李 楠 陳 梅 李小寧 孫 康

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，咸陽市 712000，E-mail：linan_80_311@163.com)

論著·基礎(chǔ)研究

缺血性損傷致薄型子宮內(nèi)膜動(dòng)物模型的建立▲

李 楠 陳 梅 李小寧 孫 康

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，咸陽市 712000，E-mail：linan_80_311@163.com)

目的 利用缺血性損傷建立薄型子宮內(nèi)膜的動(dòng)物模型。方法 將30只SD大鼠分為對照組、模型1組和模型2組各10只。模型1組和2組分別阻斷雙側(cè)卵巢動(dòng)脈20 min和30 min，隨后恢復(fù)血流，對照組不阻斷卵巢動(dòng)脈。5 d后觀察各組大鼠子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)變化、微血管密度表達(dá)、單位內(nèi)膜面積中波形蛋白及角蛋白的面積。結(jié)果 與對照組比較，模型1組和2組子宮內(nèi)膜萎縮變薄(P<0.05)，內(nèi)膜腺體數(shù)量減少、排列稀疏且發(fā)育遲緩，微血管密度表達(dá)較低(P<0.05)、角蛋白及波形蛋白的面積減少(P<0.05)。但模型組間以上指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 通過阻斷卵巢動(dòng)脈20 min即可建立“缺血性損傷”薄型子宮內(nèi)膜動(dòng)物模型，該方法重復(fù)性好，更符合建立簡便、快速、最接近人體病理狀態(tài)動(dòng)物模型的需求。

薄型子宮內(nèi)膜；缺血性損傷；動(dòng)物模型；卵巢動(dòng)脈；大鼠

適合厚度的子宮內(nèi)膜能為胚泡植入提供黏附的場所和營養(yǎng)來源，是良好妊娠結(jié)局的保證。過薄的子宮內(nèi)膜可導(dǎo)致胚胎種植率明顯降低。近年來我們發(fā)現(xiàn)薄型子宮內(nèi)膜已經(jīng)成為部分體外受精及胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)患者取消周期、種植失敗的原因，也是部分潛在不孕癥患者的癥狀之一。因此，如何有效地改善薄型子宮內(nèi)膜的功能已經(jīng)成為婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域面臨的一個(gè)問題。目前對薄型子宮內(nèi)膜確切的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，也無合適的動(dòng)物模型用于這種疾病的研究。國外研究發(fā)現(xiàn)，薄型子宮內(nèi)膜常表現(xiàn)為內(nèi)膜腺上皮增生差、血管生長不良及再生減少等一系列病理學(xué)特征[1]。臨床中我們曾嘗試使用增加子宮內(nèi)膜血流的藥物治療薄型子宮內(nèi)膜患者，發(fā)現(xiàn)其能夠增加部分患者的內(nèi)膜厚度，因此，推測薄型子宮內(nèi)膜的發(fā)生可能與子宮內(nèi)膜缺血有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在通過阻斷子宮血供構(gòu)建子宮內(nèi)膜缺血?jiǎng)游锬Ｐ停瑫r(shí)觀察模型后子宮內(nèi)膜病理學(xué)變化，以此評價(jià)該模型作為薄型子宮內(nèi)膜動(dòng)物模型的科學(xué)性、可行性和實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雌性6～8周齡SD大鼠，體重180～200 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：SCXK(陜)2012-003。1.1.2 主要試劑和儀器：蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色液購自碧云天生物技術(shù)研究所；4%多聚甲醛、1% HCl-75%乙醇、堿液、80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯、丙三醇、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、抗原修復(fù)液(檸檬酸三鈉緩沖液)、4%多聚甲醛、3% H2O2/PBS、0.01%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X)、10% 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、濕盒購自中國國藥集團(tuán)；鼠抗CD34單克隆抗體、鼠抗波形蛋白單克隆抗體、鼠抗單克隆角蛋白抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)購自BioWorld公司。冷凍切片機(jī)(Leica公司，型號CM3050S)，倒置顯微鏡(Leica公司，型號IX71)。注射用青霉素G鈉粉針購自哈藥集團(tuán)制藥廠，批號H23021439。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立：將30只SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型1組和模型2組各10只。參照顏耀華等[2]的建模方法，運(yùn)用10%水合氯醛按0.3 ml/100 g的劑量腹腔注射以麻醉大鼠，腹部常規(guī)消毒后，打開腹腔，暴露子宮，對照組在開腹探查后暴露20 min，隨后腹腔內(nèi)灑少量青霉素G鈉針粉，0號絲線逐層關(guān)閉腹腔。模型1組，用微動(dòng)脈夾阻斷雙側(cè)卵巢動(dòng)脈血供20 min，模型2組阻斷雙側(cè)卵巢動(dòng)脈血供30 min，隨后均恢復(fù)血流，逐層關(guān)腹。術(shù)后普通飼料喂養(yǎng)，5 d后處死大鼠。

1.2.2 HE染色觀察各組大鼠子宮內(nèi)膜組織學(xué)變化特點(diǎn)：將大鼠斷頸處死，75%乙醇中浸泡消毒5～10 min。無菌條件下，小心剖取大鼠子宮，-20℃保存。將大鼠子宮包裹于包埋劑后，于冷凍切片機(jī)上進(jìn)行冷凍切片，設(shè)置切片厚度為5 μm。選取平整的切片進(jìn)行HE染色。將切片于4%多聚甲醛中固定10～30 s，水洗。染蘇木素3～5 min，水洗。1% HCl-75%乙醇分化5～10 s，水洗。用堿水促藍(lán)20 s，水洗。伊紅染色30～60 s，水洗。80%乙醇洗3～5 s，95%乙醇洗3～5 s，無水乙醇洗3～5 s，丙三醇封片。倒置顯微鏡下觀察。子宮內(nèi)膜厚度采用Leica Qwin Plus圖像處理軟件對HE染色后的切片進(jìn)行測量。

1.2.3 免疫組化法檢測大鼠子宮內(nèi)膜微血管密度(microvessel density，MVD)：獲得的子宮組織經(jīng)PBS漂洗3次后，4%多聚甲醛固定10 min。3% H2O2/PBS室溫孵育10 min，PBS漂洗5 min/次×3次。將切片浸入抗原修復(fù)液中，96℃ 5 min。用1 ml移液器在切片表面加2 ml PBS洗滌，5 min/次×3次。10% FBS封閉，室溫15 min。加入CD34抗體，4℃孵育過夜。洗片：用1 ml移液槍在切片表面加2 ml PBS洗滌，5 min/次×3次。加入二抗羊抗鼠IgG-FITC、羊抗鼠HRP至切片上，每片1滴。37℃孵育30 min。PBS漂洗，5 min/次×3次。封片，熒光顯微鏡下觀察。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對圖片進(jìn)行分析。

1.2.4 免疫組化法檢測大鼠子宮內(nèi)膜角蛋白、波形蛋白表達(dá)：獲得的子宮組織經(jīng)PBS漂洗3次后，4%多聚甲醛固定10 min。3% H2O2/PBS室溫孵育10 min，PBS漂洗5 min/次×3次。將切片浸入抗原修復(fù)液中，96℃ 5 min。用1 ml移液器在切片表面加2 ml PBS洗滌，5 min×3。10%FBS封閉，室溫15 min。加入波形蛋白、角蛋白抗體，4℃孵育過夜。洗片：用1 ml移液槍在切片表面加2 ml PBS洗滌，5 min/次×3次。加入二抗羊抗鼠HRP至切片上，每片1滴。37℃孵育30 min。PBS漂洗，5 min/次×3次。封片，熒光顯微鏡下觀察。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對圖片進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織學(xué)變化特點(diǎn) 與對照組比較，各模型組子宮內(nèi)膜萎縮變薄(P<0.05)，腺體數(shù)量減少、排列稀疏發(fā)育遲緩，腺上皮細(xì)胞完整，呈單層立方上皮，間質(zhì)致密、細(xì)胞變少、變??；但模型組間子宮內(nèi)膜厚度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1及圖1。

表1 對照組與模型組大鼠 子宮內(nèi)膜厚度、MVD比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05。

對照組 模型組1 模型組2

圖1 3組子宮內(nèi)膜組織學(xué)變化情況(HE染色，×100)

2.2 各組大鼠子宮內(nèi)膜MVD比較 對照組子宮內(nèi)膜組織中微血管豐富，MVD明顯高于各模型組(P<0.05)。模型組之間MVD表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1及圖2。

對照組 模型組1 模型組2

圖2 3組子宮內(nèi)膜組織MVD(免疫組化染色，×100)

2.3 各組大鼠子宮內(nèi)膜波形蛋白及角蛋白表達(dá) (1)角蛋白表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞漿中，以此評估上皮生長情況。對照組單位內(nèi)膜面積中細(xì)胞角蛋白的面積均大于各模型組(P<0.05)，而模型組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2及圖3。(2)波形蛋白主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞和少量內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中，以此評估間質(zhì)中細(xì)胞生長情況。各模型組子宮內(nèi)膜單位面積內(nèi)波形蛋白的面積均低于對照組(P<0.05)，而模型組之間相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2及圖4。

表2 對照組和模型組子宮內(nèi)膜 角蛋白及波形蛋白面積比較(x±s，%)

注：與對照組比較，*P<0.05。

對照組 模型組1 模型組2

圖3 3組子宮內(nèi)膜組織角蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色，×200)

對照組 模型組1 模型組2

圖4 3組子宮內(nèi)膜組織波形蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色，×200)

3 討 論

子宮內(nèi)膜厚度與妊娠結(jié)局密切相關(guān)，適宜的子宮內(nèi)膜厚度(8～14 mm)是胚胎植入的必要條件[3]，也是決定生育的重要因素[4]。隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，薄型子宮內(nèi)膜已經(jīng)成為臨床醫(yī)生面臨的又一挑戰(zhàn)。由于其病因復(fù)雜，涉及多種因素，確切機(jī)制尚不清楚，近年來有關(guān)薄型子宮內(nèi)膜的研究重點(diǎn)集中在試圖增加內(nèi)膜厚度的治療方法及藥物，治療方案從藥物刺激子宮內(nèi)膜增生、改善內(nèi)膜血流到子宮內(nèi)膜搔刮術(shù)、宮腔局部注射粒細(xì)胞集落刺激因子、生物電刺激等[5-9]，而基礎(chǔ)研究并未得到同步發(fā)展，目前尚無合適的動(dòng)物模型用于這種疾病研究。因此建立簡便、快速的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對于薄型子宮內(nèi)膜的機(jī)制研究具有重要意義。

相關(guān)組織病理學(xué)和分子生物學(xué)檢測已經(jīng)證實(shí)了薄型子宮內(nèi)膜存在血管發(fā)育不良、再生減少的現(xiàn)象[1]，因此子宮內(nèi)膜慢性缺血是必然結(jié)局。國外學(xué)者已肯定了子宮內(nèi)膜慢性缺血及薄型子宮內(nèi)膜間存在關(guān)聯(lián)[1，10]。隨后國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室通過結(jié)扎SD雌性大鼠雙側(cè)子宮動(dòng)脈，造成子宮內(nèi)膜慢性缺血狀態(tài)，觀察子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)大鼠子宮內(nèi)膜變薄、腺體減少、血管發(fā)育不良及腺上皮細(xì)胞受損[4，11]。這些病理特征與臨床上薄型子宮內(nèi)膜的病理改變基本一致，再一次通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了子宮內(nèi)膜慢性缺血與薄型子宮內(nèi)膜之間的聯(lián)系。但此研究方法存在一定的弊端：模型建造周期長，歷時(shí)3個(gè)月之久，可操作性不強(qiáng)；其次，由于大鼠子宮動(dòng)脈纖細(xì)、分支多的生理特點(diǎn)，結(jié)扎的程度較難掌握，對手術(shù)技術(shù)要求高。因此該方法難于被廣泛應(yīng)用。

由于子宮動(dòng)脈是卵巢動(dòng)脈的一個(gè)分支，阻斷卵巢動(dòng)脈可有效減少子宮動(dòng)脈的血液供應(yīng)，使子宮內(nèi)膜處于低流量灌注的狀態(tài)。因此本研究借鑒子宮動(dòng)脈結(jié)扎法的部分機(jī)制，以缺血再灌注后的低灌流現(xiàn)象為基礎(chǔ)，采用短時(shí)阻斷卵巢動(dòng)脈的方法，建立子宮內(nèi)膜缺血模型。為確定阻斷子宮血流供應(yīng)的最佳時(shí)間，我們參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告[2]，分別對卵巢動(dòng)脈阻斷了20 min和30 min。觀察1個(gè)動(dòng)情周期后子宮內(nèi)膜組織學(xué)變化、MVD及相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，阻斷卵巢動(dòng)脈20 min和30 min后均能夠達(dá)到使子宮內(nèi)膜變薄的目的，且與對照組比較，在子宮內(nèi)膜血供不足的情況下，MVD也同步降低，角蛋白和波形蛋白面積減小(P<0.05)，提示血管形成不良，上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的再生長受限。這些變化與臨床上薄型子宮內(nèi)膜的病理改變相似。本研究結(jié)果亦顯示，模型1組與模型2組的子宮內(nèi)膜厚度、MVD、子宮內(nèi)膜角蛋白面積及波形蛋白面積比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示阻斷20 min的子宮內(nèi)膜變化與30 min比較并無差異。相比之下，阻斷20 min不僅能建立薄型子宮內(nèi)膜動(dòng)物模型，而且手術(shù)時(shí)間短，所需麻醉藥量少，對動(dòng)物干擾相對較少，且術(shù)后蘇醒快，更符合簡便、快速、最接近人體病理狀態(tài)的薄型子宮內(nèi)膜實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的需求。

綜上所述，通過阻斷卵巢動(dòng)脈20 min即能建立“缺血性損傷”薄型子宮內(nèi)膜動(dòng)物模型，該方法重復(fù)性好且簡便。

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Animal modeling of thin endometrium caused by ischemic injury

LINan,CHENMei,LIXiao-ning,SUNKang

(DepartmentofGynaecolog,AffiliatedHospitalofShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712000,China)

Objective To establish the animal model of thin endometrium based on ischemic injury.Methods Thirty SD rats were divided into control group,model Ⅰ group and model Ⅱ group,with 10 rats in each group.The bilateral arteriae ovarica occlusion was performed in the model Ⅰ group and model Ⅱ group for 20 and 30 minutes respectively,and then the blood flow reperfused.The arteriae ovarica occlusion was not performed in the control group.After 5 days,the pathological changes of endometrial tissues,expression of endometrial microvessel density(MVD),areas of vimentin and keratin in unit endometrial areas were observed in three groups.Results Compared to control group,model Ⅰ group and model Ⅱ group had thinner endometrial thickness(P<0.05),less endometrial glands which appeared sparse arrangement and developmental delay,lower expression of MVD,and less areas of vimentin and keratin(P<0.05).There were no significant differences in the indices mentioned above between two model groups(P>0.05).Conclusion The ischemic injury-induced animal model of thin endometrium can be established by a 20-minute arteriae ovarica occlusion.This model has good repeatability,and accorded with the requirement of establishing an animal model simply and rapidly which is more similar to human pathological state.

Thin endometrium,Ischemic injury,Animal model,Arteriae ovarica,Rat

陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2013JQ4010)

李楠(1980～)，女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥治療女性生殖內(nèi)分泌。

R 711.74

A

0253-4304(2016)01-0010-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.01.03

2015-10-27

2016-01-02)