黏附作用及分泌胞外磷脂酶、分泌型酸性蛋白酶等水解酶。研究發(fā)現(xiàn)白色念珠菌產(chǎn)生的胞外磷脂酶能分解宿主細胞的膜磷脂，使宿主細胞膜通透性增加、完整性受損，從而促進白色念珠菌的入侵。溶血素是白色念珠菌在感染過程中的另一毒力因子，能使病原微生物破壞亞鐵血紅素提取鐵元素的能力，這種破壞能力在感染過程中非常重要［2］。

正常情況下，奶牛乳腺中的正常菌群能對真菌的生長繁殖產(chǎn)生抑制作用，使用抗生素治療能將細菌殺滅但白色念珠菌生長更旺盛。尤其連續(xù)長期使用抗生素或聯(lián)合使用抗生素治療更有利于白色念珠菌的感染，從而造成乳腺菌群失調(diào)，導致真菌感染［3－4］。因此，真菌性乳房炎常繼發(fā)于抗生素治療不當?shù)募毙约毦匀榉垦祝矣捎诒淮_診時已使用抗生素，給后續(xù)治療帶來極大困難，此類奶牛通常面臨淘汰，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。此外，由于白色念珠菌具有很強的形成生物膜的能力，增強了病原微生物抵抗宿主免疫反應(yīng)的能力，很大程度上減弱了抗菌藥物的治療效果，易造成持續(xù)性感染［5］。研究結(jié)果表明，白色念珠菌形成生物膜后，比其浮游狀態(tài)對抗真菌藥物的耐藥能力增強30～2 000倍。目前，人醫(yī)臨床上常用的抗真菌藥物5－氟胞嘧啶（FC）、伊曲康唑（ITC）、特比奈芬（TER）、兩性霉素B（AMB）等對白色念珠菌具有較好的抗菌能力，但這些藥物不能應(yīng)用于獸醫(yī)臨床。在奶牛乳房炎的治療方面，國內(nèi)外普遍使用抗生素進行乳房灌注的給藥治療方式，由于藥物使用特點及擠奶、用藥消毒不嚴格等因素，對抗生素治療無效的頑固性乳房炎越來越多。

獸醫(yī)臨床尚無抗真菌的乳房灌注制劑，在治療奶牛真菌性乳房炎和基礎(chǔ)研究方面尚處于空白。本試驗研究白色念珠菌對藥物的敏感性、毒力與致病性，以期為及時準確給出治療方案、研制新型乳房灌注劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1樣品及試驗動物

無菌采集抗生素治療無效或反復發(fā)作的病牛奶樣23份，臨床檢查時發(fā)現(xiàn)乳房發(fā)紅腫脹、變硬，乳汁異常，產(chǎn)奶量顯著降低，有時出現(xiàn)水樣乳或血樣乳。將乳房進行消毒，棄去頭3把奶，隨機采集病牛4個乳區(qū)的混合奶樣10mL，并做好標記。人源白色念珠菌標準株SC5314由寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院實驗中心惠贈。33只體重20g±2g清潔級小鼠由寧夏醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.2培養(yǎng)基與試劑

孟加拉紅培養(yǎng)基、玉米吐溫瓊脂培養(yǎng)基、TTC－沙堡羅培養(yǎng)基、糖發(fā)酵基礎(chǔ)肉湯均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；脫纖維羊血培養(yǎng)基購自江萊生物科技有限公司；環(huán)丙沙星、青霉素、慶大霉素均購自中國藥品生物制品檢定所；雙黃連由寧夏智弘生物科技有限公司提供；5－氟胞嘧啶（FC）、伊曲康唑（ITC）、特比奈芬（TER）、兩性霉素B（AMB）均購自Sigma公司；XTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

蛋黃瓊脂培養(yǎng)基配制：分別稱取6.36g NaCl、0.06g CaCl2、4g葡萄糖、1.0g蛋白胨、1.8g瓊脂粉溶于100mL蒸餾水，高壓滅菌，冷卻至55℃左右，加入20mL經(jīng)巴氏消毒的無菌蛋黃［6］。

菌液制備：無菌生理鹽水將待檢菌株制成菌懸液，用麥氏比濁儀調(diào)整至2個麥氏單位。

1.3病原菌的分離與鑒定

1.3.1病原菌的初步分離 將無菌采集的23份奶樣先接種于LB液體培養(yǎng)基和馬丁氏液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)24～48h后，接種于TTC－沙堡羅培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48～72h后，分別進行美藍染色和革蘭氏染色，鏡檢，初步確定真菌感染的奶樣，并斜面4℃保存待用。

1.3.2生化鑒定試驗 將疑似真菌的待檢菌株及白色念珠菌標準株（濃度調(diào)整為1×105CFU／mL）分別接種于葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和半乳糖生化反應(yīng)管（小試管內(nèi)預先套有倒置的杜氏小管，在糖發(fā)酵基礎(chǔ)肉湯中分別加入葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和半乳糖，使各類糖的最終濃度為0.5%）。在37℃條件下培養(yǎng)24h，觀察各試管顏色變化及杜氏小管中有無氣泡。

1.3.3PCR擴增試驗 PCR反應(yīng)的特異性引物是根據(jù)白色念珠菌ITS1－ITS2部分的保守序列設(shè)計［7］，引物序列：上游引物：5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′；下游引物：5′－GCT－GCGTTCTTCATCGATGC－3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20μL：2×PCR緩沖液10μL，上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，蒸餾水補至20μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預變性5min；94℃變性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃延伸7min。反應(yīng)完成后，取5μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.4芽管和厚膜孢子形成試驗 接種環(huán)蘸取待鑒定菌落（濃度調(diào)整為1×105CFU／mL）接種于0.5mL的胎牛血清中，渦旋混勻器振蕩3min后，于濕盒中37℃孵育2～3h，取出1滴滴于載玻片上，鏡檢是否有芽管形成，牙管是在酵母相轉(zhuǎn)變?yōu)榫z相過程中形成的，是轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【臉酥荆?］。取適量玉米吐溫瓊脂培養(yǎng)基置于潔凈玻片上，將待檢菌株水平方向穿刺接種，置潮濕平皿中，25℃孵育24～48h，鏡檢厚膜孢子形成情況。

1.4分離菌株的毒性鑒定試驗

1.4.1磷脂酶活性檢測及判定 在蛋黃瓊脂培養(yǎng)基上輕輕放置6mm的無菌濾紙片，滴加6μL菌液于濾紙片上，37℃培養(yǎng)72h。白色念珠菌SC5314菌株為對照菌株。透射光下，濾紙片附近可觀察到界限清晰的白色致密沉淀環(huán)。磷脂酶活性（PZ值）＝菌落直徑／總直徑（菌落＋沉淀環(huán)）。PZ值的大小與酶活性成反比，將PZ值分類：0＜PZ≤0.50為高活力，0.51≤PZ≤0.74為中等活力，0.75≤PZ≤0.99為低活力，PZ＝1者為磷脂酶陰性［9］。試驗重復3次。

1.4.2溶血性檢測及判定 菌懸液滴于羊血培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)48h。溶血性陽性的菌株可見半透明、與菌落同圓心的溶血環(huán)，測定菌落直徑和總直徑（菌落＋溶血環(huán)）。溶血指數(shù)（HI指數(shù)）＝菌落直徑／總直徑，HI值愈小，則溶血活性愈高，致病性越強［10］。對照菌株同上，試驗重復3次。

1.4.3生物膜形成能力測定 用YPD（2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖）培養(yǎng)基將保存的待檢菌株擴大培養(yǎng)后，菌液濃度調(diào)整為1×105CFU／mL，取100μL接種于96孔板，37℃培養(yǎng)48h后，棄去上清，用PBS輕輕沖洗3次，除去浮游菌。最后每孔加50μL甲基四氮鹽（XTT），37℃避光培養(yǎng)2h后，酶標儀測定波長為450nm處各個孔的值。試驗重復3次。

1.5動物致病性試驗

將小鼠隨機分成11組，每組3只。無菌生理鹽水將待檢菌株制成5×105CFU／mL的菌懸液，小鼠腹腔注射0.5mL，1次／d，連續(xù)2d。接種后每日觀察發(fā)病情況，待動物死亡或30d后處死剖檢，分別取小鼠肝臟、脾臟、腎臟、肺臟用于真菌分離培養(yǎng)。將分離出的真菌染色觀察，并進行糖發(fā)酵試驗、PCR擴增試驗與毒性試驗，以鑒定分離出的真菌是否仍為白色念珠菌及其生物學特性是否發(fā)生變化。

1.6分離菌株及標準株的藥敏試驗

選用常用抗真菌藥物FC、ITC、TER和AMB，常用抗生素環(huán)丙沙星、青霉素、慶大霉素及自制中藥雙黃連藥敏紙片進行藥物敏感性試驗，按照Kirby Bauer瓊脂擴散法進行操作，觀察抑菌圈大小。

1.7數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理。應(yīng)用One－Way ANOVA進行方差分析，統(tǒng)計顯著水平為P＜0.05，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1病原菌的分離鑒定結(jié)果

2.1.1白色念珠菌初步分離結(jié)果 只在孟加拉紅培養(yǎng)基上有菌落形成的奶樣共10個，編號為1～10。在油鏡下觀察，美藍染色為藍紫色，菌體呈圓形或橢圓形（圖1A、1B）；革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陽性單細胞真菌，菌體大小不一，呈卵圓形、橢圓形或棒狀，有芽生孢子但著色不均（圖1C、1D）。在TTC－沙堡羅培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成邊緣光滑整齊、隆起呈半球形的乳脂狀，稍有酒糟味菌落；在孟加拉紅平皿上培養(yǎng)24～48h后，菌落呈乳白色凸起，邊緣整齊的菌落。分離的病原菌染色結(jié)果、菌體形態(tài)、菌落特征均相似，符合白色念珠菌的典型特征。

圖1　白色念珠菌分離株染色結(jié)果（1 000×）Fig.1 The stain results ofCandidaalbicans（1 000×）

2.1.2生化鑒定試驗結(jié)果 37℃培養(yǎng)24h后，分離株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖和半乳糖，產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；不發(fā)酵蔗糖和乳糖，與標準株的試驗結(jié)果一致。

2.1.3PCR擴增試驗結(jié)果 由圖2可知，菌株ITS1－ITS2區(qū)域的PCR產(chǎn)物約250bp，臨床分離株擴增的條帶與標準株的條帶一致。

圖2　ITS1－ITS2區(qū)域的PCR擴增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplified product of ITS1－ITS2

2.1.4芽管和厚膜孢子形成試驗結(jié)果 經(jīng)濕盒37℃孵育2～3h后，鏡檢發(fā)現(xiàn)有芽管形成（圖3A）。潮濕平皿中，25℃孵育24～48h后，美藍染色鏡檢發(fā)現(xiàn)在玉米吐溫瓊脂培養(yǎng)基上有厚膜孢子形成（圖3B～3D）。

圖3　芽管和厚膜孢子形成試驗結(jié)果（1 000×）Fig.3 The results of germ tube and chlamydospores tests（1 000×）

2.2毒性鑒定試驗結(jié)果

2.2.1磷脂酶活性及溶血性測定結(jié)果 由表1可知，白色念珠菌分離株HI值為0.69±0.03，標準株SC5314的HI值為0.42±0.03，可見分離株的溶血性顯著低于標準株（P＜0.05）。分離株P(guān)Z值為0.57±0.08，標準株SC5314的PZ值為0.61± 0.04，可見白色念珠菌的分離株具有較高的磷脂酶活性，但與標準株相比無顯著差異（P＞0.05），表明白色念珠菌具有較強的毒力和致病性。

表1　酶活測定試驗結(jié)果Table 1 The results of the determination of enzyme activity

2.2.2生物膜形成能力測定結(jié)果 在96孔板上構(gòu)建生物膜，采用XTT減低法觀察白色念珠菌分離株及標準株的成膜能力，結(jié)果見表2。由表2可知，白色念珠菌具有較強的形成生物被膜的能力，各個分離株的成膜能力差異較大。

表2　白色念珠菌生物膜形成能力測定結(jié)果Table 2 The result of biofilm－forming abilities

2.3動物致病性試驗結(jié)果

注射白色念珠菌的小鼠于第10～12天死亡，剖檢可見腎臟、肝臟等器官有白色小肉芽腫狀的病灶。分別取肝臟、脾臟、腎臟和肺臟等組織作真菌分離培養(yǎng)，經(jīng)染色鏡檢、糖發(fā)酵試驗和PCR擴增試驗鑒定分離得到的真菌仍是白色念珠菌，且毒性與原分離株相比幾乎無變化。

2.4藥敏試驗結(jié)果

兩性霉素B、特比奈芬、雙黃連對病原菌具有較好的抗菌活性，可以作為抗真菌首選藥物。病原菌對5－氟胞嘧啶、伊曲康唑中度敏感。環(huán)丙沙星、青霉素、慶大霉素對病原菌的抑菌效果不理想，甚至無抑菌作用。具體結(jié)果見表3。

表3　藥敏試驗結(jié)果Table 3 The result of drug sensitive tests

3 討 論

寧夏周邊牧場經(jīng)抗生素治療無效的奶樣感染情況復雜，有細菌和真菌的單獨感染，也有二者的混合感染。凌丁等［11］調(diào)查發(fā)現(xiàn)奶牛的病原菌感染也以混合感染為主。本試驗調(diào)查結(jié)果顯示，寧夏周邊地區(qū)真菌性奶牛乳房炎為白色念珠菌感染，感染率為43%。賈玉萍等［12］研究發(fā)現(xiàn)，山東部分地區(qū)個體養(yǎng)殖戶奶牛奶樣的真菌感染陽性率為19.3%，規(guī)?；B(yǎng)殖場真菌感染陽性率為7.62%，都明顯低于寧夏地區(qū)的真菌感染率。畜主長期使用抗生素及糖皮質(zhì)激素類藥物后，大多數(shù)細菌被抑制或殺死，但仍有耐藥性細菌生存。此外，由于治療過程中的無菌操作不規(guī)范，不潔凈的醫(yī)療器具上所攜帶的白色念珠菌感染乳腺組織，形成生物膜后，抗藥性可增強10～1 000倍，加劇真菌感染［13－14］。根據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，寧夏周邊許多養(yǎng)殖場（戶）在臨床用藥時只依據(jù)以往經(jīng)驗，選擇廣譜抗生素或聯(lián)合使用抗生素治療奶牛乳房炎，而不通過藥敏試驗測試出療效最佳的藥物，從而導致真菌性乳房炎的發(fā)病率不斷上升，奶牛的淘汰率逐漸升高，形成惡性循環(huán)，給養(yǎng)殖場帶來巨大的經(jīng)濟損失。此外，本研究發(fā)現(xiàn)白色念珠菌分離株的溶血性弱于人源標準株，分離株磷脂酶活性與標準株接近。但分離株的溶血性和磷脂酶活性都要弱于口腔來源的人源分離株，提示人源的病原菌傳播速度更快，臨床上更普遍，人源白色念珠菌致病性更強［15－18］。

藥敏試驗結(jié)果表明，AMB、TER等抗真菌藥物對分離株殺菌效果極好，但常見的抗生素幾乎無效，這與張園［19］研究結(jié)果一致。目前，獸醫(yī)臨床上還沒有專用的乳房灌注類抗真菌藥物，只能使用抗生素和中藥。本研究發(fā)現(xiàn)中藥雙黃連對分離株的殺菌效果明顯。有研究證實許多具有殺菌抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用的中藥確有療效，且毒性低、無抗藥性和藥物殘留［20］。同時，中藥的使用也可避免耐藥菌的出現(xiàn)，防止超級細菌通過乳汁感染人。另外，也避免了牛奶中殘留的抗生素引發(fā)人體超敏反應(yīng)的可能［21］。有研究表明，中草藥制劑不僅對隱性乳房炎有較好的療效，還能在一定程度上提高產(chǎn)奶量［22］。因此，快速準確地診斷病原微生物，對減少經(jīng)濟損失、指導臨床用藥具有重要意義。同時，本研究發(fā)現(xiàn)白色念珠菌分離株具有很強的形成生物膜的能力，在治療奶牛乳房炎時，嚴格按照要求對醫(yī)療器械消毒，注意無菌操作顯得尤為重要。在飼養(yǎng)過程中加強預防措施，如定期進行乳房炎檢測、淘汰慢性乳房炎奶牛、加強擠奶衛(wèi)生管理等［23］。

4 結(jié) 論

本試驗通過研究23份抗生素治療無效病牛奶樣，發(fā)現(xiàn)白色念珠菌感染率為43%。白色念珠菌分離株的溶血性、磷脂酶活性和成膜能力都較強，分離株只對中藥和抗真菌藥物敏感。因此，在治療奶牛乳房炎的過程中建議先查清楚病原，并盡量選取合適的中藥，避免盲目使用抗生素治療。

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（責任編輯 董曉云）

中圖分類號：S858.23

文獻標識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3356－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.040

收稿日期：2016－05－16

基金項目：國家自然科學基金項目（31660728）

作者簡介：何 芳（1991－），女，江蘇連云港人，碩士生，研究方向：獸醫(yī)藥理學，E－mail：837800131＠qq.com

通信作者：＊周學章（1969－），男，寧夏銀川人，博士，教授，碩士生導師，研究方向：獸醫(yī)藥理學，E－mail：zhouxuezhang＠nxu.edu.cn

Isolation，Identification and Analysis of Biological Characteristics ofCandidaalbicansin Bouine Mastitis

HE Fang1，LU Jin－xia1，F(xiàn)ENG Feng1，ZHOU Xue－zhang1，2＊
（1.KeyLaboratoryofMinistryofEducationforProtectionandUtilizationofSpecial BiologicalResourcesinWesternChina，NingxiaUniversity，Yinchuan750021，China；2.NingxiaZoohanceBiotechCo.，Ltd.，Yinchuan750021，China）

Abstract：The study was aimed to learn the infection of dairy cows with fungi in Ningxia and take effective measures to prevent and control the fungi infection.Milk samples were collected from dairy cows that did not respond to antibiotics in Ningxia，fungi in milk samples were separated and identified，and the biological characteristics of isolated bacteria were analyzed.Milk samples infected by fungus were screened out using fungal selective medium.The yeast pathogen was shown to beCandidaalbicansby biochemistry and molecular biology methods.Determination of enzyme activity and biofilm－forming tests confirmed that it had different levels of virulence with strong pathogenicity to experimental animals.Drug sensitive test was carried out by K－B programe，the results showed that the isolates were resistant to clinical commonly used antibiotics，and were sensitive to clinical common antifungal drugs.The fungal mastitis was caused byCandidaalbicansin Ningxia，the ratio of fungal infection was 43%.Candidaalbicanshad strong virulence and were resistant to common antibiotic and sensitivity to antifungal drugs and traditional Chinese medicine.

Key words：Candidaalbicans；mastitis；pathogenicity；haemolysin