維妮拉·烏斯曼， 麥合蘇木·艾克木， 玉蘇甫江·臺外庫力， 麥提喀斯木·尼扎木丁，

阿不都熱依木·玉蘇甫1

(新疆醫(yī)科大學(xué)1維吾爾醫(yī)學(xué)院,2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊　830011)

異常黑膽質(zhì)成熟劑對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬G蛋白α亞型Gαi、Gαo和Gαq表達的影響

維妮拉·烏斯曼1， 麥合蘇木·艾克木1， 玉蘇甫江·臺外庫力1， 麥提喀斯木·尼扎木丁2，

阿不都熱依木·玉蘇甫1

(新疆醫(yī)科大學(xué)1維吾爾醫(yī)學(xué)院,2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊830011)

摘要:目的探討異常黑膽質(zhì)成熟劑(ASMq)對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬G蛋白α亞型Gαi、Gαo和Gαq表達的影響。方法選取60只雄性SD大鼠,進行21 d慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(CUMS)誘導(dǎo)建立抑郁癥大鼠模型(接受應(yīng)激組),并通過體質(zhì)量測量、糖水消耗實驗、礦場實驗進行宏觀評價。造模成功后，將接受應(yīng)激組大鼠隨機分為5組：ASMq高、中、低劑量組(給藥劑量分別為6.0、3.0、1.5 g/kg體質(zhì)量)及陽性對照組(氟西汀 3.5 g/kg體質(zhì)量)，模型對照組(生理鹽水 1.5 mL/100 g體質(zhì)量)，每組12只。另設(shè)正常對照組(12只,不接受任何應(yīng)激，正常飼養(yǎng))。末次給藥1 h后頸椎脫臼處死大鼠，迅速分離海馬并凍存?zhèn)溆?。采用免疫印跡法(western blotting)檢測各組大鼠海馬Gαi、Gαo和Gαq表達量。結(jié)果與正常對照組相比，接受應(yīng)激組大鼠給予應(yīng)激后的體質(zhì)量、糖水?dāng)z入量、跨越格數(shù)及抬腿次數(shù)明顯降低，處于抑郁狀態(tài)；ASMq高、中、低劑量組及陽性對照組大鼠給藥后的體質(zhì)量明顯高于抑郁模型對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與正常對照組相比，抑郁模型對照組大鼠海馬Gαo、Gαi表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而Gαq表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與抑郁模型對照組相比，ASMq高、中、低劑量組及陽性對照組Gαo和Gαi表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論ASMq可能通過調(diào)節(jié)G蛋白α亞型Gαo、Gαi表達來發(fā)揮抗抑郁作用。

關(guān)鍵詞:異常黑膽質(zhì)成熟劑(ASMq)； 抑郁模型； G蛋白α亞型Gαi、Gαo、Gαq

抑郁癥是一種長期困擾人類健康的精神、心理疾患，是人們最早認(rèn)識的精神科疾病，被稱為精神疾病的“ 普遍感冒”。至今其病因尚未完全闡明，劉艷梅等[1]報道，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與抑郁癥發(fā)生密切相關(guān)，其從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平闡明抗抑郁藥的作用機制，即抗抑郁藥在分子水平上通過三磷酸鳥苷酸(GTP)結(jié)合蛋白(G蛋白)將神經(jīng)遞質(zhì)受體信號跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，并產(chǎn)生功能蛋白磷酸化、神經(jīng)營養(yǎng)因子增加、神經(jīng)發(fā)生增多等相關(guān)效應(yīng)，從而發(fā)揮抗抑郁作用。異常黑膽質(zhì)證方藥——異常黑膽質(zhì)成熟劑(ASMq)是預(yù)防和治療異常黑膽質(zhì)病癥的首選藥物[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ASMq可能通過上調(diào)海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Bdnf)、5-羥色胺1A mRNA(5-HTIAmRNA)表達[3]、調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶-cAMP-蛋白激酶A信號通路(cAMP-PKA 信號通路)[4]、上調(diào)細(xì)胞外信號調(diào)控激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(Ras/RSK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路) 起到抗抑郁作用[5]。但至今尚未見ASMq對G蛋白的影響的報道，因此本研究擬采用慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(CUMS)誘導(dǎo)建立抑郁癥大鼠動物模型，通過免疫印跡法(western blotting)觀察ASMq對大鼠海馬G蛋白α亞型Gαi、Gαo和Gαq表達的影響，旨在探討ASMq可能的抗抑郁作用。

1材料與方法

1.1實驗動物選取2月齡雄性清潔級SD大鼠72只，體質(zhì)量180~220 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號：SCXK新2003-2001)。

1.2藥物按照本項目組發(fā)明的中華人民共和國發(fā)明專利(專利號：ZL 02130082.8)制備ASMq(成分同異黑成熟顆粒)，由新疆奇康哈博維藥有限公司生產(chǎn)提供(批號：121011)。 鹽酸氟西汀膠囊(國藥準(zhǔn)字J20130010，蘇州制藥有限公司)，普通蔗糖。

1.3試劑與儀器RIPA裂解液， BCA蛋白定量試劑盒，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，western blot試劑盒，4×蛋白上樣緩沖液，蛋白MARKER，Gαi、Gαo、Gαq 一抗，二抗，BCIP/NBT 顯色試劑盒(invitrogen)；高速冷凍離心機，X-mark 型酶標(biāo)儀，STE-2 型脫色搖床，凝膠成像儀。

1.4動物模型的建立及評價

1.4.1造模選取72只清潔級SD大鼠(體質(zhì)量180~200 g)室溫下正常飼養(yǎng)，從中選取60只大鼠，采用CUMS誘導(dǎo)建立大鼠抑郁癥模型(接受應(yīng)激組)，具體造模方法如下：大鼠接受不同的應(yīng)激，包括電擊足底(電壓36 V，每隔1 min電擊1次，1次持續(xù)10 s，共20次)、冰水游泳(4℃冷水，水深15 cm，持續(xù)5 min)、熱水游泳(45 ℃熱水，水深15 cm，持續(xù)5 min)、夾尾(夾住距尾根部1 cm處，持續(xù)1 min)、搖晃(頻率160次/ min，持續(xù)3 min)、晝夜顛倒、禁食(24 h)、禁水(24 h)。21 d后，采用體質(zhì)量測量、糖水消耗實驗、礦場實驗綜合評價模型建立是否成功。將12只大鼠設(shè)為正常對照組，不接受任何應(yīng)激，正常飼養(yǎng)。

1.4.2大鼠體質(zhì)量測量分別測量記錄大鼠應(yīng)激前后的體質(zhì)量,然后計算比較各組大鼠體質(zhì)增加量。

1.4.3糖水實驗(sucrose intake test)實驗前48 h，訓(xùn)練大鼠適應(yīng) 1%蔗糖水 ，然后斷水12 h， 測1 h內(nèi)糖水?dāng)z入量 ，在實驗第21天，再測1次。

1.4.4礦場實驗(open field test)準(zhǔn)備開口的黑色木盒(內(nèi)部場地大小為100 cm×80 cm),盒底漆成縱橫各3條白線(寬3 mm),從而形成16個等大的方格。將大鼠面朝墻放入4個拐角方格之一，并讓其自由探索環(huán)境3 min。分別記錄跨越格數(shù)(水平得分, crossing)和后肢站立次數(shù)(垂直得分,rearing)。每只大鼠接受1次測試。

1.5分組及給藥將接受應(yīng)激組大鼠分為5組(每組12只)：ASMq高、中、低劑量組、陽性對照組及模型對照組，另設(shè)正常對照組(12只，不接受任何應(yīng)激，正常飼養(yǎng))。從造模成功第1天開始，陽性對照組經(jīng)口灌胃氟西汀3.5 mg/kg體質(zhì)量；ASMq大劑量組經(jīng)口灌ASMq(6.0 g/kg體質(zhì)量) 給藥劑量為2 mL/100 g體質(zhì)量；ASMq中劑量組經(jīng)口灌胃ASMq (3.0 g/kg體質(zhì)量) 給藥劑量為2 mL/100 g體質(zhì)量；ASMq小劑量組經(jīng)口灌胃ASMq(1.5 g/kg體質(zhì)量) 給藥劑量為2 mL/100 g體質(zhì)量；模型對照組經(jīng)口灌胃生理鹽水1.5 mL/100 g體質(zhì)量，各組連續(xù)給藥21 d，灌胃1次/d。

1.6標(biāo)本采集末次給藥結(jié)束1 h后，將各組大鼠頸椎脫臼處死，迅速剝離大腦，進行海馬的分離，將分離出來的海馬放在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7Western blotting測定Gαi、Gαo、Gαq的表達樣品處理：取海馬組織用加有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進行勻漿，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液用BCA法測定蛋白濃度。Western blotting測定：給待測樣品加4×蛋白上樣緩沖液配成配成蛋白含量為20 μg/μL的溶液，進行SDS-PAGE凝膠(電泳濃度為10%~12%) 60 mA電泳30 min，120 V轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，4℃一抗孵育(分別孵育Gαi、Gαo、Gαq)過夜，稀釋比例為1∶1 000。次日取出加二抗孵育1 h，顯色，用 Bio- Rad 凝膠成像儀拍照，結(jié)果用Image J2x醫(yī)學(xué)影像處理應(yīng)用程序進行條帶分析，測定目的條帶的積分光密度值，作為代表樣本蛋白含量的統(tǒng)計變量。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，行為學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果用重復(fù)測量的方差分析和t檢驗，Gαi、Gαo及Gαq含量用單因素方差分析(ANOVA)檢驗，各組間比較用最小顯著差法 (LSD)，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1CUMS對大鼠體質(zhì)量、糖水?dāng)z入量及自主行為的影響實驗前各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。持續(xù)21 d的應(yīng)激刺激后，接受應(yīng)激組大鼠體質(zhì)量顯著下降(P<0.01),應(yīng)激前后的糖水?dāng)z入量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與正常對照組相比，接受應(yīng)激組大鼠的糖水?dāng)z入量明顯降低(P<0.01)，而正常對照組糖水?dāng)z入量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。接受應(yīng)激組大鼠的跨越格數(shù)及抬腿次數(shù)明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1　CUMS對大鼠體質(zhì)量、糖水?dāng)z入量及自主行為的影響()

注：與正常對照組比較，*P<0.01。

2.2ASMq對各組大鼠體質(zhì)量的影響與給藥前相比，給藥后各組大鼠體質(zhì)量明顯增加(P<0.01)，而模型對照組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>O.05)。給藥后，正常對照組及各給藥組大鼠體質(zhì)量明顯高于模型對照組(P<0.01)，而陽性對照組與ASMq高、中、低劑量組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2　各組大鼠體質(zhì)量變化比較(g,)

注：與給藥前比較,*P<0.01； 與模型對照組比較,ΔP<0.01。

2.3各組大鼠海馬G蛋白3種亞型表達水平與正常對照組相比, 模型對照組大鼠海馬組織中的Gαo和Gαi表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而Gαq表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型對照組相比，ASMq高、中、低劑量組及陽性對照組Gαo和Gαi表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而Gαq表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與陽性對照組比較，ASMq高、中、低劑量組Gαo、Gαi及Gαq表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3和圖1。

3討論

抑郁癥是一種常見的也是自殺率最高的精神疾病。隨著社會的發(fā)展，人們在享受越來越豐富的物質(zhì)文明的同時，也感受到越來越大的心理、精神等方面的壓力，導(dǎo)致了抑郁癥的發(fā)病率顯著增加，對人類與社會造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)及損失。目前認(rèn)為，抑郁的發(fā)生和受體多與G蛋白相偶聯(lián)密切相關(guān)[6]，G蛋白作為膜外信息向膜內(nèi)傳遞的中介，也是抗抑郁藥物的重要作用靶點。G蛋白將激素、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)等所攜帶的細(xì)胞外信息傳遞給細(xì)胞內(nèi)，在抑郁癥的發(fā)病和治療中起著重要的作用。Gao蛋白亞型作為一個在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達量非常高的G蛋白，參與多種神經(jīng)遞質(zhì)和激素類的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。Gαi在生物體內(nèi)無處不在, 主要抑制AC的活性，影響第二信使cAMP的產(chǎn)生。Gαq可激活細(xì)胞膜上的磷脂酶C(PLC),使 4, 5-二磷酸磷脂酰肌醇水解為 1, 4, 5-三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DAG)[8]。

表3　各組大鼠海馬G蛋白3種亞型表達水平 ()

注： LSD檢驗,與模型對照組比較,*P<0.01 ，**P<0.05。

A: 大鼠海馬Gαo表達　　B: 大鼠海馬 Gαi 表達　　C: 大鼠海馬Gαq表達

1: ASMq高劑量組; 2: ASMq中劑量組; 3: ASMq低劑量組; 4:陽性對照組; 5:模型對照組; 6:正常對照組

圖1各組大鼠大鼠海馬 G蛋白表達

傳統(tǒng)維吾爾醫(yī)學(xué)認(rèn)為，抑郁癥屬于“麻利胡利亞”范疇，是由于長期大量服用干寒型的飲食和藥物、情志失常及長期過度從事腦力和體力勞動而使體內(nèi)正常體液(黑膽質(zhì)、血液質(zhì)、黏液質(zhì)、膽液質(zhì))“燃燒”生成異常黑膽質(zhì)，導(dǎo)致異常黑膽質(zhì)體液的凝結(jié)沉淀，損壞腦部，從而發(fā)生異常黑膽質(zhì)型抑郁癥。異常黑膽質(zhì)成熟劑是異常黑膽質(zhì)證方藥，由破布木實、鐵線蕨、地錦草、香青蘭、甘草根、薰衣草等單味藥組成的維吾爾藥復(fù)方制劑，可使體內(nèi)異常體液“成熟”，即對體內(nèi)異常體液進行調(diào)劑和堆積，達到氣質(zhì)復(fù)原、體液平衡的健康狀態(tài)。

慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(CUMS)模型基本符合抑郁模型的要求，具有高度有效性，是目前國內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于抑郁癥基礎(chǔ)研究和藥物篩選的一種有效的抑郁模型[9-10]，其通過長時間使動物接受溫和應(yīng)激刺激，模擬在日常生活中的種種壓力及困難，模擬出人類抑郁癥的重要特征、癥狀及表現(xiàn)，即缺乏快感。異常黑膽質(zhì)導(dǎo)致異常黑膽質(zhì)型抑郁癥的病理過程與CUMS模型不謀而合。本課題組前期有關(guān)異常黑膽質(zhì)成熟對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠的影響研究發(fā)現(xiàn)，異常黑膽質(zhì)成熟劑促進慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠體質(zhì)量增加[11]；通過降低促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇(CORT)含量糾正下丘腦—垂體—腎上腺軸 (HPA軸)亢進，升高去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、腎上腺素(AD)及β-內(nèi)啡肽(β-EP)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)含量，改善抑郁癥模型大鼠血液中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量而起到抗抑郁作用[12]。

本研究結(jié)果顯示，持續(xù)21 d的應(yīng)激刺激后，接受應(yīng)激組大鼠體質(zhì)量顯著下降(P<0.01),應(yīng)激前后的糖水?dāng)z入量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與正常對照組相比，接受應(yīng)激組大鼠的糖水?dāng)z入量、跨越格數(shù)及抬腿次數(shù)明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明造模成功。藥物干預(yù)后，與模型對照組相比，ASMq高、中、低劑量組及陽性對照組大鼠體質(zhì)量均明顯增加。模型對照組大鼠海馬的Gαo、Gαi蛋白含量顯著高于正常對照組，而Gαq差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示，慢性應(yīng)激處理對海馬的Gαo、Gαi蛋白亞型的表達有一定的影響。給藥干預(yù)后，ASMq高、中、低劑量組及陽性對照組的Gαo、Gαi蛋白含量較模型對照組明顯降低，而Gαq差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示，ASMq可能通過降低Gαo、Gαi蛋白α亞型表達量提高cAMP通路的信號傳遞，導(dǎo)致CREB、PKA及BDNF等發(fā)生變化而產(chǎn)生抗抑郁作用。

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(本文編輯周芳)

The effect of Abnormal Savda Munziq on expression of G protein α subunits:

Gαi, Gαo and Gαq in the hippocampus of depression Rat models

Weinila Wusiman1, Maihesumu Aikemu1, Yusufujiang Taiwaikuli1, Maitikasimu Nizhamuding2,

Abudureyimu Yusupu1

(1SchoolofTraditionalUyghurMedicine,2SchoolofPre-clinicalMedicine,

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of Abnormal Savda Munziq (ASMq) on expression of G protein α subunits: Gαi、Gαo and Gαq in the hippocampus of depression rat models. MethodsThe 60 SD rats were treated with chronic unpredictable mild stress (CUMS) for 21d to build up the depression models, vs 12 SD rats as normal control group. Their behavioral status of rats was evaluated by Open-field test and sugar consumption experiment. After modelizing, the rats were randomly divided into 5 groups with 12 in each group: depression model group, low, middle and high dose group of ASMq (1.5, 3.0 and 6.0 g·kg-1·d-1, respectively), and positive control group (Fluoxetine, 3.5 mg·kg-1·d-1) administered with corresponding substances for 21 days. After the last administration in 1 h, all rats were executed and the hippocampuses were separated to cryo preserved for standby. The protein expression of Gαi, Gαo and Gαq in the hippocampuses of rats were measured by Western Blotting Protocol. ResultsAfter CUMS, the body weight gain, sugar consumption, horizontal crossing numbers and erection times of depression group were significantly decreased than normal control group (P<0.01), so the depression model group was successfully achieved with obvious depressive states. After administration, the weight of the three dose groups of ASMq and positive control group was higher than depression model group (P<0.01); compared with the normal control group, the contents of Gαo and Gαi protein expression in hippocampus of depression model group was significantly increased (P<0.05); the contents of Gαo and Gαi protein expression in hippocampus of the 3 dose groups of and positive control group were significantly lowered than model group (P<0.01). ConclusionThe anti-depression effect of ASMq may be related to regulating the Gαo and Gαi pathways in hippocampus.

Keywords:Abnormal Savda Munziq (ASMq); depression animal model; G protein α subunits of Gαi, Gαo and Gαq

[收稿日期：2015-09-25]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.01.003

中圖分類號：R291.5

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)01-0012-05