佛生福,馬　祺,王　丹,令世鑫,王家敏,馬忠仁,喬自林

(1.西北民族大學(xué) 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730010)

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我國(guó)BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫疫苗的進(jìn)展

佛生福1,馬祺2,王丹2,令世鑫1,王家敏1,馬忠仁1,喬自林1

(1.西北民族大學(xué) 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730010)

口蹄疫疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)比轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)在產(chǎn)量和質(zhì)量上均有優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)也已全面應(yīng)用于我國(guó)口蹄疫疫苗生產(chǎn)中.懸浮培養(yǎng)技術(shù)中懸浮細(xì)胞株的馴化，個(gè)性化培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)和生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)工藝是疫苗生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵因素，也是未來(lái)研究的主要方向.

BHK-21細(xì)胞；懸浮培養(yǎng)；口蹄疫疫苗

0　前言

BHK-21細(xì)胞即敘利亞倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(Baby Hamster Kidney cell，BHK-21或BHK21)于1961年由Macpherson IA、Stoker MGP建系，源自5只未辨性別的1日齡倉(cāng)鼠腎，該細(xì)胞廣泛用于增殖病毒生產(chǎn)疫苗.原始的BHK-21細(xì)胞株為貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞，馴化成懸浮培養(yǎng)型細(xì)胞系可進(jìn)行病毒大規(guī)模增殖，在提高疫苗產(chǎn)量的同時(shí)由于生物反應(yīng)器無(wú)血清培養(yǎng)工藝的應(yīng)用提高了疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量.1965年Capstick等[1]在不銹鋼發(fā)酵罐中用馴化的懸浮培養(yǎng)型BHK-21 細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)了口蹄疫疫苗，開(kāi)啟了BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)應(yīng)用的新篇章，此后該細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用.本世紀(jì)初，我國(guó)科研人員對(duì)BHK-21細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了深入研究，經(jīng)過(guò)十幾年的探索和改進(jìn)，其研究成果在口蹄疫疫苗生產(chǎn)中已廣泛應(yīng)用，為我國(guó)控制該疾病的發(fā)生和傳播起到至關(guān)重要的作用.

1　懸浮培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

傳統(tǒng)的口蹄疫疫苗生產(chǎn)工藝是用含血清(通常是牛血清)的細(xì)胞培養(yǎng)液將貼壁培養(yǎng)型細(xì)胞經(jīng)多次傳代擴(kuò)大培養(yǎng)到一定數(shù)量后接種相應(yīng)的病毒再培養(yǎng)后制成，生產(chǎn)規(guī)模受細(xì)胞生長(zhǎng)貼附面積的限制而放大困難，工藝的生產(chǎn)周期長(zhǎng)、勞動(dòng)強(qiáng)度大、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定批間差大，而且在培養(yǎng)中使用了血清，存在污染外源病毒和致病因子的風(fēng)險(xiǎn)，殘留的牛血清也會(huì)引起接種動(dòng)物的副反應(yīng).新型口蹄疫疫苗生產(chǎn)工藝使用生物反應(yīng)器將細(xì)胞完全懸浮于培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模與培養(yǎng)容器的體積相關(guān)，容易實(shí)現(xiàn)線性放大，而且在生產(chǎn)過(guò)程中無(wú)血清培養(yǎng)基的使用消除了因使用牛血清而帶來(lái)的安全風(fēng)險(xiǎn).2009年金宇保靈[2]在國(guó)內(nèi)率先使用BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)口蹄疫疫苗，之后天康生物、中農(nóng)威特和中牧股份等具有口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)資質(zhì)的企業(yè)也相繼進(jìn)行了懸浮培養(yǎng)的工藝改造，國(guó)內(nèi)口蹄疫滅活疫苗在短短幾年內(nèi)全部實(shí)現(xiàn)了生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)工藝.在懸浮培養(yǎng)工藝中細(xì)胞馴化、個(gè)性化培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)和生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝是關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié).

2　細(xì)胞馴化

原始的BHK-21細(xì)胞為貼壁型培養(yǎng)株，培養(yǎng)過(guò)程中需添加動(dòng)物血清才能正常生長(zhǎng)，經(jīng)馴化可實(shí)現(xiàn)全懸浮和無(wú)血清培養(yǎng)，我國(guó)口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)所用的懸浮型細(xì)胞株各不相同.薛英等[3]用胰酶消化貼壁型BHK-21細(xì)胞后在MEM中添加8%和20%新生牛血清直接在生物反應(yīng)器中100r/m培養(yǎng)馴化，24 h細(xì)胞倍增可達(dá)到2～3倍.李榮等[4]用馴化的低血清懸浮細(xì)胞在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)至2×106/mL后接種口蹄疫病毒再培養(yǎng)20～30 h時(shí)細(xì)胞密度可達(dá)4×106/mL.井蓮娜等[5]通過(guò)低血清貼壁、低血清懸浮和無(wú)血清懸浮三個(gè)階段馴化了適應(yīng)無(wú)血清全懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞，馴化的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基密度可達(dá)4.5×106/mL以上，細(xì)胞活力在90%以上，倍增時(shí)間為18 h.馮玉萍等[6]依次使用MEM、DMEM/F12和無(wú)血清培養(yǎng)基適應(yīng)培養(yǎng)，血清濃度也從10%逐步降至無(wú)血清的方法馴化了BHK-21全懸浮培養(yǎng)型細(xì)胞，在低血清和無(wú)血清培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞密度可達(dá)5×106/mL以上，該細(xì)胞株在多家口蹄疫疫苗企業(yè)生產(chǎn)中使用.

3　個(gè)性化培養(yǎng)基

細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞體外培養(yǎng)的重要因素.在大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)中，細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞高密度生長(zhǎng)、增殖和維持至關(guān)重要，尤其是細(xì)胞經(jīng)過(guò)無(wú)血清懸浮馴化后對(duì)培養(yǎng)基的要求更高，一株懸浮細(xì)胞往往需要開(kāi)發(fā)個(gè)性化無(wú)血清培養(yǎng)基才能正常生長(zhǎng).不同細(xì)胞株的營(yíng)養(yǎng)代謝特征不同，培養(yǎng)工藝也不同，抗剪切力和培養(yǎng)規(guī)模的放大、病毒表達(dá)量的提高，這些均需要個(gè)性化培養(yǎng)基的支持.2008年北京清大天一研發(fā)了BHK-21細(xì)胞低血清培養(yǎng)基應(yīng)用到金宇保靈的生產(chǎn)中，細(xì)胞密度可達(dá)4×106/mL，2009年該公司推出了無(wú)血清和無(wú)動(dòng)物成分來(lái)源BHK-21細(xì)胞個(gè)性化培養(yǎng)基[7].2010年安芳蘭等[8]在GMEM的基礎(chǔ)上研究確定了本單位的BHK-21懸浮型細(xì)胞對(duì)葡萄糖、谷胺酰胺和丙酮酸鈉的最佳添加量為3 mM、3 mM和1.5 mM.同年，令世鑫等[9]在DMEM/F12的基礎(chǔ)上添加了氨基酸、維生素、微量元素和細(xì)胞生長(zhǎng)因子及表面活性劑開(kāi)發(fā)了BHK-21細(xì)胞的個(gè)性化無(wú)血清培養(yǎng)基，使BHK-21懸浮細(xì)胞在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)密度達(dá)5×106/mL以上.

4　培養(yǎng)工藝

隨著疫苗生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大和技術(shù)水平的提高，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)模式已不能滿足生產(chǎn)的需求，生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用適應(yīng)了工業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的客觀需求.2009年金宇保靈采用1 200 L生物反應(yīng)器生產(chǎn)口蹄疫滅活是當(dāng)時(shí)國(guó)內(nèi)BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體積最大的生物反應(yīng)器[7].2010年新疆天康也建立了1200L生物反應(yīng)器生產(chǎn)線，此后中農(nóng)威特、中牧股份、上海海麗和上海申聯(lián)等口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)相繼建設(shè)培養(yǎng)體積更大的生物反應(yīng)器生產(chǎn)線，設(shè)計(jì)的細(xì)胞培養(yǎng)罐培養(yǎng)體積超過(guò)了5 000 L.2010年劉學(xué)榮[10]等研究了乳酸對(duì)BHK-21細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)的影響.結(jié)果表明，在乳酸濃度小于9.4 mM時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，9.4～23.5 mM對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有弱抑制作用，大于42.3 mM對(duì)細(xì)胞有強(qiáng)抑制作用.2011年武發(fā)菊等[11]研究了氨對(duì)BHK-21懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響，結(jié)果表明，在乳酸濃度小于1.8 mmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有抑制，2.5～8 mmol/L時(shí)有弱抑制，15 mmol/L時(shí)細(xì)胞開(kāi)始死亡.2011年喬自林等[12]通過(guò)流加培養(yǎng)方式確定了BHK-21懸浮型細(xì)胞從一支細(xì)胞凍存管中復(fù)蘇開(kāi)始到5 L→120 L→650 L反應(yīng)器的放大工藝，使細(xì)胞在反應(yīng)器的密度在5.0×106/mL，活力在94%以上.2013年付智財(cái)?shù)萚13]研究了懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律和不同接種密度培養(yǎng)效果的研究，確定懸浮細(xì)胞4×105～6×105/mL接種培養(yǎng)能達(dá)到較高培養(yǎng)密度，細(xì)胞生長(zhǎng)快，且細(xì)胞峰值持續(xù)時(shí)間長(zhǎng).同年武發(fā)菊等[14]研究了BHK-21懸浮細(xì)胞起始密度在3×105～9×105/mL時(shí)從48 h開(kāi)始流加富含氨基酸、維生素、微量元素和次黃嘌呤及無(wú)血清培養(yǎng)基添加成分的濃縮液，細(xì)胞密度都可達(dá)到7.4×106/mL.

5　結(jié)語(yǔ)

我國(guó)BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于口蹄疫疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)中，馴化高產(chǎn)懸浮細(xì)胞株，設(shè)計(jì)能更好地支持懸浮培養(yǎng)的個(gè)性化培養(yǎng)基以及優(yōu)化生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)工藝是未來(lái)研究的主要方向.

[1] Capstick P B,Garland A J,Chapman W G．Production of foot-and-mouth disease virus antigen from BHK21 clone 13 cells grown and infected in deep suspension cultures [J].Nature,1965,205(976):1135-1136.

[2] 農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部公告第1184號(hào)新獸藥注冊(cè)目錄(EB/OL),2009.4.2.

[3] 薛英,王延,王玉紅等.BHK-21細(xì)胞的懸浮馴化及其在懸培條件下對(duì)口蹄疫A型病毒的培養(yǎng)[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,2008,01:35-37.

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[5] 井蓮娜,付智財(cái),黃炯.無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞馴化的研究[J].草食家畜,2013,03:51-56.

[6] 馮玉萍,喬自林,令世鑫等.一種在低血清和無(wú)血清培養(yǎng)基中高密度懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞及其制備方法[P].中國(guó)：ZL201110050597,2014年10月8日.

[7] 張韌,王建超,陳文慶等.反應(yīng)器細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)技術(shù)在動(dòng)物疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國(guó)獸藥雜志,2012,11:39-43.

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[10] 劉學(xué)榮,武發(fā)菊,安芳蘭等.不同濃度的乳酸對(duì)BHK-21細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響[J]. 第三屆獸醫(yī)大會(huì)—獸醫(yī)生物制品學(xué)、獸醫(yī)微生物學(xué)學(xué)術(shù)論壇論文集(2010年)：319-324.

[11] 武發(fā)菊,尚勇良,安芳蘭等.氨對(duì)懸浮培養(yǎng)幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞_BHK_21_生長(zhǎng)代謝的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2011,39(2):28-32.

[12] 喬自林,令世鑫,李明生等.BHK-21細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)在蹄疫疫生產(chǎn)中的應(yīng)用[P].中國(guó):ZL20111066205.6,2013年6月12日.

[13] 付智財(cái),王家敏，令世鑫等.懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律和不同接種密度培養(yǎng)效果的研究[J].西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,34(3):43-46.

[14] 武發(fā)菊,劉萍,安芳蘭等.BHK-21懸浮細(xì)胞流加培養(yǎng)的研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2014,06:150-153.

2016-05-10

甘肅省科技支撐項(xiàng)目(144FKCA082),甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)專項(xiàng)基金(GNSW-2014-24).

佛生福(1992—),男(藏族),青海大通人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)方面的研究.

S85

A

1009-2102(2016)02-0070-03