李 航，姜利建，劉晉宇，蘭 嵐，凌芳芳，石甜甜，張賀洋，賈立軍

（延邊大學農(nóng)學院動物醫(yī)學系，延吉133002）

新孢子蟲與弓形蟲交叉抗原AMA1基因重組腺病毒的構(gòu)建及免疫應答分析

李 航，姜利建，劉晉宇，蘭 嵐，凌芳芳，石甜甜，張賀洋，賈立軍＊

（延邊大學農(nóng)學院動物醫(yī)學系，延吉133002）

摘 要：為構(gòu)建新孢子蟲和弓形蟲AMA1基因重組腺病毒，并分析其免疫原性，本試驗根據(jù)新孢子蟲和弓形蟲AMA1基因序列的開放閱讀框，設計新孢子蟲和弓形蟲交叉抗原AMA1基因通用引物，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD18T－NcAMA1、pMD18T－TgAMA1及重組腺病毒穿梭質(zhì)粒ADV4－Nc／TgAMA1，將ADV4－Nc／TgAMA1和骨架質(zhì)粒pacAd5線性化后共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝Ad5－Nc／TgAMA1重組腺病毒，測定病毒滴度后，收集病毒液接種BALB／c小鼠，間接ELISA檢測小鼠血清IgG抗體水平。結(jié)果顯示，Nc／TgAMA1在Ad5－Nc／TgAMA1重組腺病毒中獲得表達，測定Ad5－Nc／TgAMA1重組腺病毒滴度為109PFU／mL，接種BALB／c小鼠后，Ad5－Nc／TgAMA1接種組IgG抗體水平明顯高于pVAX1－Nc／TgAMA1質(zhì)粒組和PBS對照組。結(jié)果表明，構(gòu)建的Ad5－Nc／TgAMA1重組腺病毒能誘導小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應答。本試驗為新孢子蟲和弓形蟲交叉抗原AMA1基因重組腺病毒載體疫苗的研制奠定了基礎。

關(guān)鍵詞：新孢子蟲；弓形蟲；AMA1基因；重組腺病毒；免疫應答

新孢子蟲和弓形蟲均屬于細胞內(nèi)寄生性原蟲，兩者有密切的親緣關(guān)系，無論是形態(tài)學、分子生物學特性、病變等都非常相似，且感染孕畜都可導致流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等臨床癥狀。兩種寄生蟲均屬于頂復亞門，感染十分廣泛，均能感染牛、羊和其他哺乳動物［1－2］，這兩種寄生蟲病已成為世界性問題，且新孢子蟲和弓形蟲能同時感染它們的共同宿主［3］。全球很多國家的農(nóng)場每年損失都達到2%～20%，數(shù)額達到上億美元，給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重危害了畜牧業(yè)發(fā)展［4－6］。弓形蟲病是公認的一種人畜共患病，而新孢子蟲雖然目前還沒有侵入人體的感染報道，但已確認新孢子蟲可感染恒河猴，所以不排除感染人的可能性。

關(guān)于新孢子蟲病和弓形蟲病的疫苗研制還在發(fā)展中，均沒有研制出特效藥，而好的疫苗則可起到保護作用，對疾病的防御起到很大作用［7－8］。目前大多只能采取減少感染的措施，如改善畜牧場的環(huán)境條件、淘汰病畜、避免接觸終末宿主糞便等。但不可否認接種有效疫苗是控制新孢子蟲病和弓形蟲病的最佳方法。AMA1是新孢子蟲和弓形蟲在緩殖子、速殖子期表達的蛋白，AMA1蛋白是典型單拷貝跨膜蛋白［9］。研究結(jié)果表明，將弓形蟲和新孢子蟲對小鼠進行免疫接種，發(fā)現(xiàn)這兩種寄生蟲病可被AMA1重組蛋白抑制，這表明該蛋白可作為二者的交叉抗原。本試驗以新孢子蟲和弓形蟲的交叉抗原AMA1為研究對象，利用腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建了重組腺病毒載體疫苗，并進行小鼠免疫試驗，檢測疫苗的免疫應答水平，以期為新孢子蟲病和弓形蟲病新型疫苗的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1蟲體與主要材料

牛源犬新孢子蟲延邊株由延邊大學預防獸醫(yī)學實驗室分離、保存；弓形蟲RH株、Vero細胞均由延邊大學預防獸醫(yī)學實驗室保存、培養(yǎng)；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ，ExTaq、T4DNA連接酶、DL5000DNA Marker等均購自寶生物工程（大連）有限公司；腺病毒穿梭載體ADV4－GFP、腺病毒骨架質(zhì)粒pacAd5 9.2－100、293T細胞均購自吉瑪基因股份有限公司；BALB／c小鼠購自延邊大學實驗動物中心；其他常規(guī)試劑為進口或國產(chǎn)分析純級。

1.2引物設計與合成

根據(jù)GenBank上公布的新孢子蟲AMA1基因序列（登錄號：AB265823.1）和弓形蟲AMA1基因序列（登錄號：AF010264.1）的開放閱讀框，通過Oligo 6.0軟件設計新孢子蟲和弓形蟲交叉抗原AMA1基因通用引物，引物序列為：上游引物P1：5′－CCG GAATTCGCCACCATGAGCAAAATCAAGGCGAGTA－3′；下游引物P2：5′－CTAGGGATCCTTAAGAATCCGAAACCAGGCA－3′（下劃線處分別為EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點）。引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成。

1.3目的基因片段擴增

分別以提取的新孢子蟲和弓形蟲基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系25μL：模板DNA 1.0μL，dNTP 2.5μL，Buffer 2.5μL，P1和P2各1.0μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，ddH2O 16.75μL。PCR反應條件：95℃預變性5min；94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用TaKaRa的DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，純化PCR產(chǎn)物于－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4目的基因的克隆及鑒定

將回收的目的基因分別與克隆載體pMD18－T Simple Vector 4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，含Amp固體LB平板挑選陽性克隆，搖菌過夜后，分別提取pMD18T－NcAMA1和pMD18T－TgAMA1質(zhì)粒DNA進行PCR鑒定、EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。將PCR和酶切鑒定為陽性的克隆送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。并用DNAsis序列分析軟件將目的基因與GenBank中發(fā)表的基因序列進行同源性比對。

1.5Nc／TgAMA1腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將Nc／TgAMA1重組克隆質(zhì)粒和腺病毒穿梭載體ADV4－GFP分別進行EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，之后將Nc／TgAMA1與腺病毒穿梭載體ADV4－GFP連接，構(gòu)建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒ADV4－Nc／TgAMA1，提取重組質(zhì)粒進行PCR鑒定。

1.6 Nc／TgAMA1重組腺病毒的包裝

將重組腺病毒穿梭質(zhì)粒ADV4－Nc／TgAMA1和骨架質(zhì)粒pacAd5 9.2－100應用限制性內(nèi)切酶PacⅠ線性化后，轉(zhuǎn)染293T細胞，每2d更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)1d，每天觀察細胞有無細胞病變（CPE），收集明顯病變效應的細胞、培養(yǎng)液，反復凍融3次后離心，上清液為Ad5－Nc／TgAMA1病毒原液。

1.7重組腺病毒Ad5－Nc／TgAMA1的鑒定

取10μL protease K，滴入5μL病毒原液，置于55℃水浴鍋中，作用2h后，100℃水浴5min，4℃、11 000r／min離心6min。以2μL離心上清液為模板，應用通用引物P1／P2進行PCR擴增，檢測AMA1基因。同時將293T細胞培養(yǎng)在24孔的細胞培養(yǎng)板內(nèi)，細胞生長至90%后，Ad5－Nc／TgAMA1感染，24h后應用熒光顯微鏡觀察綠色熒光標簽GFP蛋白的表達，進而鑒定AMA1基因的表達。

1.8Ad5－Nc／TgAMA1重組腺病毒滴度測定

在96孔的細胞培養(yǎng)板里培養(yǎng)293T細胞，將病毒液滴入各孔中，設正常細胞對照組，按照病毒滴度（BT＝PFU／mL）方法測定病毒滴度。

1.9動物免疫試驗

以BALB／c小鼠為試驗動物，將60只BALB／c小鼠隨機分為3組，每組20只，分別為Ad5－Nc／TgAMA1疫苗組（一免109PFU／mL；二免、三免2×109PFU／mL）、pVAX1－Nc／TgAMA1質(zhì)粒組（一免0.1mg；二免、三免0.2mg）及PBS對照組（一免0.1mL；二免、三免0.2mL），每隔2周肌肉注射接種一次，共接種3次。

1.10接種小鼠血清中抗體水平檢測

每次免疫前與三免后2周進行尾尖采血，分離血清，間接ELISA測定小鼠血清中IgG抗體水平［10］，取每組平均值繪制抗體效價曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1目的基因片段的擴增

分別以新孢子蟲、弓形蟲基因組DNA為模板，應用PCR擴增AMA1基因片段，均得到大小為679bp的片段（圖1）。

圖1　AMA1基因PCR擴增結(jié)果電泳圖Fig.1 PCR amplification electrophoregram ofAMA1gene

2.2重組質(zhì)粒pMD18T－NcAMA1和pMD18TTgAMA1鑒定

將pMD18T－NcAMA1和pMD18T－TgAMA1重組克隆質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，PCR鑒定結(jié)果顯示，克隆的AMA1基因正確，pMD18T－NcAMA1和pMD18T－TgAMA1重組克隆質(zhì)粒均擴增出679bp的目的片段；雙酶切鑒定均獲得2 692和679bp的兩個片段（圖2）。測序分析結(jié)果表明，克隆的新孢子蟲AMA1基因序列和弓形蟲AMA1基因序列與GenBank中發(fā)表的新孢子蟲AMA1基因序列和弓形蟲AMA1基因序列同源性均為100.0%，暫命名為Nc／TgAMA1。

圖2　重組質(zhì)粒pMD18T－NcAMA1和pMD18T－TgAMA1鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of recombinant plasmids pMD18T－NcAMA1and pMD18T－TgAMA1

2.3重組腺病毒穿梭質(zhì)粒ADV4－Nc／TgAMA1鑒定

將雙酶切后的Nc／TgAMA1與腺病毒穿梭載體ADV4－GFP連接，構(gòu)建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒ADV4－Nc／TgAMA1，經(jīng)PCR鑒定獲得679bp的目的基因片段（圖3），結(jié)果表明，構(gòu)建的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒ADV4－Nc／TgAMA1正確。

圖3　重組腺病毒穿梭質(zhì)粒ADV4－Nc／TgAMA1的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of recombinant adenovirus shuttle plasmid ADV4－Nc／TgAMA1

2.4重組腺病毒Ad5－Nc／TgAMA1包裝及鑒定

PacⅠ酶線性化后的腺病毒穿梭質(zhì)粒ADV4－Nc／TgAMA1和pacAd5 9.2－100轉(zhuǎn)染293T細胞第8天，細胞出現(xiàn)明顯的CPE，暫命名為重組腺病毒Ad5－Nc／TgAMA1。經(jīng)PCR檢測AMA1基因擴增出679bp的目的基因片段；經(jīng)熒光顯微鏡觀察，觀察到綠色熒光（圖4），說明Nc／TgAMA1獲得表達。

圖4　熒光顯微鏡觀察重組腺病毒Ad5－Nc／TgAMA1中Nc／TgAMA1基因表達（400×）Fig.4 Observation of Nc／TgAMA1expression in recombinant adenovirus Ad5－Nc／TgAMA1by fluorescence microscope（400×）

2.5重組腺病毒Ad5－Nc／TgAMA1滴度的測定

按104／孔293T細胞接種組腺病毒Ad5－Nc／TgAMA1后，觀察到不同稀釋度的樣本中293T細胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，計算擴增所得腺病毒的滴度為109PFU／mL。

2.6BALB／c小鼠血清中的IgG抗體檢測結(jié)果

接種疫苗三免2周后，IgG抗體效價Ad5－Nc／TgAMA1疫苗組明顯高于pVAX1－Nc／TgAMA1質(zhì)粒組和PBS對照組（圖5）。結(jié)果表明，Ad5－Nc／TgAMA1重組腺病毒可誘導小鼠產(chǎn)生較強的體液免疫應答。

圖5　不同免疫組BALB／c小鼠血清IgG水平Fig.5 Serum IgG levels of BALB／c mice in different immune groups

3 討 論

新孢子蟲和弓形蟲在遺傳學、免疫學及形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面相似度都非常高，其生物學特性也有很大的相似性，且均能引起孕畜流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等臨床癥狀，很多情況下，因為其臨床癥狀的相似性而導致誤診［11－12］。新孢子蟲和弓形蟲的終末宿主雖不同，但牛、羊類哺乳動物均是這兩種寄生蟲的共同中間宿主，甚至可同時感染新孢子蟲病和弓形蟲?。?3］。根據(jù)兩種寄生蟲的相似性，研制出一種對新孢子蟲和弓形蟲均有抑制作用的疫苗非常重要。

AMA1基因在所有頂復門寄生蟲里都有同源性，Zhang等［14］研究表明，接種新孢子蟲AMA1重組蛋白的小鼠對新孢子蟲和弓形蟲的感染都有一定的抑制作用，證實該蛋白可作為兩者的交叉抗原。AMA1的3個結(jié)構(gòu)域中，起到明顯抑制作用的為DⅠ和DⅡ結(jié)構(gòu)域，其中DⅡ還能刺激小鼠，使之產(chǎn)生較高的細胞免疫及體液免疫反應［15］。因此，AMA1基因已成為一種具有發(fā)展前景的候選疫苗抗原。

腺病毒的疫苗發(fā)展很有前景，腺病毒作為一種多面結(jié)構(gòu)無囊膜病毒，應用在臨床試驗后，一直不斷在飛速發(fā)展，其中Ad2、Ad5型全序列了解最全面，腺病毒除了可能會引起極小癥狀，幾乎無任何不良反應，腺病毒載體游離狀態(tài)在宿主細胞基因組外［16－17］。重組腺病毒載體疫苗對于那些本身具有母源抗體的動物也可持續(xù)產(chǎn)生抗體效價，提高免疫力［18－19］。本試驗中使用的吉瑪腺病毒，其生長系統(tǒng)較其他腺病毒更快。吉瑪腺病毒去除了5′ITR、E1序列及包裝信號，使腺病毒成為野生型可復制腺病毒的危險性減少，其安全性得到了提高。另外，吉瑪腺病毒系統(tǒng)中帶有GFP綠色熒光蛋白標簽，具有操作簡便、快捷、直觀等特點。

Liddell等［20］用NcGRA7DNA編碼的載體免疫小鼠可抵抗犬新孢子蟲的先天感染。Jenkins等［21］試驗證明用CpG作為NcGRA7DNA疫苗的佐劑可大幅度提高疫苗的保護性。Nishikawa等［22］先后構(gòu)建了表達NcSRS2蛋白的重組皰疹病毒和重組痘苗病毒，重組皰疹病毒免疫犬，可產(chǎn)生針對新孢子蟲的IgG抗體，能完全抵抗犬皰疹病毒的感染；重組痘苗病毒接種BALB／c小鼠后能誘導小鼠產(chǎn)生免疫保護力。賈立軍等［23］構(gòu)建了Ad5－NcSAG1重組腺病毒，接種BALB／c小鼠取得了較好的免疫應答效果。本試驗構(gòu)建了Ad5－Nc／TgAMA1重組腺病毒，對BALB／c小鼠進行了免疫試驗，取得了較好的體液免疫應答效果，Ad5－Nc／TgAMA1重組腺病毒能否對BALB／c小鼠或其他動物產(chǎn)生較好的細胞免疫應答水平，還有待于進一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗獲得Ad5－Nc／TgAMA1重組腺病毒滴度為109PFU／mL，接種小鼠后的IgG抗體效價Ad5－Nc／TgAMA1疫苗組明顯高于pVAX1－Nc／TgAMA1質(zhì)粒組和PBS對照組，表明Ad5－Nc／TgAMA1疫苗能誘導機體產(chǎn)生較好的體液免疫應答。

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（責任編輯 董曉云）

中圖分類號：S852.7

文獻標識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3336－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.037

收稿日期：2016－05－20

基金項目：國家自然科學基金（31160501、31360605）；吉林省重點科技攻關(guān)項目（20140204078NY）；吉林省教育廳重點項目（吉教科合字［2015］第1號）；吉林省自然科學基金（20160101201JC）

作者簡介：李 航（1993－），女，吉林農(nóng)安人，學士，研究方向：分子免疫學，E－mail：627105428＠qq.com

通信作者：＊賈立軍（1978－），男，吉林鎮(zhèn)賚人，博士，副教授，研究方向：分子免疫學，E－mail：lijunjia1015＠sohu.com

Construction and Analysis of Immune Response ofNeosporacaninumandToxoplasmagondiiCross Recombinant Adenovirus AntigenAMA1Gene

LI Hang，JIANG Li－jian，LIU Jin－yu，LAN Lan，LING Fang－fang，SHI Tian－tian，ZHANG He－yang，JIA Li－jun＊
（DepartmentofVeterinaryMedicine，AgriculturalCollegeofYanbianUniversity，Yanji133002，China）

Abstract：In order to establish AMA1recombinant adenovirus ofNeosporacaninum（N.caninum）andToxoplasmagondii（T.gondii），and analyze the immunogenicity of it，cross universal primers were designed according to the open reading frame ofN.caninumandT.gondiiAMA1 gene sequences.Based on pMD18T－NcAMA1and pMD18T－TgAMA1cloning plasmid，recombinant adenovirus shuttle plasmid ADV4－Nc／TgAMA1was constructed.Then，ADV4－Nc／TgAMA1and pacAd5backbone plasmid were linearized and co－transfected 293Tcells.After packaging recombinant adenovirus and measuring the virus titer，collected virus was inoculated into BALB／c mice，confirmed the IgG antibody levels by indirect ELISA method.The results showed that Nc／TgAMA1was expressed in Ad5－Nc／TgAMA1recombinant adenovirus，Ad5－Nc／TgAMA1recombinant adenovirus titer was 109PFU／mL.IgG antibody levels in the Ad5－Nc／TgAMA1vaccinated group were significantly higher than pVAX1－Nc／TgAMA1plasmid group and PBS control group.This result indicated that the constructed Ad5－Nc／TgAMA1recombinant adenovirus could induce specific humoral immune response in mice，this research laid a solid foundation for the development of a recombi－nant adenovirus vaccine againstN.caninumandT.gondii.

Key words：Neosporacaninum；Toxoplasmagondii；AMA1gene；recombinant adenovirus；immune response