張 賽 梅曉云 周 嵐

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論教研室，南京市 210023，E-mail：jessica826310@163.com)

論著·基礎(chǔ)研究

補(bǔ)陽還五湯對(duì)腓總神經(jīng)損傷大鼠腓總神經(jīng)中神經(jīng)生長因子mRNA表達(dá)的影響▲

張 賽 梅曉云 周 嵐

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論教研室，南京市 210023，E-mail：jessica826310@163.com)

目的 探討補(bǔ)陽還五湯對(duì)腓總神經(jīng)損傷大鼠的腓總神經(jīng)中神經(jīng)生長因子(NGF)-mRNA表達(dá)的影響。方法 選取雄性無特定病原體級(jí)雄性SD大鼠48只分模型組、假手術(shù)組、彌可保組及補(bǔ)陽還五湯高、中、低劑量組各8只。除假手術(shù)組大鼠外，均建立腓總神經(jīng)夾傷模型，術(shù)后假手術(shù)組與模型組分別用生理鹽水灌胃，彌可保組及各劑量補(bǔ)陽還五湯組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，其中補(bǔ)陽還五湯高、中、低劑量組所含生藥分別為25.92 mg/g、12.96 mg/g、6.48 mg/g，21 d后檢測(cè)大鼠腓總神經(jīng)NGF-mRNA 表達(dá)情況。結(jié)果 假手術(shù)組、彌可保組與補(bǔ)陽還五湯低、中、高劑量組NGF-mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增高，分別是模型組的4.79倍、2.16倍、1.31倍、1.83倍、3.41倍；補(bǔ)陽還五湯中劑量及高劑量組、彌可保組NGF mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于模型組(P<0.05)，補(bǔ)陽還五湯高劑量組NGF mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于彌可保組(P<0.05)。結(jié)論 補(bǔ)陽還五湯可明顯增強(qiáng)腓總神經(jīng)損傷大鼠腓總神經(jīng)中NGF-mRNA的表達(dá),這可能是補(bǔ)陽還五湯可促進(jìn)腓總神經(jīng)損傷后的修復(fù)及再生、肢體功能恢復(fù)的機(jī)制之一。

腓總神經(jīng)損傷；補(bǔ)陽還五湯；腓總神經(jīng)；神經(jīng)生長因子；mRNA；大鼠；中醫(yī)藥；雪旺細(xì)胞

周圍神經(jīng)損傷后的再生與修復(fù)過程涉及多種因素且復(fù)雜多變。目前臨床上尚無較為理想的、可快速促進(jìn)神經(jīng)及其靶器官功能恢復(fù)的方法。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)與周圍神經(jīng)病變的關(guān)系密切[1]，其作為神經(jīng)營養(yǎng)因子中重要的一員，對(duì)神經(jīng)元的生長、修復(fù)與再生意義重大。有關(guān)復(fù)方補(bǔ)陽還五湯促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的文獻(xiàn)報(bào)告日益增多[2]。我們通過建立大鼠腓總神經(jīng)夾傷模型，并檢測(cè)神經(jīng)NGF mRNA的表達(dá)，以了解補(bǔ)陽還五湯治療大鼠腓總神經(jīng)損傷的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 無特定病原體級(jí)雄性SD大鼠48只，體重約200 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)：2008001646760。均于無菌飼養(yǎng)室、恒溫20℃飼養(yǎng)。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為模型組、假手術(shù)組、彌可保組及補(bǔ)陽還五湯高、中、低劑量組，每組8只。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品 (1)在南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑室制備補(bǔ)陽還五湯，采用黃芪120 g、當(dāng)歸6 g、芍藥6 g、地龍3 g、川芎3 g、紅花3 g、桃仁3 g進(jìn)行煎煮、提取并濃縮，浸膏比重為3.7 g/ml，將該浸膏放于4℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?2)將甲鈷胺片(彌可保，批號(hào)：H20041642，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司，500 μg/片)溶解于雙蒸水中，配制成混懸液，濃度為62.5 μg/ml。錫紙包裝避光放置該溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑 Trizol購自Invitrogen公司(批號(hào)：15596-026)；焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)處理水購自南京森貝伽生物科技有限公司(批號(hào)：1001218)；氯仿、異丙醇、無水乙醇購自國藥集團(tuán)有限公司(批號(hào)分別為：10023419，80109218，10009218)；SYBR Green PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司(批號(hào)分別為：K0223，K1622)；RNaseⅠ購自Fermentas公司(批號(hào)：EN0541)；PCR 引物由武漢谷歌生物公司合成。其他常規(guī)試劑均為國藥產(chǎn)品分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 旋渦振蕩器(上海青浦瀘西儀器廠)、XW-80A微型旋渦混合儀(上海瀘西分析儀器廠有限公司)、FastPrep-24樣品處理系統(tǒng)(美國MP)、5424 R離心機(jī)(Eppendorf公司)、CFX Connect Real-Time PCR檢測(cè)系統(tǒng)(BIO-RAD公司)、UPT優(yōu)普特實(shí)驗(yàn)室超純水器，離心管及 10 μl、200 μl、1 000 μl槍頭等均為無RNA酶耗材。

1.5 腓總神經(jīng)夾傷模型建立 在模型組、彌可保組及補(bǔ)陽還五湯高、中、低劑量組中建立模型。動(dòng)物稱重并麻醉消毒備皮，取左股后正中作一1.5 cm切口，游離后充分暴露腓總神經(jīng)股部，向下行腓總神經(jīng)鉗夾術(shù)，以14 cm止血鉗上全齒鉗夾腓總神經(jīng)3次，10 s/次且每次間隔10 s。擠壓損傷寬度為5 mm，損傷遠(yuǎn)端標(biāo)記后逐層縫合。全部模型由同一人同手法操作。而假手術(shù)組大鼠只進(jìn)行脛前肌外皮切口并縫合，不夾傷內(nèi)部腓總神經(jīng)。

1.6 給藥方法 造模后第2天開始灌胃給藥，給藥劑量根據(jù)成人臨床使用劑量，根據(jù)每公斤體重占體表面積相對(duì)比值的換算公式計(jì)算：大鼠每日給藥劑量(mg/g)=成人每日給藥劑量(mg)×等效劑量比值(人對(duì)大鼠為0.018)/大鼠體重(g)。補(bǔ)陽還五湯高劑量組為臨床換算劑量的2倍量(25.92 mg/g)，高、中、低劑量組含生藥分別是25.92 mg/g、12.96 mg/g、6.48 mg/g，中藥浸膏均用生理鹽水稀釋至4 ml后灌胃。假手術(shù)組與模型組分別用4 ml生理鹽水灌胃。彌可保組藥物劑量為625 mg/g，終體積4 ml灌胃。給藥時(shí)間固定為每日上午9 ∶00，1次/d。

1.7 腓總神經(jīng)指標(biāo)檢測(cè) 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NGF mRNA的表達(dá)。

1.7.1 引物合成：磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因?yàn)閰⒄栈颉８鶕?jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的NGF基因序列及GAPDH基因序列，以Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,由武漢谷歌生物有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7.2 總RNA制備：術(shù)后灌胃21 d后處死大鼠，暴露腓總神經(jīng)，沿神經(jīng)損傷遠(yuǎn)端取神經(jīng)組織30 mg并放入凍存管中，置于液氮，后轉(zhuǎn)到-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.3 互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)的合成：將神經(jīng)組織加入1 ml Trizol勻漿靜置，加入氯仿，12 000 r/min離心10 min，取上清。加入異丙醇，12 000 r/min離心15 min，棄上清。加入乙醇洗滌沉淀?xiàng)壣锨?。晾干加入適量焦碳酸二乙酯處理水溶解。合成cDNA的第一條鏈反應(yīng)體系如下：首先消除總RNA中的DNA，需加入脫氧核糖核酸酶I(deoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ)1 μl、10×DNase Ⅰ 緩沖液1 μl、總RNA≤1 ng、焦碳酸二乙酯處理水n μl，調(diào)整溫度至37℃ 30 min。加 1 μl的乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，調(diào)制溫度至65℃ 10 min；后加入1 μl的Oligo 18、1 μl的雙蒸水(ddH2O)，65℃加熱10 min，結(jié)束后迅速置于冰上冷卻。進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加入下列體系：全部RNA 500 ng；5×反應(yīng)物緩沖液4 μl；Oligo 18引物1 μl；10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸混合物2 μl；RiboLock RNase抑制劑1 μl；RevertAid M-MuLV RT 1 μl；加入無酶ddH2O至20 μl；反應(yīng)程序如下：溫度調(diào)至42℃ 60 min，上升至70℃ 5 min后冷卻到16℃，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.4 定量PCR檢測(cè) 20 μl體系：將制備好的 cDNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：將PCR擴(kuò)增的預(yù)混和溶液(SYBR Green Mix)10 μl、上游引物 F 0.5 μl、下游引物 R 0.5 μl、cDNA模板1 μl、ddH2O 8 μl混勻，總體積20 μl，置于SLAN熒光定量PCR儀中。反應(yīng)程序：升溫至95℃，3 min；95℃，1～3 s，退火至60℃，≥20 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后保存數(shù)據(jù)。通過溶解曲線來判斷PCR反應(yīng)的特異性。每個(gè)組分別做3次定量檢測(cè)，記錄下CT值，并最終計(jì)算出CT平均值、△CT、△△CT和2-△△CT。其中△CT=CT(NGF)-CT(GAPDH)，△△CT=△CT(各組)-△CT(模型組)，運(yùn)用2-△△CT相對(duì)定量差異法統(tǒng)計(jì)各組與模型組NGF mRNA基因表達(dá)的差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用(x±s)來表示，比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后大鼠一般情況 術(shù)后第2天所有大鼠手術(shù)側(cè)出現(xiàn)了足趾蜷縮、跛行。21 d后各組足趾明顯伸展，步態(tài)基本恢復(fù)正常，假手術(shù)組、彌可保組及補(bǔ)陽還五湯高、中、低劑量組大鼠精神狀態(tài)及毛發(fā)色澤均優(yōu)于模型組。除假手術(shù)組外，其余各組的手術(shù)側(cè)均呈現(xiàn)出不同程度的脛前肌肌肉萎縮。

2.2 治療后各組大鼠腓總神經(jīng)的NGF基因表達(dá)情況 6組的NGF-mRNA基因相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，假手術(shù)組、彌可保組與補(bǔ)陽還五湯低、中、高劑量組NGF mRNA基因相對(duì)表達(dá)量較模型組明顯增高，分別是模型組的4.79倍、2.16倍、1.31倍、1.83倍、3.41倍；其中補(bǔ)陽還五湯中劑量及高劑量組、彌可保組NGF mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于模型組(P<0.05)，補(bǔ)陽還五湯高劑量組NGF mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于彌可保組(P<0.05)。見表2。

表2 6組NGF-mRNA基因相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

注：與模型組相比，*P<0.001，△P<0.01；與彌可保組相比，#P<0.001。

3 討 論

NGF是一種分子量為27 KD的多肽，是一個(gè)高度保守的蛋白家族[3]。其細(xì)胞效應(yīng)通過細(xì)胞表面兩類截然不同的受體介導(dǎo)[4]，主要存在于交感神經(jīng)元及部分感覺神經(jīng)元所分布的靶區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞組織中。受體酪氨酸激酶(tyrosine kinase，Trk)家族和NGF家族成員呈相對(duì)特異高親和結(jié)合，特別是TrkA和NGF結(jié)合[5]。NGF的另外一個(gè)受體P75NTR和NGF家族成員呈低親和結(jié)合。NGF是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，是目前唯一明確化學(xué)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，具有促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷與修復(fù)作用[6]，其作用具體表現(xiàn)為：控制神經(jīng)元的存活，促進(jìn)神經(jīng)元的分化，決定軸突的生長方向及營養(yǎng)作用。研究表明，NGF蛋白及其受體表達(dá)減少的同時(shí)周圍神經(jīng)中的NGF基因表達(dá)也減少[7]。由于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以NGF-mRNA在神經(jīng)組織中的表達(dá)情況來評(píng)估神經(jīng)再生，其敏感性明顯高于檢測(cè)NGF的表達(dá)情況[8]。大量細(xì)胞和分子水平的研究證實(shí)神經(jīng)再生離不開雪旺細(xì)胞的增殖[9]。而Heumann等[10]研究表明神經(jīng)損傷后的NGF-mRNA的高表達(dá)主要來源于局部增殖的雪旺細(xì)胞。雪旺細(xì)胞分泌NGF以維持神經(jīng)元生存和促進(jìn)軸突再生，如周圍神經(jīng)損傷后，雪旺細(xì)胞的增殖受阻，必然導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡，抑制軸突的再生。

腓總神經(jīng)損傷是病因病機(jī)和臨床表現(xiàn)可將其歸于中醫(yī)“痿證”范疇，周圍神經(jīng)損傷，首先出現(xiàn)局部的氣滯血淤，受到其支配的遠(yuǎn)端肌肉群由于失去神經(jīng)的營養(yǎng)供應(yīng)，便逐漸發(fā)展為萎縮和變性，此當(dāng)屬本虛標(biāo)實(shí)之證，病機(jī)為經(jīng)氣不續(xù)、氣虛血滯，應(yīng)以補(bǔ)氣活血化淤為治則。補(bǔ)陽還五湯出自清代醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，是補(bǔ)氣活血的代表方，方中以大量補(bǔ)氣藥(黃芪120 g)搭配少量活血藥(桃仁、紅花、赤芍、川芎、地龍)，活血而不傷正，補(bǔ)氣活血通絡(luò)。有臨床研究報(bào)道補(bǔ)陽還五湯臨床廣泛用于腰腿疼痛麻痹、周圍神經(jīng)性面癱、糖尿病周圍神經(jīng)等病變，且療效確切[11]。本研究結(jié)果顯示，治療后21 d，補(bǔ)陽還五湯中劑量及高劑量組、彌可保組大鼠腓總神經(jīng)的NGF-mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于模型組(P<0.05)，而補(bǔ)陽還五湯高劑量組NGF-mRNA表達(dá)明顯高于彌可保組(P<0.05)，提示不同劑量的補(bǔ)陽還五湯均可增強(qiáng)腓總神經(jīng)損傷大鼠的腓總神經(jīng)中NGF-mRNA的表達(dá)，推測(cè)該方有可能促進(jìn)NGF與新生雪旺細(xì)胞對(duì)潰變髓鞘的清除能力，同時(shí)使雪旺細(xì)胞的NGF-mRNA表達(dá)增加，從而促進(jìn)軸突生長以加速神經(jīng)的再生，使周圍神經(jīng)的結(jié)構(gòu)和功能得到了保護(hù)，這可能是其治療腓總神經(jīng)損傷的重要靶點(diǎn)之一。

綜上所述，補(bǔ)陽還五湯可明顯增強(qiáng)腓總神經(jīng)損傷大鼠腓總神經(jīng)中NGF-mRNA的表達(dá)，這可能是補(bǔ)陽還五湯促進(jìn)腓總神經(jīng)損傷后的修復(fù)與再生以恢復(fù)肢體功能的機(jī)制之一。

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Effect of Buyanghuanwu decoction on nerve growth factor mRNA expression of common peroneal nerve in rats with common peroneal nerve injury repairing

ZHANGSai1,MEIXiao-yun1,ZHOULan2

(DepartmentofBasicalTraditionalChineseMedicalCollege,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210023 210023,China)

Objective To explore the effect of Buyanghuanwu decoction on nerve growth factor(NGF) mRNA expression of common peroneal nerve in rats with common peroneal nerve injury.Methods A total of 48 male specific pathogen free SD rats were divided into model group,sham operation group,methycobal group,high-dose Buyanghuanwu decoction group,medium-dose Buyanghuanwu decoction group and low-dose Buyanghuanwu decoction group,with 8 rats in each group.Common peroneal nerve crush models were established in all the rats except the rats in the sham operation group.After operation,sham operation group and model group were treated with normal saline by gavage,while methycobal group and all Buyanghuanwu decoction groups were given corresponding transgastric medication.And the pure drugs in the high-,medium- and low-dose Buyanghuanwu decoction groups were 25.92 mg/g,12.96 mg/g and 6.48 mg/g,respectively.NGF mRNA expression was determined in the common peroneal nerve of rats 21 days later.Results Relative expression levels of NGF mRNA in the sham group,methycobal group,low-,medium- and high-dose Buyanghuanwu decoction groups increased significantly,and were 4.79 times,2.16 times,1.31 times,1.83 times and 3.41 times the relative expression levels in the model group respectively.Relative expression levels of NGF mRNA in the medium- and high-dose Buyanghuanwu decoction groups and methycobal group were significantly higher than that in the model group(P<0.05),and relative expression level of NGF mRNA in the high-dose Buyanghuanwu decoction group was significantly higher than that in the methycobal group(P<0.05).Conclusion Buyanghuanwu decoction can significantly elevate NGF mRNA expression of common peroneal nerve in rats with common peroneal nerve injury.It may be one of the mechanisms that Buyanghuanwu decoction can promote the repairing and regeneration of injured common peroneal nerve,and recovery of limb function.

Common peroneal nerve injury,Buyanghuanwu decoction,Common peroneal nerve,Nerve growth factor,Message RNA,Rat,Traditional Chinese medicine,Schwann cell

國家自然科學(xué)基金，青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81302890)； 江蘇省高校自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(13KJB360003)；江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 (BK2011816)； 高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金面上項(xiàng)目 (新教師類)(20123237120004)；南京中醫(yī)藥大學(xué)青年自然科學(xué)基金(12XZR09)

張賽(1988～)，女，碩士，見習(xí)醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)基礎(chǔ)理論。

梅曉云(1954～)，女，碩士，博士生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)基礎(chǔ)理論，E-mail：xiaoyun663399@163.com。

R 651.3

A

0253-4304(2016)01-0007-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.01.02

2015-11-14

2015-12-30)