李金芳，馬雪紅，宋百靈,，李新霞,3，陳　堅(jiān)

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊　830011；2新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司， 烏魯木齊　830013；3新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊　830011)

HPLC法測(cè)定大鼠血液中H2S的含量

李金芳1，馬雪紅1，宋百靈1,2，李新霞1,3，陳堅(jiān)2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊830011；2新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司， 烏魯木齊830013；3新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊830011)

摘要：目的建立測(cè)定大鼠血液中H2S含量的高效液相色譜法(HPLC法)。方法采用HPLC法，以乙腈-0.3%三乙胺=31∶69(磷酸調(diào)pH=2.07)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為664 nm。將大蒜辣素(Allicin)加入大鼠血細(xì)胞中，37℃孵育10 min后，測(cè)定Allicin進(jìn)入血細(xì)胞后釋放的H2S含量。結(jié)果HPLC法專屬性符合要求，H2S的線性范圍為0.8~80 μmol/L，定量限和檢測(cè)限分別為0.8 μmol/L和0.4 μmol/L。將大蒜辣素加入大鼠血細(xì)胞中孵育后有H2S產(chǎn)生，測(cè)得大蒜辣素產(chǎn)生的H2S含量為3.23 μmol/L。結(jié)論HPLC法可用于生物樣品中H2S的含量測(cè)定，檢測(cè)限滿足內(nèi)源性H2S測(cè)定要求。H2S是大蒜辣素在血細(xì)胞中孵育后的產(chǎn)物，大蒜辣素有望成為H2S的供體。

關(guān)鍵詞：大蒜辣素； HPLC； 亞甲藍(lán)法； H2S； 前藥

20世紀(jì)90年代，H2S被證實(shí)是存在于體內(nèi)的第3種氣體信號(hào)分子[1]。H2S對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用，還可舒張血管平滑肌，降低血壓[2]。研究表明內(nèi)源性H2S在腦內(nèi)的濃度為50~160 μmol/L[3]，在大鼠的血清濃度約為46 μmol/L[4]，在人血液中的H2S濃度為10~100 μmol/L[5]。內(nèi)源性H2S可通過(guò)酶途徑和非酶途徑產(chǎn)生。酶途徑有3個(gè)轉(zhuǎn)硫化作用關(guān)鍵酶，即胱硫醚-β-合成酶(tathionine-p-synthase，CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(stathionine-ylyase，CSE)和巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶(sulphurtransferase，MPST)。其中CBS分布于心腦血管和腎臟；CSE分布于心腦血管和肝臟；MPST分布于線粒體和細(xì)胞質(zhì)中。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，3種酶以半胱氨酸等含硫化合物為底物產(chǎn)生H2S[6-7]。非酶途徑的H2S是從細(xì)胞內(nèi)“酸-不穩(wěn)定硫儲(chǔ)庫(kù)(acid-labile sulfur pool)”中釋放，如硫烷硫(sulfanesulfur)[8]。

由于H2S的理化性質(zhì)，需尋找適當(dāng)化合物使之進(jìn)入機(jī)體后釋放H2S，該化合物被稱為H2S供體或前藥。目前開(kāi)發(fā)的前藥主要有植物衍生的天然產(chǎn)物、基于水解的H2S的前藥和控制H2S釋放的前藥[9]。以大蒜為代表的蔥屬植物，富含含硫化合物，含硫化合物可進(jìn)入血液紅細(xì)胞，在酶作用下釋放H2S而發(fā)揮活性作用。目前公認(rèn)的大蒜活性成分是蒜氨酸(Alliin)經(jīng)蒜酶(Alliinase)催化裂解產(chǎn)生的大蒜辣素(Allicin)，因此Allicin有可能是H2S的前藥[10]。

本研究采用柱前衍生H2S為穩(wěn)定亞甲藍(lán)，HPLC法測(cè)定大鼠血漿中H2S的含量；將Allicin加入大鼠血細(xì)胞孵育后，測(cè)定是否有H2S的產(chǎn)生，并進(jìn)行含量測(cè)定，為進(jìn)一步闡明大蒜活性成分在體內(nèi)的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(e2695，Waters)，分析天平(AB135-S，Mettler-Teledo)，紫外-可見(jiàn)分光光度儀(UV2550，日本島津)，低溫離心機(jī)(Multifugex-3R,賽默飛世爾科技公司)，超低有機(jī)物超純水機(jī)(Milli-Q Reference，上海密理博貿(mào)易有限公司)。

1.2試劑與藥品蒜氨酸(新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)公司，純度92.0%，批號(hào)20081201)，蒜酶(新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)公司，活力≥1 000 IU/g，批號(hào)20091201)，Na2S·9H2O(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)20111009)，(CH3COO)2Zn·2H2O(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)20110103)；N,N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)20120602)，F(xiàn)eC13·6H2O(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20120702)；亞甲基藍(lán)(天津永晟精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20120725)，去離子水(Milli-Q超純水制水機(jī)制得)，乙腈(Sigma-Aldrich公司，批號(hào)WXBB6450v)，甲醇(Sigma-Aldrich公司，批號(hào)WXBB6406v)。

2方法與結(jié)果

2.1溶液的配制

2.1.1大蒜辣素溶液的配制[11]分別取蒜氨酸0.079 4 g、蒜酶0.081 5 g，置10 mL量瓶中，加水溶解，25℃水浴反應(yīng)30 min，0℃、12 000 r/min離心10 min，超濾法除蛋白，取濾液適量，HPLC法測(cè)定Allicin濃度為0.017 4 mol/L。

2.1.2硫化鈉儲(chǔ)備液配制取Na2S·9H2O 0.048 0 g，置25 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度(C=0.008 mol/L)。

2.1.3醋酸鋅溶液配制取乙酸鋅10.976 0 g，置100 mL量瓶中，加冰醋酸2 mL溶解后，加水定容至刻度，搖勻，用時(shí)取5.00 mL加水稀釋至25.00 mL。

2.1.4N,N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽儲(chǔ)備液配制取N,N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽0.111 7 g，置25 mL量瓶中，加鹽酸1 mL溶解后，加水定容至刻度。

2.1.5三氯化鐵溶液的配制取三氯化鐵4.508 0 g，置100 mL量瓶中，加1.2 mol/L的鹽酸溶解并定容至刻度，混勻，用時(shí)取5.00 mL用1.2 mol/L鹽酸稀釋至25 mL。

2.1.6亞甲基藍(lán)儲(chǔ)備液配制取亞甲藍(lán)0.012 0 g，置10 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度(C=3.209 4×10-3mol/L)。

2.2色譜條件色譜柱Agilent ZORBAX Bonus-RP(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈∶0.3%三乙胺(用磷酸調(diào)pH=2.07)=31∶69，流速1.0 mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為664 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.3樣品前處理取供試品100 μL，加乙腈200 μL，渦旋混勻2 min，0℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，依次加醋酸鋅溶液、N,N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽溶液和三氯化鐵溶液各100 μL，渦旋1 min，室溫靜置60 min，0℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，備用。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1大鼠血液中H2S的專屬性分別取Na2S+大鼠血細(xì)胞+衍生化試劑、Allicin、Allicin+衍生化試劑、Allicin+大鼠血漿+衍生化試劑、Allicin+大鼠血細(xì)胞+衍生化試劑；按“2.3”項(xiàng)下方法操作處理樣品，進(jìn)行HPLC測(cè)定。專屬性考察結(jié)果顯示，Na2S與衍生化試劑反應(yīng)后生成的亞甲藍(lán)在3.75 min出峰(峰1)；Allicin加入大鼠血細(xì)胞中孵育10 min，加入衍生化試劑，在(3.75±0.01)min出峰，說(shuō)明有H2S釋放生成亞甲藍(lán)。大蒜辣素、大蒜辣素+衍生化試劑及大蒜辣素+衍生化試劑+血漿，均未見(jiàn)在相同時(shí)間出峰，說(shuō)明本法專屬性良好，見(jiàn)圖1。

圖1　Allicin專屬性考察色譜圖

2.4.2H2S的線性與范圍分別精密吸取硫化鈉(C=8.00×10-4mol/L)0.00、0.10、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。取大鼠血漿90 μL，依次加入上述系列濃度硫化鈉溶液10 μL，得濃度為0.8、8.0、16.0、32.0、48.0、64.0、80.0 μmol/L的溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法操作處理樣品，進(jìn)行HPLC分析。以平均峰面積()對(duì)硫化鈉濃度(C)進(jìn)行回歸，得回歸方程=368.23C+1 580，r=0.999 5(n=5)，表明硫化氫在0.8~80.0 μmol/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3方法的定量限與檢測(cè)限取硫化鈉溶液適量，用大鼠血漿逐級(jí)稀釋后，按“2.3”項(xiàng)下方法操作處理樣品，進(jìn)行HPLC分析，信噪比S/N=3，測(cè)得H2S的檢測(cè)限為0.4 μmol/L；標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度0.8 μmol/L為定量限。

2.4.4準(zhǔn)確度考察取大鼠血漿90 μL，依次加入低、中、高(80.0、320.0、640.0 μmol/L)3個(gè)濃度的硫化鈉溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法操作處理樣品，進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算各濃度RSD值和相對(duì)回收率。結(jié)果相對(duì)回收率分別為83.76%、97.25%、92.68%。相對(duì)回收率的RSD值分別為3.29%、1.97%、1.01%(n=5)，相對(duì)回收率值均在80%～120%范圍內(nèi)，符合生物樣品分析方法要求。

2.4.5精密度考察取大鼠血漿90 μL，依次加入低、中、高(80.0、320.0、640.0 μmol/L)3個(gè)濃度的硫化鈉溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法操作處理樣品，進(jìn)行HPLC分析。1 d內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，考察日內(nèi)精密度，計(jì)算得低、中、高濃度樣品的RSD分別為2.0%、2.1%和0.5%(n=5)。連續(xù)測(cè)定5 d，考察日間精密度，結(jié)果低、中、高濃度樣品的RSD分別為3.1%、1.3%和0.5%(n=5)。RSD值均<15%，符合生物樣品分析方法要求。

2.4.6提取回收率考察取大鼠血漿90 μL，依次加入低、中、高(80.0、320.0、640.0 μmol/L)3個(gè)濃度的硫化鈉溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法操作處理樣品，進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算平均樣品濃度(1)。

另取大鼠血漿90 μL，加乙腈180 μL，渦旋混勻2 min，0℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液90 μL，依次加入上述3個(gè)濃度的硫化鈉溶液各10 μL，同法衍生，搖勻，室溫靜置，0℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算平均樣品濃度(2)。計(jì)算提取回收率(1/2×100%)(n=5)。結(jié)果低、中、高3個(gè)濃度的提取回收率分別為87.7%、90.0%、90.1%，提取回收率的RSD值分別為2.1%、1.7%、1.2%，RSD值均<15%，符合生物樣品分析方法要求。

2.4.7穩(wěn)定性考察取大鼠血漿90 μL，依次加入低、中、高(80.0、320.0、640.0 μmol/L)3個(gè)濃度的硫化鈉溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法操作處理樣品，置于室溫0、2、4、8、12、24 h，進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果低、中、高濃度樣品的RSD值分別為4.8%、3.7%和1.1%(n=5)，說(shuō)明硫化鈉溶液在室溫放置，24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5樣品中H2S的含量測(cè)定取大鼠血細(xì)胞0.5 mL，加入Allicin(C=0.017 4 mol/L)0.30 mL，生理鹽水稀釋至1.00 mL，37℃孵育10 min，加水0.50 mL，渦旋2 min，靜置5 min后0℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法操作處理樣品，進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算大蒜辣素經(jīng)血細(xì)胞孵育后生成H2S的含量。結(jié)果表明，大蒜辣素經(jīng)大鼠血細(xì)胞孵育后有H2S生成，含量為3.23 μmol/L。

3討論

目前生物樣品中H2S檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法[12]，即在三氯化鐵存在的情況下，H2S與醋酸鋅、N,N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽形成穩(wěn)定的亞甲基藍(lán)(氯化-3.7-雙(二甲胺基)吩噻嚀-5-鎓三水化合物)，在650～670nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)。但測(cè)定時(shí)生物樣品中其他成分可能有干擾，專屬性較差，H2S的測(cè)定檢測(cè)限大于10 μmol/L；其他還有熒光分光光度法[13]、HPLC法[14-17]、敏感硫電極法[16]、氣相色譜法[19]、極譜法[20]、滴定法[21]和HS-電極法等。

本研究建立了HPLC-亞甲藍(lán)法測(cè)定大蒜辣素經(jīng)大鼠血細(xì)胞孵育后釋放的H2S的含量，結(jié)果表明待測(cè)成分能與血細(xì)胞中其他成分達(dá)到良好分離，線性范圍為0.8~80 μmol/L，定量限和檢測(cè)限分別為0.8 μmol/L和0.4 μmol/L。本研究與文獻(xiàn)[14-17]報(bào)道的HPLC-亞甲藍(lán)法相比，采用等度洗脫，方

法專屬性好，可滿足內(nèi)源性H2S測(cè)定的靈敏度要求。本研究曾嘗試HPLC-硫堇熒光法測(cè)H2S，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生成物熒光不穩(wěn)定，重現(xiàn)性較差，后續(xù)可進(jìn)一步篩選合適的熒光衍生化條件，提高方法的靈敏度。本實(shí)驗(yàn)將Allicin加入大鼠血細(xì)胞中可檢測(cè)到H2S，而加入血漿中未檢測(cè)到，單獨(dú)Allicin及其與衍生化試劑，不加血細(xì)胞時(shí)均檢測(cè)不到H2S，說(shuō)明血細(xì)胞中酶將Allicin轉(zhuǎn)化為H2S，Allicin在體內(nèi)活性作用是經(jīng)H2S介導(dǎo)產(chǎn)生的。但Allicin是不是紅細(xì)胞中CBS、CSE和MPST的最佳底物，還需在建立HPLC方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討，并研究3種酶對(duì)Allicin的催化動(dòng)力學(xué)。

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(本文編輯施洋)

·臨床醫(yī)學(xué)研究·

Development and validation of a HPLC method for determination of H2S in rat blood

LI Jinfang1, MA Xuehong1, SONG Bailing1,2, LI Xinxia1,3, CHEN Jian2

(1SchoolofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2XinjiangAilexin

PharmaceuticalCo.Ltd.,Urumqi830013,China;3Centrallaboratory,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo set up a HPLC method for the determination of H2S in rat blood. MethodsUsing a HPLC method, acetonitrile: 0.3% trimethylamine (pH adjusted by phosphate to 2.07) =31∶69 as mobile phase, and the detection wavelength was 664nm. Allicin was added in rat blood cells and after incubation at 37℃ for 10 min, measuring the concentration of H2S, which was released by Allicin. ResultsHPLC method specificity met the determination of H2S, a good linear relationship was obtained in the concentration range from 0.8 μmol/L to 80 μmol/L. The lowest limit of quantification (LLOQ) was 0.8 μmol/L, and the lowest limit of detection (LLOD) was 0.4μmol/L. H2S can be detected after adding Allicin in rat blood cells and the concentration of H2S was 3.23 μmol/L. ConclusionThis method was successfully applied to the determination of H2S inbiological samples. The detection limits met the determination of endogenous H2S. The results showed that H2S was the product of allicin in the blood, which was expected to become the donor of H2S.

Keywords:Allicin; HPLC; Methylene blue; H2S; Prodrug

通信作者：孫學(xué)斌,男,碩士,副主任醫(yī)師, 研究方向：骨病及運(yùn)動(dòng)損傷，E-mail: sunxuebin666@sina.com。 劉大鵬，男，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：骨外科，E-mail：2238443094@qq.com。

作者簡(jiǎn)介：陳慕芝(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕病研究。 趙凱(1987-)，男，在讀碩士，研究方向：骨外科。

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2014211C021) 新疆維吾爾自治區(qū)醫(yī)學(xué)聯(lián)合基金(2014211C121)

[收稿日期：2015-10-21]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.01.012

中圖分類號(hào)：R914

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-5551(2016)01-0056-04