馬興樹，朱美霞，石 虎，楊廣平

（1.河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室，邯鄲056021；2.河北科星藥業(yè)有限公司河欣科技中心，石家莊050200）

禽致病性大腸桿菌的分離、O血清群鑒定及藥物敏感試驗

馬興樹1，朱美霞1，石 虎2，楊廣平2

（1.河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室，邯鄲056021；2.河北科星藥業(yè)有限公司河欣科技中心，石家莊050200）

摘 要：對2005年5月～2016年3月自河北、山東、河南、江蘇、陜西、遼寧等省發(fā)病雞場疑似大腸桿菌病的病死雞病變部位分離的194株禽致病性大腸桿菌進行了生化特性測定、O抗原血清群鑒定及藥敏試驗。試驗用5種大腸桿菌單因子（O1、O2、O57、O65、O78）陽性血清進行O血清群鑒定，確定了124株O血清群，占鑒定菌株數(shù)的63.9%（124／194），其中O1 3株、O2 26株、O57 15株、O65 47株和O78 33株，O65和O78為優(yōu)勢菌株，而O2和O57血清群菌株次之，O1血清群菌株最少。8種藥物（氨芐西林、新霉素、多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶、替米考星、環(huán)丙沙星、頭孢噻呋和氟苯尼考）的藥敏試驗結(jié)果表明，受試的5株大腸桿菌分離株均對環(huán)丙沙星和新霉素敏感，而對其他藥物均有不同程度的耐受。本研究結(jié)果表明O65、O78、O2和O57血清群高度流行，為進一步研發(fā)多價菌苗奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：禽致病性大腸桿菌；分離；鑒定；O血清群；藥物敏感試驗

雞大腸桿菌病是由某些血清群禽致病性大腸桿菌（APEC）引起雞局部或全身性感染的不同類型的總稱，臨床實踐中以肝周炎、心包炎、氣囊炎和臍炎等較為常見，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失［1］。中國自1982年以來，許多省市相繼報道了雞的大腸桿菌病，其普遍性和嚴重性及對養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展構(gòu)成的威脅越來越嚴重［2］。目前，隨著中國養(yǎng)雞業(yè)的快速發(fā)展，雞大腸桿菌病的發(fā)生也愈來愈受到養(yǎng)雞者的關(guān)注。為探明大腸桿菌病在中國部分養(yǎng)雞集中地區(qū)的發(fā)生和流行情況，作者對2005年5月～2016年3月自河北、山東、河南、江蘇、陜西、遼寧等省不同發(fā)病雞群分離的194株致病性大腸桿菌進行了生化特性測定、O血清群鑒定、藥物敏感試驗等研究，為進一步研發(fā)多價或亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1病料來源及大腸桿菌分離培養(yǎng)

2005年5月～2016年3月，自河北、山東、河南、江蘇、陜西、遼寧等省不同發(fā)病雞群，無菌采取臨床癥狀典型（如敗血癥、腦炎、眼結(jié)膜炎）或剖檢有明顯病變（如肝周炎、心包炎）的病死雞肝臟和心血或腦、眼分泌物，分別接種于伊紅美藍（EMB）瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、營養(yǎng)瓊脂平板，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h后，觀察菌落大小、形態(tài)、色澤，透明度等，同時挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的單個菌落涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢［2］。共分得194株APEC，其中蛋雞138株、肉雞56株；分離自肝臟和心血185株、眼分泌物2株、腦7株。

1.2生化試驗

細菌微量生化反應(yīng)管購自浙江省杭州天和微生物試劑有限公司。按使用說明分別接種至硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、靛基質(zhì)、甲基紅、枸緣酸鹽、尿素、動力、產(chǎn)氣、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木糖等15種生化常規(guī)微量鑒別管，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18h后，觀察各個鑒別管中的變化情況，根據(jù)說明書判定結(jié)果。

1.3O抗原制備及血清群鑒定

將純化的大腸桿菌分別接種于營養(yǎng)瓊脂平板，37℃下培養(yǎng)18～24h后，用2～3mL 0.5%的滅菌石炭酸生理鹽水沖洗，收集菌懸液放入滅菌的西林瓶中，硫酸紙封口，121℃高壓滅菌2h，冷至室溫，加入1%NaN31～2滴，置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。大腸桿菌O抗原單因子血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，共5種，分別為O1、O2、O57、O65和O78。取制備好的抗原30μL滴在潔凈的玻片上，再滴加等量已知單因子血清，用牙簽使其充分混合，1min后判定結(jié)果。

1.4藥敏試驗

分別自5種血清群各選取1株典型的分離菌進行氨芐西林（10μg／片）、新霉素（30μg／片）、多西環(huán)素（30μg／片）、磺胺間甲氧嘧啶鈉（300μg／片）、替米考星（5μg／片）、環(huán)丙沙星（5μg／片）、頭孢噻呋（30μg／片）和氟苯尼考（30μg／片）等8種藥物進行藥物敏感試驗（藥敏片為河欣科技中心公司制備），采用紙片擴散法，參考文獻［2］進行。

2 結(jié)果與分析

2.1鏡檢及培養(yǎng)特性

挑取營養(yǎng)瓊脂平板上37℃培養(yǎng)18h的單個菌落涂片，革蘭氏染色后，鏡檢可見大量革蘭氏陰性的短小桿菌（圖1）。伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上多數(shù)分離菌株呈紫黑色，并帶有明顯的金屬光澤；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈粉紅色；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上呈1.5～2mm形態(tài)突起，光滑濕潤，灰白色，半透明，邊緣整齊，并具有特殊的雞糞樣臭味（圖2）。

圖1　APEC菌株O78（115＃）革蘭氏染色涂片（1 000×）Fig.1 Gram stain of APEC isolate O78（115＃）（1 000×）

圖2　APEC菌株O78（115＃）在3種培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)Fig.2 Growth characteristics of APEC isolate O78（115＃）on three kinds of culture medium

2.2生化特性

對5株菌株進行生化試驗，結(jié)果表明所選取的5株菌株均發(fā)酵賴氨酸、木糖，產(chǎn)生靛基質(zhì)，MR陽性，不產(chǎn)生H2S、不發(fā)酵苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽，在枸緣酸鹽培養(yǎng)基不生長，不水解尿素（尿素酶陰性），無動力，不產(chǎn)氣，158＃（O57）和102＃（O65）菌株不利用鳥氨酸，77＃（O1）、57＃（O2）和158＃（O57）不利用棉子糖（表1）。

表1　5株APEC分離菌株生化試驗結(jié)果Table 1 Biochemical characteristics of five APEC isolates

2.3O抗原血清群鑒定

試驗用5種單因子O血清對所分離的194株禽致病性大腸桿菌進行鑒定，共鑒定出124株，分別為O1（3株）、O2（26株）、O57（15株）、O65（47株）和O78（33株），鑒定菌株占分離菌株數(shù)的63.9%（124／194）。其中O65、O78和O2為優(yōu)勢菌株，占定型菌株的85.5%（106／124）。

從菌株分離年代來看，每年的優(yōu)勢菌株變化較大，如2009－2012年以O(shè)2、O65和O78為主，而2013－2016年則出現(xiàn)O57菌株。2005－2016年5種血清群在蛋雞和肉雞的分離株數(shù)見表2。

2.4 藥敏試驗

5株APEC對環(huán)丙沙星和新霉素敏感，而對其他藥物均呈不同程度耐受，特別是氨芐西林、磺胺間甲氧嘧啶和替米考星（表3），表明這3種藥物臨床使用較為普遍，應(yīng)引起臨床獸醫(yī)工作者重視。

表3　5株APEC的藥物敏感試驗結(jié)果（mm）Table 3 Drug sensitivity results of five APEC strains

3 討 論

禽致病性大腸桿菌是引起雞發(fā)病和死亡的重要致病菌，也是導(dǎo)致家禽業(yè)巨大經(jīng)濟損失的主要原因［3］。作者對2005年5月～2016年3月自河北、山東、江蘇、陜西、遼寧等省不同雞群發(fā)生不同病型（肝周炎、心包炎、腦炎、眼結(jié)膜炎等）的病死雞分離的194株大腸桿菌進行了形態(tài)特征、培養(yǎng)特性及生化特性鑒定，結(jié)果表明均符合致病性大腸桿菌特性［2］。

目前根據(jù)大腸桿菌表面結(jié)構(gòu)（O抗原、H抗原和K抗原）的抗原性將其分為不同的血清型（O∶K∶H）。然而，由于多數(shù)實驗室不能對K抗原定型，故基于O和H抗原（O∶H）作為血清型（serotype）分型的“金標準”，而單依據(jù)O抗原則定為血清群（serogroup）［4］。在前期研究工作的基礎(chǔ)上［5］，選取O1、O2、O57、O65和O78 5種單因子血清對近年野外分離的194株大腸桿菌進行鑒定，共定群124株，定群率為63.9%，其中O65、O78和O2為優(yōu)勢菌株，占定型菌株的85.5%，而國外報道的優(yōu)勢菌株O1僅占1.5%［6］。血清群O57和O65國內(nèi)雖有報道，但其所占比例不完全一致，表明禽致病性大腸桿菌血清群分布具有明顯的區(qū)域性特點［7］。然而，O血清群的多樣性除與地域和宿主有關(guān)外，也隨著感染年代的不同而改變［8］。一般來說，某一地區(qū)的優(yōu)勢血清群通常為3～5種，但其多樣性卻極為豐富，某一地區(qū)的優(yōu)勢血清群可能是另一地區(qū)少見或罕見的血清群，反之亦然，這給通過疫苗防控禽大腸桿菌病帶來極大困難［9－11］。

值得注意的是，在定群菌株中，盡管優(yōu)勢菌株O65均分離自發(fā)病雞群，但人工接種1日齡易感雛雞卻無致病性，特別是自表現(xiàn)神經(jīng)癥狀的患雞腦部分離到的7株APEC，除4株未定群外，其他3株均為O65血清群，這是否與自然條件下低致病性或無致病性APEC受病毒、支原體感染及環(huán)境條件較差等促發(fā)因素有關(guān)，尚需深入研究［12－14］。然而，本試驗于2013～2016年分離的血清群O57菌株在國內(nèi)外的報道很少，但其致病性卻很強，應(yīng)引起禽病研究者特別是養(yǎng)禽生產(chǎn)者的高度關(guān)注。

在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)有18株未定群菌株存在自凝現(xiàn)象，其原因可能與粗糙型大腸桿菌有關(guān)；有些菌株可與2種單因子血清同時發(fā)生凝集，如于2014年自邱縣某雞場150日齡發(fā)病蛋雞肝臟分離的菌株，可與血清群O57、O78同時發(fā)生凝集，這是否與菌體自身就存在兩種O抗原有關(guān)，值得進一步通過分子生物學(xué)方法研究闡明［4］。在臨床實踐中，還發(fā)現(xiàn)即使同一雞場、同一雞群甚至同一只病死雞不同組織器官（肺臟、氣囊、心血、肝臟）所分離到的血清群有時亦不完全一致，表明雞大腸桿菌血清群不僅與雞苗來源有關(guān)，更與飼料、飲水及雞場環(huán)境甚至飼養(yǎng)人員有關(guān)［15－18］。

藥敏試驗結(jié)果表明，不論是同一地區(qū)的同一血清群或不同血清群還是不同地區(qū)的同一血清群或不同血清群對同一種藥物的敏感性可能相同，也可能不同，其原因可能與用藥歷史不同或細菌在傳代過程中質(zhì)粒丟失或增加，使其耐藥性降低或提高有關(guān)［7，19］。本試驗對5株（O1、O2、O57、O65和O78）耐藥菌株和敏感菌株的質(zhì)粒電泳圖譜初步分析表明，不同菌株的質(zhì)粒種類和數(shù)量明顯不同，但與藥敏特性密切相關(guān)，而與血清群無關(guān)［18，20］。然而不論所含質(zhì)粒種類和數(shù)量多少、來源何地的菌株，均對環(huán)丙沙星和新霉素呈現(xiàn)不同程度的敏感性，故在初步診斷為大腸桿菌病后結(jié)合臨床用藥史可先行使用這類藥物予以治療。

4 結(jié) 論

對野外發(fā)病雞群分離的194株APEC的初步研究結(jié)果表明，優(yōu)勢血清群O78和O2與國內(nèi)外報道一致，優(yōu)勢血清群O65和O57則報道較少。因此，特殊或罕見的血清群可能因地、因時、因禽而異。盡管不同血清群APEC具有共同的毒力因子或毒力基因，但在感染的不同階段涉及的毒力因子不同，如O2和O78血清群均具有黏附菌毛，但前者為P菌毛，后者則為AC／Ⅰ菌毛，而不同的菌毛其抗原性也不同。由此可見，分離鑒定的O65和O57優(yōu)勢血清群，拓展了中國APEC血清群范圍，為進一步研發(fā)多價或亞單位疫苗奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 秦 彤）

中圖分類號：S858.3

文獻標識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3343－06

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.038

收稿日期：2016－05－12

基金項目：河北省科技廳科技支撐計劃項目（13226602D）

作者簡介：馬興樹（1963－），男，河北張家口人，博士，教授，研究方向：動物傳染病防制與病原微生物分子生物學(xué)，E－mail：maxingshu＠126.com

通信作者：＊楊廣平（1956－），男，高級畜牧師，E－mail：ygpdml＠gmail.com

Isolation，O Serogrouping and Drug Sensitivity Test of Avian PathogenicEscherichiacoli

MA Xing－shu1，ZHU Mei－xia1，SHI Hu2，YANG Guang－ping2
（1.LaboratoryofMolecularBiology，CollegeofAgricultural，HebeiUniversityofEngineering，Handan056021，China；2.HexinScientificandTechnologicCenterofHebeiKexingPharmaceutical Co.，Ltd.，Shijiazhuang050200，China）

Abstract：One hundred and ninety four avian pathogenicEscherichia.coli（APEC）isolated from different pathotypes of chickens in Hebei province，Shandong province，Henan province，Jiangsu province，Shanxi province and Liaoning province in China between May 2005and March 2016were investigated by determination of biochemical characters，O serogroup identification and drug sensitivity test.Out of 194isolates，124strains（63.9%）could be grouped to serogroups O1（3），O2（26），O57（15），O65（47）and O78（33）.The drug sensitivity test used eight antibiotics（ampicillin，neomycin，doxycycline，sulfamonomethoxine，tilmicosin，ciprofloxacin ceftiofur and florfenicol）by one strain of O1，O2，O57，O65，O78serogroup，respectively.The results showed that all strains were sensitive to ciprofloxacin and neomycin，and resistance to other drugs at varying degrees.This study demonstrated that the high prevalence of O65，O78，O2and O57isolates existed and provided the basis for the development of multivalent bacterin in future.

Key words：avian pathogenicE.coli；isolation；identification；O serogroups；drug sensitivity test