◆紀(jì)朋艷

PCR反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)及優(yōu)化

◆紀(jì)朋艷

PCR是分子生物學(xué)中常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，在揭示生命現(xiàn)象規(guī)律方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。目前在進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)操作時，因?yàn)镻CR反應(yīng)體系設(shè)計(jì)不合理而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的事例較多。因此，從優(yōu)化PCR反應(yīng)體系的角度出發(fā)，對提高PCR反應(yīng)效率進(jìn)行探討。

PCR；反應(yīng)體系；實(shí)驗(yàn)

1 標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系

標(biāo)準(zhǔn)的PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）反應(yīng)體系由緩沖液、脫氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、引物、DNA模板等構(gòu)成[1]，每個部分在PCR反應(yīng)中都有重要的作用，并且在合適的濃度范圍內(nèi)才能促進(jìn)PCR反應(yīng)的正常進(jìn)行。

2 PCR反應(yīng)體系設(shè)計(jì)

模板核酸DNA模板是PCR反應(yīng)復(fù)制的原始基礎(chǔ)，模板質(zhì)量的優(yōu)劣，直接決定了整個PCR反應(yīng)的成敗。目前DNA提取方法主要有酚氯仿、高鹽法及各試劑公司的試劑盒。酚氯仿作為傳統(tǒng)經(jīng)典的方法，一直受到科研工作者的青睞，其DNA提取質(zhì)量與純度較高，但是缺點(diǎn)是程序繁瑣、提取效率低。目前在一些樣品比較大的實(shí)驗(yàn)中，主要采用高鹽法提取DNA。試劑盒提取DNA效率與質(zhì)量都較好，但是費(fèi)用較高。在PCR反應(yīng)體系中，一般加入模板的質(zhì)量為50～100 ng，加入模板的量過多，或產(chǎn)生較多的雜質(zhì)，出現(xiàn)很多非特異性產(chǎn)物；如果加入的模板較少，產(chǎn)生的特異性產(chǎn)物較少，在檢測過程中不易檢測。

DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反應(yīng)中將游離的散亂的堿基按照模板中堿基的順序，連接于DNA雙鏈中的粘合劑。目前DNA聚合酶主要有兩種類型：一種是從水生桿菌中提取的天然聚合酶；另一種是利用大腸桿菌人工合成的基因工程酶。由于當(dāng)前分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，人工合成的基因工程酶越來越多地得到應(yīng)用，在20 μl PCR反應(yīng)體系中，所需要的DNA聚合酶一般為2.5個單位。加入的NDA聚合酶過多，會引起很多非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)生沒有用途的非特異性產(chǎn)物；相反，如果加入的DNA酶過少，則會減少特異性產(chǎn)物的產(chǎn)量。

脫氧核苷三磷酸（dNTP）dNTP是合成DNA的原料，主要是4種堿基。dNTP是以干粉狀態(tài)保存的，在進(jìn)行分子實(shí)驗(yàn)時，需要利用緩沖液溶液和調(diào)節(jié)pH值，并且小量分裝，保存在-20 ℃冰箱中。盡量減少反復(fù)凍融的次數(shù)，在PCR反應(yīng)中dNTP的濃度一般在50～200 μmol/L范圍內(nèi)。注意4種dNTP的濃度要相等，如果任何一種dNTP的濃度過低，產(chǎn)生錯配的幾率將會大大增大；如果dNTP的整體濃度過低，則會降低PCR反應(yīng)中特異性產(chǎn)物的量；如果dNTP量過高，則會與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+的濃度。

引物引物中堿基與模板DNA互補(bǔ)的程度，決定了PCR產(chǎn)物的特異性，這也是PCR特異性擴(kuò)增反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在設(shè)計(jì)引物序列時，一般遵循以下幾個原則：

1）引物的長度一般在15～30 bp之間，20 bp為最優(yōu)，過短或者過長都不利于PCR的特異性反應(yīng)；

2）引物的擴(kuò)增跨度在200～500 bp為好，在特定情況下也可以將擴(kuò)增片段增至10 kbp；

3）引物的4種堿基中，3′端含有G或者C可以提高引物的特異性，G、C的含量在40%～60%為好，太少或者太多都不利于擴(kuò)增；

4）引物之間要避免堿基的互補(bǔ)，否則會出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)阻止引物與模板的復(fù)性結(jié)合；特別要注意的是，引物之間不能有連續(xù)4個以上的堿基互補(bǔ)，否則產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增條帶會增多；

5）引物的最末及倒數(shù)第二個堿基要嚴(yán)格配對，避免引物末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR的失?。?/p>

6）引物的序列與數(shù)據(jù)庫中其他序列應(yīng)無明顯同源性，在引物中可以加上合適的酶切位點(diǎn)，有利于酶切分析和分子克隆。

Mg2+濃度Mg2+對PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量和特異性有顯著的影響。在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200 μmol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0 mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增；濃度過低，會降低DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

3 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

反應(yīng)體積的優(yōu)化PCR反應(yīng)體積一般采用的范圍為20～100 μl，常采用的為20 μl、30 μl、50 μl、100 μl。具體在實(shí)驗(yàn)中采用哪種反應(yīng)體系，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的和實(shí)驗(yàn)條件來決定。參考已公開的PCR反應(yīng)體積，進(jìn)行不同體積的PCR反應(yīng)，各組分的質(zhì)量和濃度不能單純地?cái)U(kuò)大或者減小，一定要根據(jù)實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增效果進(jìn)行摸索，減少或者增加個別組分的質(zhì)量濃度，最終得到合適的PCR反應(yīng)體系[2]。

引物擴(kuò)增效率的優(yōu)化引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度存在問題，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對此提出以下對策：

1）選定一個好的引物合成單位；

2）引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致（如果一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決；如果一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度）；

3）引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融，或因長期放冰箱冷藏而導(dǎo)致引物變質(zhì)，降解失效；

4）避免引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化PCR的反應(yīng)條件主要是溫度、時間及循環(huán)次數(shù)。溫度主要是按照PCR的三個步驟“變性—退火—延伸”設(shè)置的。一般的PCR反應(yīng)，DNA變性溫度為90～95 ℃，退火溫度為40～60 ℃，延伸溫度為70～75 ℃；但是在實(shí)際PCR反應(yīng)中，溫度與時間的設(shè)置是統(tǒng)一在一起進(jìn)行的。一般來講，在93～94 ℃時，1 min便可以使DNA變性；若低于93 ℃，設(shè)置的時間需要長一些；但是過高的溫度會影響DNA聚合酶的活性。因此，退火溫度與時間的設(shè)置一般在93～94 ℃時1 min。

退火溫度、時間的設(shè)置決定于引物的長度、堿基、濃度及其目的片段的長度。可參考以下公式選擇合適的溫度[3]：

Tm值（解鏈溫度）=4(G+C)+2(A+T)

復(fù)性溫度=Tm值-(5～10 ℃)

一般來講，在解鏈溫度允許的范圍內(nèi)，較高的復(fù)性溫度可以提高PCR反應(yīng)的特異性，復(fù)性時間一般在30～60 s，足可以保證引物的模板的充分結(jié)合。

PCR的延伸溫度一般設(shè)置在70～75 ℃，常用為72 ℃，過高或者過低的溫度都不利于引物與模板的結(jié)合。PCR的延伸時間是由擴(kuò)增片段的大小決定的，1 kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間在1 min左右；3～4 kb的擴(kuò)增片段，延伸時間在3～4 min；10 kb則需要延伸10 min以上。

循環(huán)次數(shù)決定了整個PCR的擴(kuò)增程度，一般設(shè)計(jì)在30～40次之間為好。設(shè)計(jì)次數(shù)過少，目的片段產(chǎn)物過低，不容易檢測；擴(kuò)增次數(shù)過多，產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物也增多，對目的片段的檢測產(chǎn)生干擾。

PCR反應(yīng)各組分濃度的優(yōu)化PCR中Mg2+、引物及dNTP三種組分的濃度對擴(kuò)增反應(yīng)的影響較大。在對PCR反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化的情況下，可根據(jù)數(shù)據(jù)庫上的相關(guān)文獻(xiàn)，參考已經(jīng)發(fā)表的其他反應(yīng)體系組分，對Mg2+、引物及dNTP的組分設(shè)置一系列的濃度，必要時可根據(jù)設(shè)置濃度的多少，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[4]，利用同一個DNA樣品進(jìn)行相同程序下的擴(kuò)增，根據(jù)目的片段的量的多少，確定哪種組分組合是最優(yōu)的PCR反應(yīng)組合。

PCR產(chǎn)物的檢測對PCR產(chǎn)物的檢測效果可以對整個PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，如在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中檢測出涂抹帶或地毯樣帶，其主要原因?yàn)榧尤氲拿傅馁|(zhì)量過多、dNTP濃度過高、Mg2+濃度過高、退火溫度過低、循環(huán)次數(shù)過多等。根據(jù)這個原因，對PCR反應(yīng)的各個組分的濃度進(jìn)行調(diào)整，可以提高PCR的反應(yīng)效率。

[1]田艷伶,李志輝,楊振華,等.鉤粟ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2015(4):11-15.

[2]王小燕,葉祖云,等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化太子參ISSR-PCR反應(yīng)體系[J].邵陽學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2015(6):23-25.

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[4]蘇輝,李志剛,宋書宏.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化大豆SSR-PCR反應(yīng)體系及引物篩選[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2009(4):23-27.

Design and Optimization of PCR Reaction System

JI Pengyan

Polymerase Chain Reaction (PCR) technology is commonly used in molecular biology experiments,which played a vital role in terms of reveals life phenomenon law. Now in the PCR laboratory procedures,more and more PCR experiment were failure examples because the not reasonable design PCR reaction system. Therefore,this article discussed the perspective of the PCR reaction system to improve the eff ciency of the PCR reaction.

Polymerase Chain Reaction;reaction system;experiment

G642.423

B

1671-489X(2016)02-0160-02

作者：紀(jì)朋艷，吉林醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心（132013）。

10.3969 /j.issn.1671-489X.2016.02.160