董娟娟， 孫高峰， 謝惠芳

(1新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院， 烏魯木齊　830011；2新疆烏魯木齊市疾病預防控制中心， 烏魯木齊　830000)

亞砷酸鈉對人胚肺成纖維細胞氧化應激與細胞增殖的影響

董娟娟1， 孫高峰2， 謝惠芳1

(1新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院， 烏魯木齊830011；2新疆烏魯木齊市疾病預防控制中心， 烏魯木齊830000)

摘要：目的探討亞砷酸鈉(NaAsO2)對人胚肺成纖維細胞(HELF)氧化應激與細胞增殖的影響。方法分別將含0.0、10.0、20.0、30.0 μmol/L的NaAsO2染毒HELF細胞 24、48、72 h，觀察細胞形態(tài)學變化，檢測NaAsO2對HELF細胞增殖活力和超氧化物歧化酶(SOD)、還原性谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性及丙二醛(MDA)含量的影響。其中0.0 μmol/L的NaAsO2組為對照組，10.0、20.0、30.0 μmol/L的NaAsO2組為實驗組。結(jié)果與對照組相比，各濃度NaAsO2染毒24、48、72 h后細胞抑制率均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HELF細胞抑制率與NaAsO2濃度和作用時間均呈正相關(guān)(P<0.05)。SOD和GSH-PX活性均隨NaAsO2染毒劑量升高而降低，隨染毒時間延長而降低，各劑量組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且都存在劑量-時間交互作用(P<0.01)。與對照組相比，各劑量組MDA含量隨NaAsO2染毒劑量升高而升高，隨染毒時間延長而升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，存在劑量-時間交互作用(P<0.01)。結(jié)論NaAsO2可降低HELF細胞增殖活力，降低HELF細胞SOD和GSH-PX活性,抗氧化作用減弱,使氧化代謝產(chǎn)物MDA含量升高。

關(guān)鍵詞：亞砷酸鈉； 人胚肺成纖維細胞； 細胞活力； 氧化應激

長期砷暴露能導致肝、腎、肺等多器官損害，并可引發(fā)多種疾病[1]。氧化應激反應增強一直被認為是砷化物致機體損傷的機制之一。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性、還原性谷胱甘肽過氧化物酶(Reducing glutathione peroxidase,GSH-PX)活性、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量是反映機體氧化應激的常用指標。人胚肺成纖維細胞(Human embryonic lung fibroblast,HELF)易于培養(yǎng)[2]，是進行亞砷酸鈉(NaAsO2)對肺組織作用效應體外實驗研究的主要細胞系之一[3]。研究表明NaAsO2可引起細胞增殖降低而凋亡升高[4]，10.40 μmol/L的NaAsO2處理人體細胞24 h后即可產(chǎn)生細胞凋亡[5]。為進一步研究NaAsO2對HELF細胞氧化損傷的作用機制，本研究使用0.0、10.0、20.0、30.0 μmol/LNaAsO2對HELF細胞進行染毒，分析其對細胞形態(tài)、細胞增殖活力、抗氧化酶SOD、GSH-PX活性及氧化代謝產(chǎn)物MDA含量的影響，為探討砷致肺損傷的分子機制提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試劑與儀器亞砷酸鈉(NaAsO2,湖南衡陽鳳凰化學工業(yè)廠)，DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS中性磷酸緩沖液、青霉素鈉、硫酸鏈霉素(美國Hlyclone公司)，胰蛋白酶、EDTA(美國Amresco公司)，胎牛血清(以色列Biological Industries公司)，噻唑藍(美國Sigma公司)，超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒、BCA法蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

ZHJH-1214C型超凈工作臺(上海智誠分析儀器制造有限公司)，IX71-12FL/PH 型倒置熒光研究級三目顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，Benchmark Plus全波長自動酶標儀(上海新振儀器設備有限公司)，BP211D型電子分析天平(美國Sartorius公司)，800DH (3543IR)型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國熱電公司)，MLS-3750型高壓滅菌器(日本三洋公司)，SCIENTZ-950E型觸摸式超聲波細胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)，MILLI-QBIOCEI型超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2細胞培養(yǎng)及處理HELF細胞(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，接種于DMEM培養(yǎng)液(含體積分數(shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.05%胰蛋白酶消化傳代，待細胞進入對數(shù)生長期、細胞融合率達70%~80%時，分別用含 0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0、60.0 μmol/L的NaAsO2培養(yǎng)液處理HELF細胞24、48、72 h，測得24、48、72 h的IC50分別為51.8、48.0、40.0 μmol/L，結(jié)合后期試驗需求選擇低于40.0 μmol/L的NaAsO2濃度作為染毒劑量。故選取0.0 μmol/L的NaAsO2組為對照組，10.0、20.0、30.0 μmol/L的 NaAsO2組為實驗組，培養(yǎng)24、48、72 h，分別收集細胞或培養(yǎng)液進行檢測。

1.3細胞形態(tài)的觀察調(diào)整HELF細胞密度為1×105個/mL，接種于6孔板上，每孔1 mL，細胞貼壁48 h后加入含0.0(對照)、10.0、20.0、30.0 μmol/L NaAsO2的DMEM高糖培養(yǎng)基，分別作用24、48、72 h后使用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照(20×10倍)。

1.4細胞增殖活力的測定調(diào)整HELF細胞密度為1×105個/mL，接種于96孔板上，每孔100 μL，細胞貼壁48 h后加入含0.0(對照)、10.0、20.0、30.0 μmol/L NaAsO2的DMEM高糖培養(yǎng)基作用至染毒終點，每個樣本平行做5孔。每孔加入含0.5 mg/mL的MTT溶液10 μL；繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)作用10 min，用全自動酶標儀于490 nm波長處測定光密度(OD)值，并計算細胞抑制率[抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%]。

1.5細胞GSH-PX活性、SOD活性、MDA含量測定將HELF細胞以3×106個/mL的密度接種于25 mL的培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入濃度為0.0、10.0、20.0、30.0 μmol/L的NaAsO2，分別染毒24、48、72 h，每個樣本平行做3瓶。收集細胞和培養(yǎng)上清，BCA法測定總蛋白質(zhì)濃度，硫代巴妥酸法(TBA)測定MDA含量，二硫代二硝基苯甲酸比色法測定GSH-PX活性；取培養(yǎng)液上清，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，均按試劑盒說明書操作。

1.6統(tǒng)計學處理使用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，采用重復測量方差分析，進一步進行組間兩兩比較時，采用SNK法檢驗。濃度與抑制率關(guān)聯(lián)分析采用多重線性回歸分析，檢驗水準α=0.05。

2結(jié)果

2.1細胞形態(tài)學變化對照組HELF細胞生長狀態(tài)良好，呈長梭狀，扁平，兩角或多角形，胞質(zhì)近中央有一個較清晰的細胞核呈圓形，細胞形態(tài)基本一致，界限清晰， 細胞間連接緊密。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞排列逐漸密集并可見正常代謝老化死亡的細胞(圖1A、圖2A、圖3A)；隨著染毒劑量加大和染毒時間延長，細胞生長密集度逐漸降低，老化凋亡的細胞逐漸增多(圖1B~D、圖2B~D、圖3B~D)。其中染毒48 h后，30.0 μmol/L NaAsO2染毒組大部分細胞體積變小，收縮變形，細胞間正常的緊密連接消失，細胞排列稀疏凌亂(圖2D)。染毒72 h后，30.0 μmol/L NaAsO2染毒組細胞較48 h、30.0 μmol/L NaAsO2染毒組細胞進一步收縮變形、變小，間隙大，部分細胞膜破裂，可見大量細胞死亡(圖3D)。

2.2不同濃度NaAsO2染毒HELF細胞不同時間對細胞抑制率的影響與對照組相比，實驗組作用24、48、72 h后，細胞抑制率隨染毒時間延長而升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HELF抑制率與NaAsO2濃度呈正相關(guān)(r=0.934，P<0.05)。HELF抑制率與NaAsO2作用時間和濃度的交互作用也呈正相關(guān)(r=0.963，P<0.05),見表1。

A：對照組

B： 10.0 μmol/L NaAsO2染毒組

C： 20.0 μmol/L NaAsO2染毒組

D： 30.0 μmol/L NaAsO2染毒組

圖1亞砷酸鈉染毒24 h后HELF細胞的形態(tài)(×200)

A：對照組

B： 10.0 μmol/L NaAsO

C： 20.0 μmol/L NaAsO2染毒組

D： 30.0 μmol/L NaAsO2染毒組

圖2亞砷酸鈉染毒48 h后HELF細胞的形態(tài)(×200)

A：對照組

B： 10.0 μmol/L NaAsO2染毒組

C： 20.0 μmol/L NaAsO2染毒組

D： 30.0 μmol/L NaAsO2染毒組

圖3　亞砷酸鈉染毒72 h后HELF細胞的形態(tài)(×200)

注：組內(nèi)與對照(0.0 μmol/L)比較，aP<0.05，組間兩兩比較，aP<0.05。

2.3不同濃度NaAsO2染毒HELF細胞不同時間SOD活性、GSH-PX活性、MDA含量變化SOD活性隨NaAsO2染毒劑量升高而降低，實驗組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(F=450.778，P<0.01)。SOD活性隨NaAsO2作用時間延長而降低，實驗組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(F=3401.813，P<0.01)。實驗組SOD活性存在劑量-時間交互作用(F=93.478，P<0.01)。GSH-PX活性亦隨NaAsO2染毒劑量升高而降低(F=244.359，P<0.01)，隨NaAsO2作用時間延長而降低(F=79.295，P<0.01)，實驗組GSH-PX活性存在劑量-時間交互作用(F=15.689，P<0.01)。MDA含量與對照組相比，隨NaAsO2染毒劑量升高而升高，差異有統(tǒng)計學意義(F=105.383，P<0.01)；隨NaAsO2作用時間延長而升高，差異有統(tǒng)計學意義(F=1338.288，P<0.01)；實驗組MDA含量存在劑量-時間交互作用(F=10.628，P<0.01),見表2。

表2　NaAsO2染毒HELF對GSH-PX、SOD活性和MDA含量影響(n=3, -x±s)

注：組內(nèi)與對照(0.0 μmol/L)比較，aP<0.01； 組間兩兩比較，aP<0.01。

3討論

砷是一種廣泛存在于自然界中的類金屬特性的元素,可以通過污染水和空氣而導致多種疾病。肺作為砷毒性作用和致癌作用的靶器官之一，長期的砷暴露會導致肺損傷甚至引發(fā)肺癌。國外學者在對兒童進行肺功能評價時發(fā)現(xiàn)胚胎期或嬰幼兒早期發(fā)生砷暴露的個體，用力肺活量減少，肺功能相較非暴露兒童差[6]。Chen等[7]發(fā)現(xiàn)肺癌發(fā)病風險(RR)與砷暴露濃度存在一定劑量反應關(guān)系。因此研究砷致肺損傷的分子機制對于砷暴露相關(guān)肺疾病的防治具有十分重要的意義。

近年的實驗研究發(fā)現(xiàn)，砷通過引發(fā)氧化應激，可進一步造成機體內(nèi)多種細胞和分子通路的變化，包括信號通路的異常、抗氧化物酶活性的改變、機體自身抗氧化防御系統(tǒng)功能的降低等[8]。SOD作為重要的抗氧化酶，能清除多余的自由基；GSH-PX作為機體內(nèi)能使過氧化物分解的酶，可使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物；MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應的氧化終產(chǎn)物[9]。SOD、GSH-PX和MDA的異常變化，能較客觀地反映HELF細胞是否受到氧化損傷[10]。本研究結(jié)果顯示抗氧化酶SOD、GSH-PX活性和氧化產(chǎn)物MDA含量受NaAsO2染毒濃度和染毒時間的雙重影響。實驗組HELF細胞在10.0、20.0、30 μmol/L的NaAsO2分別作用24、48、72 h后，GSH-PX活性低于0.0 μmol/LNaAsO2的對照組(P<0.01)。GSH-PX活性的降低可能是砷與其活性中心發(fā)生氧化反應所致，也可能由于砷與該酶的底物-GSH結(jié)合而使其大量消耗所致[11]。本研究結(jié)果顯示實驗組SOD活性在NaAsO2作用24、48、72 h后，低于對照組(P<0.01)，而MDA含量高于對照組(P<0.01)。SOD是含有二硫鍵的巰基酶，其活性降低可能是砷進入機體后，與二硫鍵結(jié)合，使含有巰基的酶受到破壞；SOD減少，機體自由基清除能力下降，脂質(zhì)過氧化反應的持續(xù)進行，可進一步導致SOD的大量消耗，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的大量堆積[12]。這3項指標的變化，表明了HELF細胞在受到NaAsO2刺激時，HELF細胞的氧化應激損傷作用增強。

砷誘導的氧化應激損傷也可進一步導致細胞增殖受到抑制[13]。Jiang等[14]研究發(fā)現(xiàn)三價砷誘導的人支氣管上皮細胞內(nèi)GSH平衡紊亂，細胞增殖受到抑制；Han等[15]在對人肺退行性癌細胞(Calu-6)的研究中發(fā)現(xiàn)三氧化二砷可通過降低GSH的活性，誘導細胞凋亡，并且細胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)的活性也顯著降低。本研究使用亞砷酸鈉(≥10.0 μmol/L)染毒HELF細胞，結(jié)果顯示細胞抑制率與染毒濃度和作用時間均呈正相關(guān)，并且HELF細胞形態(tài)也隨著染毒劑量和染毒時間的加大發(fā)生異常的變化。此研究結(jié)果與楊萍等[16]研究發(fā)現(xiàn)5.0、10.0 μmol/L的NaAsO2致HELF的增殖率低于對照組的結(jié)論也相似。這可能與砷誘導細胞氧化損傷產(chǎn)生的某些氧化性物質(zhì)激活了某細胞信號通路，致使調(diào)控細胞生長的基因表達異常所致。如Ling等[17]研究發(fā)現(xiàn)慢性砷暴露誘導HELF細胞產(chǎn)生的活性氧可以激活通過ERK/NF-κB信號通路來促進腫瘤的發(fā)生和進展[18]。另外，砷化物本身可以作為一種刺激因素，激活某些細胞信號通路，如尹仕偉等[19]研究發(fā)現(xiàn)砷化物處理HELF細胞能使JNK信號通路產(chǎn)生劑量依賴性地激活(磷酸化)，使HELF發(fā)生凋亡。

結(jié)合本研究結(jié)果可以認為，亞砷酸鈉能擾亂人胚肺成纖維細胞的氧化/抗氧化平衡，使HELF細胞失去正常生長的形態(tài)，增殖受到抑制，抗氧化酶SOD、GSH-PX活性下降，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量上升，但砷致細胞氧化損傷及增殖抑制的具體機制尚需進一步研究。

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(本文編輯張巧蓮)

Effects of NaAsO2on oxidative stress and cell proliferation in

human embryonic lung fibroblast

DONG Juanjuan1, SUN Gaofeng2, XIE Huifang1

(1SchoolofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;

2UrumqiDiseaseControlandPreventionCenter,Urumqi830000,China)

Abstract:ObjectiveTo discuss effects of NaAsO2on oxidative stress and cell proliferation in human embryonic lung fibroblast (HELF). MethodsHELF were contaminated by NaAsO2of 10.0, 20.0 and 30.0 μmol/L which were the experimental groups for 24, 48 and 72 hours, respectively. The cell proliferation activity, the activity of Superoxide dismutase (SOD), the activity of Reducing glutathione peroxidase (GSH-PX), and the content of Malondialdehyde (MDA) were measured. ResultsCompared with the control group, after 24, 48 and 72 hours of contamination with NaAsO2at the three exposed doses, cell inhibition rates increased significantly dose-dependently and time-dependently (P<0.05). SOD and GSH-PX in all experimental groups decreased in dose-dependent way (P<0.05), while MDA in all groups increased significantly in dose-dependent way (P<0.01). And the 3 indexes all were in time-dependent interaction (P<0.01). ConclusionNaAsO2could reduce HELF proliferation activity and maybe exert antioxidant effect through regulating the 3 indexes.

Keywords:NaAsO2; human embryonic lung fibroblast; cell proliferation activity; oxidative stress

通信作者：王儉，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，研究方向：中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤與肉芽腫影像診斷,E-mail： jeanw1265@sina.com。

作者簡介：徐虓(1974-)，男，博士，副教授，副主任醫(yī)師，研究方向：乳腺癌、甲狀腺癌分子致病機制及應對策略,E-mail：329590035@qq.com。 陳樂(1981-)，男，在讀碩士，研究方向：分子影像學與中樞神經(jīng)系統(tǒng)影像診斷。

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金(2013211A069) 新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院干細胞基金(20091GXB-10)

[收稿日期：2015-07-06]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.01.006

中圖分類號：R994.6

文獻標識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)01-0028-05