陳治偉 劉曉光 韓創(chuàng)業(yè) 朱廣志 蘇 浩 于 龍 魯 磊 廖錫文 覃 瑋 楊成昆 劉征濤 葉新平 李佳荃 桂 瀅 莫曾南 胡艷玲 肖開銀 彭 濤

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，南寧市 530021，E-mail：yzxiaozhi@163.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧市 530021)

論著·基礎(chǔ)研究

肝細(xì)胞癌切除術(shù)后行經(jīng)導(dǎo)管肝動脈灌注化療術(shù)患者ALT水平改變相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點分析▲

陳治偉1劉曉光1韓創(chuàng)業(yè)1朱廣志1蘇 浩1于 龍1魯 磊1廖錫文1覃 瑋1楊成昆1劉征濤1葉新平1李佳荃2桂 瀅2莫曾南2胡艷玲2肖開銀1彭 濤1

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，南寧市 530021，E-mail：yzxiaozhi@163.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧市 530021)

目的 探討影響原發(fā)性肝細(xì)胞癌(PHC)切除術(shù)后行經(jīng)導(dǎo)管肝動脈灌注化療術(shù)(TAC)患者血清ALT水平變化相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點。方法 納入肝癌肝切除術(shù)后行TAC治療的PHC患者59例，獲取其術(shù)中切取標(biāo)本以提取組織DNA，通過芯片技術(shù)獲取全外顯子SNP。通過EMMAX檢驗多因素分析選擇與術(shù)后ALT/術(shù)前ALT比值相關(guān)的SNP位點。通過KOBAS 2.0 program數(shù)據(jù)庫篩選有關(guān)的候選SNP位點，采用線性回歸模型分析影響患者術(shù)后ALT變化的基因型。結(jié)果 KOBAS 2.0 program篩選結(jié)果顯示，位于12號染色體SLCO1B1基因上的rs2306283與患者術(shù)后ALT/術(shù)前ALT比值升高相關(guān)(最小等位基因頻率=0.132，P=3.65×10-5)。線性回歸分析結(jié)果顯示，相對于GG基因型，SLCO1B1基因的AA+AG基因型OR=2.55(P<0.05)，rs2306283為顯性遺傳模型，AA基因型和AG基因型為風(fēng)險基因型。結(jié)論 肝細(xì)胞癌切除術(shù)后行TAC患者SLCO1B1基因rs2306283的 AA和AG基因型可能與術(shù)后ALT水平升高相關(guān)。

原發(fā)性肝細(xì)胞癌；經(jīng)肝動脈化療術(shù)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶；單核苷酸多態(tài)性；全基因組關(guān)聯(lián)分析

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)是最常見的惡性腫瘤之一，在中國每年發(fā)病約36萬例，年死亡約35萬例，因此也是我國最常見的致死惡性腫瘤之一[1-2]。PHC主要的治療方法是早期手術(shù)切除，然而即使是根治性切除，其術(shù)后復(fù)發(fā)率依然很高，遠(yuǎn)期療效并不理想[3]。經(jīng)導(dǎo)管肝動脈灌注化療術(shù)(trans-catheter arterial chemotherapy，TAC)是一種常用于肝癌切除術(shù)后預(yù)防肝癌復(fù)發(fā)的輔助治療方法之一，而這一侵入性治療術(shù)后常引起患者肝功能損害，表現(xiàn)為ALT等酶學(xué)指標(biāo)改變[4]，而ALT是評估肝功能改變的常用指標(biāo)[5]。在臨床治療中，常能觀察到患者行TAC治療術(shù)后血清ALT的改變存在個體化差異，并且我們在前期研究[6-7]中發(fā)現(xiàn)人群ALT水平的個體化差異存在遺傳基礎(chǔ)。因此我們通過對PHC切除術(shù)后預(yù)防性行TAC術(shù)患者的臨床資料進行分析，采用全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-Wide Association Study，GWAS)方法，探討與TAC術(shù)后ALT水平改變可能相關(guān)的遺傳因素，為臨床制訂個體化治療方案提供參考。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集2003年9月至2013年12月于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科行肝癌肝切除術(shù)患者485例，術(shù)中切除標(biāo)本均立即送至我科-80℃冰箱進行保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)HBsAg均為陽性；(2)患者行肝癌切除術(shù)術(shù)前未接受任何介入治療及化療；(3)術(shù)后病理診斷均為肝細(xì)胞癌；(4)術(shù)后1～2個月返院行TAC術(shù)；(5)TAC術(shù)中用藥方案為5-氟尿嘧啶500～1 000 mg、順鉑30～50 mg、吡柔比星30～50 mg；(6)術(shù)前及術(shù)后第1天均檢測肝功能。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)共納入59例病例，其中男性53例、女性6例，年齡27～75歲，中位年齡45歲，所有入組病例Child-Pugh評分均為A級[8]。1.2 血清ALT測定方法 所有入組病例采血均為清晨空腹(禁食12 h)臥位下采取靜脈血5 ml，采入真空分離膠采血管內(nèi)，靜止1 h后以2 000 r/min離心10 min，采用丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒(上海執(zhí)誠生物科技有限公司，批號：ZCAPRP015)進行檢測，樣品測定設(shè)備為日立全自動生化分析儀(型號：7600-020)。

1.3 相關(guān)SNP位點檢測方法

1.3.1 DNA提?。翰捎醚?細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，生產(chǎn)批號：M1909]對59例組織標(biāo)本中的DNA進行提取。為確保DNA質(zhì)量的可靠性，每例標(biāo)本DNA均使用Nano Drop 2000 system(美國Thermo Fisher Scientific公司，型號Nano Drop 2000)對其濃度和純度進行測定。所有步驟均按照試劑盒或儀器的說明進行操作。1.3.2 基因分型：59例DNA樣本由外顯子芯片(Illumina公司，Human Exome BeadChip V1.0)對其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點進行基因分型，芯片包含SNP位點為242 898個。1.3.3 全外顯子SNP檢測：通過iScan系統(tǒng)Illumina? HD Assay Ultra manual and imaging BeadChip檢測平臺對所有納入研究的芯片標(biāo)本外顯子SNP進行檢測，共檢測SNP 242 901個。這些SNP包括錯義SNP、剪切位點SNP和啟動子區(qū)SNP等。使用Genotyping Module v1.0 in GenomeStudio 2011.1版對59例樣本進行基因分型，平均分型率>98.5%。1.3.4 數(shù)據(jù)質(zhì)控：在全外顯子SNP檢測中，所有標(biāo)本均使用Plink 1.07版 (http://pngu.mgh.harvard.edu/～purcell/plink/download.shtml)、 R語言3.0.1(http://www.r-project.org/) 和EIGENSOFT package(http://genetics.med.harvard.edu/reich/Reich_Lab/Software.html)軟件包進行質(zhì)控。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)剔除基因分型率<95%的樣本；(2)剔除性別不確定的樣本；(3)剔除全基因組血緣相似度>0.1875的樣本；(4)對59例標(biāo)本行主成分分析，剔除離群樣本； (5)剔除應(yīng)答率<95%的SNP位點；(6)剔除哈-溫平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)P值<1×10-6的SNP位點；(7)剔除最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)<0.1的SNP位點。1.3.5 多因素分析：運用EPACTS軟件包3.2.6版(http://csg.sph.umich.edu//kang/epacts/download/index.html)進行多因素分析(EMMAX檢驗[9])，由于ALT是數(shù)量性狀，其值可能因使用不同試劑盒而產(chǎn)生誤差，因此我們采用術(shù)后ALT值/術(shù)前ALT比值作為本次研究的因變量，SNP位點為自變量，對民族、年齡、性別、體重指數(shù)(body mass index，BMI)、吸煙、飲酒和單位體表面積用藥量(包括5-氟尿嘧啶、順鉑、吡柔比星)作為協(xié)變量進行校正，計算得出與術(shù)后ALT/術(shù)前ALT比值升高相關(guān)且P值<0.05的SNP位點。

1.3.6 相關(guān)SNP位點篩選：通過KOBAS 2.0 program數(shù)據(jù)庫(http://kobas.cbi.pku.edu.cn)對SNP進行篩選。根據(jù)本次研究目的，相關(guān)SNP所在基因功能應(yīng)與肝炎、肝硬化、肝癌、肝臟代謝通路、肝臟藥物代謝有關(guān)，以此條件篩選出符合條件的候選SNP位點。

1.4 相關(guān)定義或標(biāo)準(zhǔn) (1)吸煙指承認(rèn)有吸煙行為，且持續(xù)吸煙超過6個月；飲酒指承認(rèn)既往有飲用含酒精飲料史，如白酒、葡萄酒、啤酒等；(2)BMI≥25 kg/m2定義為肥胖[10]，肥胖是非酒精性脂肪肝的高危因素[11]，非酒精性脂肪肝可引起血清ALT升高[12]，因此將BMI以25 kg/m2進行分組比較其ALT比值是否存在差異性；(3)巴塞羅那分期(Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC)標(biāo)準(zhǔn)采用2010版標(biāo)準(zhǔn)[8]；(4)腫瘤數(shù)目綜合術(shù)中解剖所見及術(shù)后病理報告，以病理報告為準(zhǔn)；(5)腫瘤大小為術(shù)中解剖離體肝癌標(biāo)本所測最大腫瘤長徑，多個腫瘤者則以最大橫徑相加所得。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。呈偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗分析；針對候選SNP位點，采用線性回歸模型，以候選SNP位點基因型為自變量，術(shù)后ALT/術(shù)前ALT比值為因變量，同時矯正了民族、年齡、性別、吸煙、飲酒、BMI和單位體表面積用藥量，計算SNP基因型的相關(guān)系數(shù)，并由此推算該SNP基因型的危險度(odds ratio，OR)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同臨床特征患者的術(shù)后ALT/術(shù)前ALT比值 59例TAC術(shù)患者中，不同臨床特征分組患者的術(shù)后ALT/術(shù)前ALT比值比較，差異性均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示以上因素對患者的術(shù)后ALT/術(shù)前ALT比值無明顯影響，見表1。

表1 不同臨床特征分組患者的術(shù)后

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控及EMMAX檢驗多因素分析結(jié)果 所有經(jīng)EPACTS軟件包運算得到的SNP(包括MAF<0.1的SNP)均在曼哈頓圖中顯示，見圖1。根據(jù)SNP的數(shù)據(jù)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)EPACTS軟件包運算，59例標(biāo)本外顯子芯片，共有836個SNP被納入最終研究。

注：SLCO1B1(rs2306283)如曼哈頓圖中所示，P=3.65×10-5，-lg(P)=4.44。

圖1 曼哈頓圖

根據(jù)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，我們只關(guān)注滿足MAF>0.1且P值最具有顯著性(按P值從小到大排列的前10位)的10個SNP，見表2。10個SNP的相關(guān)基因型中，SRRD、HPS4、AGBL4基因的AA基因型以及ALDH7A1、ARIH1基因的TT基因型均為保護型基因型(OR<1，P<0.05)，SLCO1B1、AGBL4、MRC1L1、AGT基因的AA+AG基因型以及PCDH20基因的TT+TG基因型為風(fēng)險基因型(OR>1，P<0.05)，見表3。

2.3 相關(guān)SNP位點篩選及線性回歸分析的結(jié)果 通過生物信息學(xué)平臺KOBAS 2.0 program進一步篩選，在入組的10個SNP中，我們發(fā)現(xiàn)1個SNP(rs2306283，MAF=0.132，P=3.65×10-5)可能與TAC術(shù)后ALT/術(shù)前ALT比值升高相關(guān)。線性回歸分析結(jié)果顯示，相對于GG基因型，AA+AG基因型的OR=2.55(P=0.048)，因此rs2306283是顯性遺傳模型，即攜帶A基因型則表現(xiàn)出顯性性狀。由于AG+AG基因型的OR>1，因此AA基因型和AG基因型均是風(fēng)險基因型。

表2 符合入組條件的10個SNP

注：a：SNP位置標(biāo)注基于NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)標(biāo)識；b：M代表高頻等位基因，m代表低頻等位基因；c：P值矯正了民族、年齡、性別、吸煙、飲酒、BMI和單位體表面積用藥量因素。

表3 入組SNP基因型對TAC患者術(shù)后ALT/術(shù)前ALT比值變化影響的多因素分析

注：a：P值矯正了民族、年齡、性別、吸煙、飲酒、BMI和單位體表面積用藥量因素；b：OR值由自然數(shù)e的β次方計算得出。

3 討 論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一批與TAC術(shù)后患者血清ALT水平升高相關(guān)的潛在SNP，按照P值由小到大的順序選出前10位的SNP，其中顯著性最高的是rs4820682，其位于22號染色體的SRRD基因上，SRRD又稱SRR1基因，其與SRR2基因共同構(gòu)成神經(jīng)細(xì)胞分化關(guān)鍵基因SOX2的增強因子，SRR1基因中包含POU轉(zhuǎn)錄因子，POU轉(zhuǎn)錄因子可指導(dǎo)Sox2的表達(dá)[13]。排在第2位的rs1894706位于22號染色的HPS4基因上，日本的一項針對精神分類癥患者認(rèn)知功能的GWAS研究結(jié)果顯示，HPS4編碼的BLOC-3蛋白與精神分裂癥患者的認(rèn)知障礙有關(guān)[14]。排在第3位的rs2306283位于12號染色體SLCO1B1基因上，SLCO1B1基因是編碼肝臟細(xì)胞的一種跨膜轉(zhuǎn)運受體，而這一受體參與藥物在肝臟中的清除相關(guān)[15]。rs3127553和rs657452則位于1號染色體AGBL4基因中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)AGBL4基因上CpG島的甲基化與結(jié)腸癌的發(fā)生相關(guān)[16]。rs1926736位落于10號染色體的MRC1L1基因中，MRC1L1基因編碼的蛋白質(zhì)是一種膜受體，該受體主要功能介導(dǎo)的糖蛋白的內(nèi)吞作用。一項針對中國西南方漢族人群的GWAS研究結(jié)果顯示，MRC1L1的基因變異與麻風(fēng)病相關(guān)[17]。rs699位于1號染色AGT基因上，其編碼的蛋白與血管緊張素合成相關(guān)，在一項針對波蘭運動員的耐力和爆發(fā)力遺傳因素研究中，AGT基因的rs699的多態(tài)性被認(rèn)為與運動員的爆發(fā)力相關(guān)，而與耐力無關(guān)[18]。rs12514417位于5號染色體的ALDH7A1基因上，其所編碼的蛋白是乙醛脫氫酶家族的成員，該酶主要作用是參與酒精代謝和脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的醛類物質(zhì)的解毒過程。Giacalone等[19]認(rèn)為，ALDH7A1的表達(dá)與經(jīng)手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌復(fù)發(fā)相關(guān)。另外有文獻(xiàn)報告，ALDH7A1 rs1318240與對食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生有關(guān)[20]。rs1374092位于15號染色體ARIH1基因上，ARIH1又稱為HHARI，其編碼的蛋白質(zhì)是一種泛素蛋白質(zhì)連接酶，該酶對細(xì)胞增殖有至關(guān)重要的作用[21]。rs3812874位于13號染色體PCDH20基因上，有學(xué)者認(rèn)為PCDH20 可能是一個潛在的肝細(xì)胞肝癌[22]和鼻咽癌[23]的腫瘤抑制基因。既往也曾有研究表明ALT水平是受遺傳因素影響[24]。本課題組前期的Meta分析研究結(jié)果顯示，PNPLA3基因rs738409的多態(tài)性與血清ALT水平相關(guān)[6]。本課題組在前期的GWAS研究中發(fā)現(xiàn)，位于SLC35F3 基因的rs10157061、rs10752781和rs1878544可能與酒精暴露下的人群血清ALT 水平存在相關(guān)性，推測SLC35F3可能是調(diào)節(jié) ALT 水平的關(guān)鍵基因[7]。目前尚無文獻(xiàn)報告本研究中入組的SNP與TAC術(shù)后血清ALT水平直接相關(guān)。

我們將所有入組的SNP位點經(jīng)KOBAS 2.0 program生物信息平臺進一步篩選，分析各SNP所在基因的功能和信號通路，發(fā)現(xiàn)位于12號染色體SLCO1B1基因上rs2306283在功能學(xué)上較其他SNP更有可能是造成TAC術(shù)后血清ALT變化的潛在SNP位點。rs2306283位于12號染色體SLCO1B1基因中，SLCO1B1基因是編碼肝臟特異性有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員，其編碼的蛋白質(zhì)是一種跨膜轉(zhuǎn)運受體，而這一受體參與藥物在肝臟中的清除，如他汀類藥物、甲氨蝶呤等從肝細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運至血液中[13，25-26]。相關(guān)文獻(xiàn)報告，SLCO1B1的遺傳變異對用于治療癌癥和自身免疫疾病的藥物有顯著影響，在SLCO1B1基因的常見突變體中，缺乏一種編碼肝臟轉(zhuǎn)運子，而該轉(zhuǎn)運子是從機體清除藥物的關(guān)鍵，從而影響機體清除化療藥物的效率，而這一影響已被證實在使用化療藥物甲氨蝶呤時尤為顯著，甲氨蝶呤的低清除狀況，導(dǎo)致血液中甲氨蝶呤的蓄積并增加其毒副作用[13]。而目前尚無文獻(xiàn)報告其與肝癌切除術(shù)后TAC術(shù)中使用的常規(guī)化療藥物引起肝功能損害與SLCO1B1基因有關(guān)。

通過建立線性相關(guān)模型，發(fā)現(xiàn)SLCO1B1基因中的rs2306283的顯性遺傳模型(AA和AG)較隱性遺傳模型(GG)更易發(fā)生術(shù)后肝功能損害，這可能與甲氨蝶呤從肝臟中清除機理相似，即SLCO1B1的遺傳變異使得TAC術(shù)中常用化療藥在肝臟蓄積并導(dǎo)致肝臟細(xì)胞受損，從而引起ALT升高，而顯性遺傳模型(AA和AG)有可能是導(dǎo)致SLCO1B1遺傳變異的因素之一。這一研究結(jié)果可能對指導(dǎo)臨床介入治療有指導(dǎo)意義。隨著個體化醫(yī)療的發(fā)展，通過基因檢測技術(shù)給予患者最合理的治療方案并評估其預(yù)后是醫(yī)學(xué)發(fā)展的必然方向。在TAC治療術(shù)前，我們可以通過基因檢測技術(shù)，檢測患者是否攜帶相關(guān)風(fēng)險基因型，從而評估患者TAC術(shù)后發(fā)生肝功能損壞的風(fēng)險，并進一步指導(dǎo)臨床用藥方案及調(diào)整用藥劑量。

本研究存在一定的局限性：首先由于苛刻的入組標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，研究納入的病例數(shù)較少；其次本次入組病例TAC方案僅為順鉑、吡柔比星、5-氟尿嘧啶三聯(lián)用藥方案，其他用藥方案仍需進一步驗證；最后本研究的人群局限于廣西人群，還需要多中心對照研究驗證。

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Analysis on single nucleotide polymorphism loci related to ALT level variation in patients undergoing trans-hepatic artery chemotherapy after resection for hepatocellular carcinoma

CHENZhi-wei1,LIUXiao-guang1,HANChuang-ye1,ZHUGuang-zhi1,SUHao1,YULong1,LULei1,LIAOXi-wen1,QINWei1,YANGCheng-kun1,LIUZheng-tao1,YEXin-ping1,LIJia-quan2,GUIYing2,MOZeng-nan2,HUYan-ling2,XIAOKai-yin1,PENGTao1

(1DepartmentofHepatobiliarySurgery,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;2GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the single nucleotide polymorphism(SNP) loci related to the serum ALT level variation in patients undergoing trans-catheter arterial chemotherapy(TAC) after resection for primary hepatocellular carcinoma(PHCC).Methods Fifty-nine patients with PHCC who underwent TAC after resection for liver cancer were enrolled,and their DNAs were extracted from the specimens obtained in surgical resection.The SNPs of whole exons were acquired using DNA chips technology.The SNP loci related to postoperative ALT/preoperative ratio were selected by EMMAX multivariate analysis.The relative candidate SNP loci were screened by KOBAS 2.0 program database.The genotypes influencing postoperative ALT variation of the patients were analyzed by linear regression analysis.Results The result screened by KOBAS 2.0 program showed that rs2306283 located in SLCO1B1 gene of chromosome12 was related to elevated postoperative ALT/preoperative ratio(minor allele frequency=0.132,P=3.65×10-5).The result of linear regression analysis showed that OR value of SLCO1B1 gene AA+AG genotype was 2.55(P<0.05),rs2306283 was a dominant model,and AA and AG genotypes were risk genotypes.Conclusion For patients underwent TAC after resection for PHCC,AA genotype and AG genotype of SLCO1B1 gene rs2306283 are probably associated with the elevation of postoperative ALT level.

Primary hepatocellular carcinoma,Trans-hepatic artery chemotherapy,Alanine aminotransferase,Single nucleotide polymorphism,Genome-wide association study

國家自然科學(xué)基金(81560535，81072321，30760243，30460143，30560133)，2009年教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃(NCET)，廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(桂科攻1104003A-7)，廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點科研課題(重201018)

陳治偉(1989～)，男，碩士，醫(yī)師，研究方向：肝細(xì)胞肝癌介入治療的并發(fā)癥及其遺傳基礎(chǔ)分析。

彭濤(1969～)，男，博士，教授、主任醫(yī)師、博士生導(dǎo)師，研究方向：原發(fā)性肝癌的病因，E-mail：pengtaocn@hotmail.com。通信作者：肖開銀(1970～)，男，博士，教授、主任醫(yī)師、碩士生導(dǎo)師，研究方向：肝膽外科疾病的基礎(chǔ)及臨床研究，E-mail：xiaokaiyin@163.com。

R 342.4

A

0253-4304(2016)12-1629-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.12.01

2016-06-07

2016-08-16)