黎珊珊 鐘國強 蔣智淵 溫麗娜

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，南寧市 530021，E-mail：xiaobaishanshan33@126.com)

論著·基礎(chǔ)研究

人類微小RNA-208a的靶基因預(yù)測及生物學(xué)過程和信號通路的生物信息學(xué)分析

黎珊珊 鐘國強 蔣智淵 溫麗娜

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，南寧市 530021，E-mail：xiaobaishanshan33@126.com)

目的 采用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測人類微小RNA-208a(hsa-miRNA-208a)靶基因及分析其可能參與的生物學(xué)過程及信號通路。方法 應(yīng)用miRbase數(shù)據(jù)庫和UCSC Genome Browser分析工具獲取hsa-miRNA-208a的染色體定位、堿基序列和物種保守性等基本信息，利用miRanda、miRDB、TargetScan和miRwalk進行靶基因預(yù)測，采用miRwalk網(wǎng)站對靶基因取交集，合并有文獻支持和經(jīng)實驗證實的靶基因作為基因集，對基因集進行功能富集分析(GO分析)和信號通路分析。結(jié)果 hsa-miRNA-208a序列在各物種間高度保守。對TargetScan、miRDB、miRanda和miRwalk預(yù)測的靶基因進行交集后共得到16個靶基因(CPEB2、CSNK2A2、DLD、MTF2、FBXO28、LEP、SMAD4、NLK、GPR88、VPS13D、ZNF215、CHD9、SLC7A5、C19orf44、SLC45A3、MAP4K4)，miRwalk、DIANA Lab TarBase檢索到已驗證的靶基因分別為12個(CASP3、MRGPRX3、FPRL1、MED13、IL10、GATA4、HSH2D、MYH6、MYH7、TNNI3、CDKN1A、PAK3)和3個(SOX6、MTM1、TAB3)。GO分析結(jié)果顯示靶基因富集于心室肌組織發(fā)育、心室形態(tài)發(fā)育、心腔發(fā)育、心肌發(fā)育、心臟發(fā)育以及細胞發(fā)育等生物學(xué)過程(P<0.05)；信號通路分析結(jié)果顯示靶基因富集于黏附連接、緊密連接、心肌收縮、Wnt信號通路以及病毒性心肌炎、肥厚型心肌病和擴張型心肌病的相關(guān)信號通路中(P<0.05)。結(jié)論 hsa-miRNA-208a參與心臟生長發(fā)育的生物學(xué)過程，與心肌疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

微小RNA-208a；人類；生物信息學(xué)；靶基因；心臟生長發(fā)育；心肌疾病

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約20～24個核苷酸的內(nèi)源性、非編碼RNA，它通過影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，參與多細胞生物表達基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。成熟miRNA整合入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，miRNA 5′端第2～8個核苷酸(種子序列)通過與靶基因mRNA 3′非編碼區(qū)序列完全或不完全互補聯(lián)系于RISC，導(dǎo)致靶基因mRNA降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控靶基因的表達。近年來，對miRNA的研究已成為生命科學(xué)領(lǐng)域中的一個重要方向。miRNA分布廣泛，參與的生物學(xué)過程復(fù)雜，調(diào)控的靶基因眾多，因此研究miRNA的功能及作用機制有重要意義。目前確定miRNA靶基因的方法主要包括生物信息學(xué)軟件預(yù)測和生物學(xué)實驗方法[1]。生物信息學(xué)是一門交叉學(xué)科，它包含了生物信息的獲取、處理、儲存、分析和解釋等內(nèi)容，綜合運用數(shù)學(xué)、計算機科學(xué)和生物學(xué)的各種工具來闡明和理解大量數(shù)據(jù)所包含的生物學(xué)意義[2]。預(yù)先進行生物信息學(xué)研究能為研究者提供較大的幫助，為后續(xù)實驗提供思路，提高實驗效率[3]。已有研究證實miRNA-208a與心房顫動、心肌肥厚、急性心肌梗死、查加斯病心肌病變、中東呼吸綜合征及肌強直性營養(yǎng)不良等有關(guān)[4-9]，但其生物功能仍有待進一步闡明。本研究擬利用生物信息學(xué)方法對人類miRNA(homo sapiens-miRNA)-208a進行分析，為進一步研究其生物功能提供線索。

1 資料與方法

1.1 資料來源 使用PubMed數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)hsa-miRNA-208a相關(guān)文獻進行檢索，使用miRbase(http://www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫和UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/)分析工具獲取hsa-miRNA-208a的染色體定位、堿基序列和物種保守性等基本信息。

1.2 研究方法 綜合miRNAbase和UCSC Genome Browser 獲取hsa-miRNA-208a的基本信息。利用miRanda (http://www.microrna.org/microrna/home.do)、miRDB (http://www.mirdb.org/miRDB/)、TargetScan (http://www.targetscan.org/)、miRNAwalk(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)4種方法預(yù)測hsa-miRNA-208a靶基因后，使用miRNAwalk(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)對靶基因取交集。然后合并有文獻支持以及由miRwalk和DIANA Lab TarBase檢索到的經(jīng)實驗證實的靶基因共同作為進一步生物信息學(xué)分析的基因集合。使用基因本體(gene ontology，GO)分析網(wǎng)站(http://geneontology.org/)和DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對此基因集進行功能富集分析，并利用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)進行信號通路富集分析，即得到基因集在GO類別上的高頻率注釋及有統(tǒng)計學(xué)意義的信號通路。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 has-miRNA-208a染色體定位及物種保守性分析 hsa-miRNA-208a定位于染色體14q11.2。使用miRbase檢索到包括人類在內(nèi)共10個不同物種的miRNA-208a成熟miRNA序列并進行分析，miRNA-208a的“AUAAGACGAGCAAAAAGC”18個堿基序列在這10個物種中高度保守，見表1。

表1 不同物種miRNA-208a成熟序列

注：mmu：mus musculus(小鼠)；rno：rattus norvegicus(大鼠)；mdo：monodelphis domestica(負鼠)；mml：macaca mulatta(獼猴)；ptr：pan troglodytes(黑猩猩)；bta：bos taurus(牛)；cfa：canis familiaris(犬)；eca：equus caballus(馬)：ppy：pongo pygmaeus(猩猩)。

2.2 hsa-miRNA-208a靶基因預(yù)測TargetScan、miRDB、miRanda和miRwalk軟件預(yù)測 hsa-miRNA-208a靶基因分別為2 799、548、4 757、634個，然后使用miRwalk對hsa-miRNA-208a靶基因進行交集(基于miRanda、miRDB、miRwalk、TargetScan)，共得到16個基因，分別為CPEB2、CSNK2A2、DLD、MTF2、FBXO28、LEP、SMAD4、NLK、GPR88、VPS13D、ZNF215、CHD9、SLC7A5、C19orf44、SLC45A3、MAP4K4。miRwalk中查到經(jīng)驗證的靶基因有12個，分別為CASP3、MRGPRX3、FPRL1、MED13、IL10、GATA4、HSH2D、MYH6、MYH7、TNNI3、CDKN1A、PAK3。DIANA Lab TarBase數(shù)據(jù)庫中查到已收錄的實驗數(shù)據(jù)支持的靶基因有SOX6、MTM1、TAB3。2.3 hsa-miRNA-208a靶基因GO分析和信號通路分析結(jié)果 將預(yù)測的靶基因和已證實的靶基因進行合并后進行GO功能富集分析，結(jié)果顯示這些靶基因富集在心室肌組織發(fā)育、心室形態(tài)發(fā)育、心腔發(fā)育、心肌發(fā)育、心臟發(fā)育、細胞發(fā)育過程以及細胞發(fā)育等生物學(xué)過程和功能上(P<0.05)，見表2。通過DAVID數(shù)據(jù)庫對hsa-miRNA-208a靶基因集進行基于KEGG的信號通路富集分析，結(jié)果顯示hsa-miRNA-208a靶基因富集在黏附連接、緊密連接、Wnt信號通路、心肌收縮通路等通路上，以及病毒性心肌炎、肥厚型心肌病和擴張型心肌病的疾病通路中(P<0.05)，見表3。

表2 hsa-miRNA-208a靶基因的GO富集分析結(jié)果

表3 hsa-miRNA-208a靶基因的Pathway分析結(jié)果

3 討 論

自miRNAs的生物學(xué)活動在哺乳動物細胞中被描述以來，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的miRNA超過2 500個，其中仍有1 000余個miRNAs的調(diào)控功能未被定義[10]。miRNA調(diào)控作用遍及生命體的各種活動中，對miRNA作用機制研究主要是針對其與靶基因的相互作用。盡管比較基因組學(xué)和高通量實驗研究能預(yù)測一個miRNA在轉(zhuǎn)錄組的數(shù)百個結(jié)合位點，但樣本穩(wěn)定性和可重復(fù)性差、實驗價格昂貴，且miRNA的表達受干擾后能導(dǎo)致多個預(yù)測靶基因和下游蛋白的微小變化，靶基因參與的調(diào)控機制也比較復(fù)雜，所以通過生物信息學(xué)對miRNA進行分析，預(yù)測其靶基因，并對其靶基因進行生物功能富集分析和通路富集分析，對確定miRNA的研究方向并指導(dǎo)生物實驗尤為重要。

miRNA-208a是肌球蛋白基因編碼的miRNAs家族中的一員，于2003年首次被發(fā)現(xiàn)，當時命名其為miRNA-208[11]。在2009年，發(fā)現(xiàn)miRNA-208b后miRNA-208重新命名為miRNA-208a。miRNA-208a在心臟細胞特異性高表達，由Myh6基因的29號內(nèi)含子編碼。其生理功能是協(xié)同miRNA-208b、miRNA-499參與控制心肌肌球蛋白含量、肌纖維特性和肌性能表現(xiàn)[12]。

本研究通過對多個物種間miRNA-208a成熟序列進行比對，發(fā)現(xiàn)多個種屬間該序列高度保守，表明它可完成許多生命形式所必須的基本功能。同時，我們采用miRanda、miRDB、TargetScan和miRwalk軟件進行靶基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)靶基因數(shù)目龐大，因此應(yīng)用miRwalk軟件篩選各預(yù)測軟件的交集部分，并合并DIANA Lab TarBase數(shù)據(jù)庫中已驗證的靶基因，進行GO富集分析和基于KEGG的信號通路分析。GO富集分析顯示hsa-miRNA-208a靶基因富集于心室肌組織發(fā)育、心室形態(tài)發(fā)育、心腔發(fā)育、心肌發(fā)育、心臟發(fā)育、細胞發(fā)育過程以及細胞發(fā)育等生物學(xué)過程和功能上。信號通路分析結(jié)果表明hsa-miRNA-208a存在黏附連接、緊密連接、心肌收縮、Wnt信號通路等通路上，以及病毒性心肌炎、肥厚型心肌病和擴張型心肌病的疾病通路中，hsa-miRNA-208a示其與心肌疾病的發(fā)生密切相關(guān)。目前其他學(xué)者也發(fā)現(xiàn)miRNA-208a表達異常主要是與各種心肌疾病的發(fā)生有關(guān)。其中，van Rooij等[13]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-208a與心肌肥大、纖維化有關(guān)，且miRNA-208a通過調(diào)節(jié)靶蛋白—甲狀腺激素受體相關(guān)蛋白參與壓力負荷下心肌肥厚與纖維化。Callis等[14]通過研究再次證明miRNA-208a與心肌肥厚相關(guān)，且發(fā)現(xiàn)miRNA-208a過表達的轉(zhuǎn)基因鼠出現(xiàn)房室傳導(dǎo)阻滯，而敲除miRNA-208a基因的小鼠出現(xiàn)心房顫動，提示miRNA-208a是心臟正常傳導(dǎo)所必需的，并與其調(diào)控唯同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白、鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子4和縫隙連接蛋白40有關(guān)。有學(xué)者通過尸檢發(fā)現(xiàn)，與正常成人和胎兒相比，心肌梗死者心肌組織miRNA-208a表達上調(diào)，在心肌梗死者和胎兒心臟中miRNA的表達模式相似，提示在心臟重塑中心臟遺傳因子發(fā)生了重編程[15]。另一項關(guān)于擴張型心肌病的研究結(jié)果顯示，人心肌組織中miRNA-208a表達量與β-MHC的mRNA表達量以及心肌膠原含量有關(guān)，miRNA-208a表達升高提示預(yù)后不佳[16]。

綜上所述，hsa-miRNA-208a參與心臟生長發(fā)育的生物學(xué)過程，與心肌疾病的發(fā)生密切相關(guān)。我們的研究結(jié)果提示，hsa-miRNA-208a除了與心肌病與缺血性心肌病變發(fā)生有關(guān)，可能在先天性心臟病和各種病理因素導(dǎo)致的心肌細胞凋亡中也起著重要的作用。此外，我們的研究還為進一步探索心肌病發(fā)生的下游信號通路(如MAPK/NKL 信號通路、TGF-β/Smad信號通路、Ca/Myosin信號通路)指出了潛在的方向。這對于我們進一步研究miRNA-208a在心血管疾病發(fā)生中的作用具有一定的指導(dǎo)意義。

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Prediction of target gene of homo sapiens-microRNA-208a and bioinformatics analysis of its biological processes and signaling pathways

LIShan-shan,ZHONGGuo-qiang,JIANGZhi-yuan,WENLi-na

(DepartmentofCardiovascularMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To predict the target genes of homo sapiens-microRNA-208a(hsa-miRNA-208a),and analyze their possible biological processes and signaling pathways using bioinformatics technology.Methods Basic data of hsa-miRNA-208a including chromosomal location,base sequence and conservation of species were obtained using miRbase database and UCSC Genome Browser tool.The target genes were predicted using miRanda,miRDB,TargetScan and miRwalk.An intersection of target genes was acquired using miRwalk,and then was combined with the target genes supported by literature and confirmed by experiments as a target gene set,which were analyzed with Gene Ontology(GO) analysis and signal pathway analysis for target gene set.Results The sequence of has-miRNA-208a was highly conserved among various species.Sixteen target genes(including CPEB2,CSNK2A2,DLD,MTF2,FBXO28,LEP,SMAD4,NLK,GPR88,VPS13D,ZNF215,CHD9,SLC7A5,C19orf44,SLC45A3 and MAP4K4) were obtained from the intersection of target genes predicted by TargetScan,miRDB,miRanda and miRwalk.Twelve(CASP3,MRGPRX3,FPRL1,MED13,IL10,GATA4,HSH2D,MYH6,MYH7,TNNI3,CDKN1A and PAK3) and three(SOX6,MTM1 and TAB3) confirmed target genes were retrieved from miRwalk and DIANA Lab TarBase,respectively.GO analysis showed that the target genes were enriched in biological process including ventricular cardiac muscle tissue development,cardiac ventricle morphogenesis,cardiac chamber development,cardiac muscle tissue development,heart development,cell development,ect(P<0.05).The signal pathway analysis showed that the target genes were enriched in the pathways including adherent junction,tight junction,cardiac muscle contraction,Wnt signaling pathway,viral myocarditis,hypertrophic cardiomyopathy,dilated cardiomyopathy,ect(P<0.05).Conclusion Has-miRNA-208a participates in the biological process of cardiac growth and development,and is closely related to the occurrence of myocardial disease. 【Key words】 MicroRNA-208a,Homo sapiens,Bioinformatics,Target gene,Heart,Growth,Myocardial disease

黎珊珊(1990～)，女，在讀碩士研究生，研究方向：心電生理學(xué)、心律失常及冠心病的基礎(chǔ)研究及介入治療。通信作者：鐘國強(1958～)，男，博士，教授，研究方向：心電生理學(xué)、心律失常及冠心病的基礎(chǔ)研究及介入治療，E-mail：gq_zhong@126.com。

R 342.7

A

0253-4304(2016)12-1634-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.12.02

2016-05-28

2016-08-08)