周　洋， 謝鵬鳴， 許素玲， 周　梅， 白靖平

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1骨與軟組織科，2放療中心，3病理科, 烏魯木齊　830011)

術(shù)前調(diào)強(qiáng)放療對四肢軟組織肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響

周洋1， 謝鵬鳴1， 許素玲2， 周梅3， 白靖平1

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1骨與軟組織科，2放療中心，3病理科, 烏魯木齊830011)

摘要：目的探討術(shù)前調(diào)強(qiáng)放射治療(IMRT)對四肢軟組織肉瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法選取新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院骨與軟組織科2012年1月-2013年12月術(shù)前IMRT+手術(shù)的軟組織肉瘤患者23例。收集每例患者的活檢及手術(shù)后石蠟組織塊，自身IMRT前、后對照。采用免疫組織化學(xué)染色檢測Ki-67的表達(dá)，用增殖指數(shù)(PI)表示；應(yīng)用TUNEL法測定腫瘤細(xì)胞凋亡，用凋亡指數(shù)(AI)表示。比較IMRT前、后及不同臨床分期對PI、AI和AI/PI的影響。結(jié)果IMRT后PI明顯低于IMRT前(P<0.05)；IMRT后AI明顯高于IMRT前(P<0.05)；IMRT后AI/PI明顯高于IMRT前(P<0.05)；IMRT前Ⅲ期患者的PI和AI明顯高于Ⅱb期，IMRT后Ⅲ期患者的PI低于Ⅱb期，AI高于Ⅱb期，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；調(diào)強(qiáng)放療后Ⅱb期和Ⅲ期的AI/PI與調(diào)強(qiáng)放療前比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，但I(xiàn)MRT前和IMRT后不同臨床分期AI/PI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論IMRT可以誘導(dǎo)軟組織肉瘤細(xì)胞的凋亡，抑制軟組織肉瘤細(xì)胞的增殖。AI/PI在IMRT前、后的變化可以評價術(shù)前放療的療效。

關(guān)鍵詞：調(diào)強(qiáng)放療; 軟組織肉瘤; 增殖指數(shù); 凋亡指數(shù); Ki-67

目前臨床上四肢軟組織肉瘤(STS)的主要治療手段為手術(shù)治療，隨著治療理念和外科技術(shù)的不斷進(jìn)步，保肢手術(shù)的適應(yīng)證逐漸放寬。由于輔助治療技術(shù)的發(fā)展，使得局部晚期的STS患者經(jīng)過輔助放化療的干預(yù)，保肢率有較大提高。研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前放療在軟組織肉瘤的治療中的療效已得到肯定，術(shù)后傷口并發(fā)癥發(fā)生率高[1-3]。有關(guān)精確放療在STS中的應(yīng)用報道較少。本研究采用調(diào)強(qiáng)放療(IMRT)技術(shù)對四肢STS患者進(jìn)行術(shù)前放療，檢測IMRT前、后STS組織Ki-67的表達(dá)(PI，增殖指數(shù))和凋亡情況(AI，凋亡指數(shù))，旨在探討術(shù)前IMRT對軟組織肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為軟組織肉瘤IMRT更進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究、術(shù)前IMRT療效判定和疾病預(yù)后的評估提供客觀依據(jù)。

1材料與方法

1.1一般資料選擇新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院骨與軟組織科2012年1月-2013年12月收治的局部晚期四肢STS患者23例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理診斷明確為四肢軟組織肉瘤的初治患者；(2)美國癌癥分期聯(lián)合委員會(AJCC)軟組織肉瘤分期為Ⅱb～Ⅲ期者；(3)影像學(xué)評估無安全外科邊界(毗鄰重要血管、神經(jīng)及骨骼等組織，局部晚期)者；(4)無放療禁忌證；(5)自愿接受術(shù)前放療者。排除合并嚴(yán)重慢性疾病、其他惡性腫瘤、依從性差、既往有放療史及放療區(qū)域皮膚異常的患者。23例局部晚期四肢STS患者術(shù)前IMRT后均行腫瘤R0切除。其中男性13例，女性10例，中位年齡34.5歲；原發(fā)部位：小腿5例，大腿7例，上臂6例，肩胛區(qū)1例，踝關(guān)節(jié)區(qū)1例，膝關(guān)節(jié)區(qū)1例，臀部2例；AJCC臨床分期：Ⅱb期11例，Ⅲ期12例；病理類型：滑膜肉瘤5例，尤文氏肉瘤3例，多形性肉瘤(惡性纖維組織細(xì)胞瘤)2例，原始神經(jīng)外胚層腫瘤(PNET)2例，上皮樣肉瘤2例，惡性神經(jīng)鞘瘤2例，纖維肉瘤4例，脂肪肉瘤3例。收集23例患者IMRT前穿刺活檢腫瘤石蠟組織塊和IMRT后手術(shù)大體標(biāo)本腫瘤石蠟組織塊，進(jìn)行自身IMRT前、后對照。

1.2主要試劑即用型鼠抗人Ki-67單克隆抗體(ZM-0165)、PV超敏試劑盒、DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3方法每個蠟塊連續(xù)切片4張，厚度4 μm，采用免疫組織化學(xué)(PV二步法)檢測Ki-67的表達(dá)，應(yīng)用TUNEL法檢測原位細(xì)胞凋亡，免疫組化陰性對照由PBS代替一抗，原位細(xì)胞凋亡檢測陰性對照用PBS代替標(biāo)記液，以試劑公司提供的陽性對照片作為陽性對照。

1.4結(jié)果判定

1.4.1免疫組化法檢測Ki-67的表達(dá)Ki-67陽性表達(dá)可見腫瘤細(xì)胞核有棕黃色顆粒，隨機(jī)計數(shù)10個高倍(40×10倍)視野，每個視野連續(xù)計數(shù)100個細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)，其平均數(shù)記為Ki-67增殖指數(shù)(Proliferation index，PI)[4]。

1.4.2TUNEL法檢測原位細(xì)胞凋亡凋亡細(xì)胞：熒光顯微鏡下細(xì)胞核中有黃綠色顆粒者；普通顯微鏡下細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者。隨機(jī)計數(shù)10個高倍(40×10倍)視野，每個視野連續(xù)計數(shù)100個細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)，其平均數(shù)記為凋亡指數(shù)(Apoptosis index，AI)[5]。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS18.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所測計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，采用配對資料的符號秩和檢驗(yàn)比較IMRT前、后的差異，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)的比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1調(diào)強(qiáng)放療前、后PI、AI和AI/PI的比較調(diào)強(qiáng)放療后的Ki-67蛋白陽性細(xì)胞數(shù)少于調(diào)強(qiáng)放療前(圖1A、1B)；調(diào)強(qiáng)放療前PI為(63.02±17.93)，調(diào)強(qiáng)放療后PI為(36.56±18.47)，調(diào)強(qiáng)放療后PI明顯低于調(diào)強(qiáng)放療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.361，P=0.001)。調(diào)強(qiáng)放療后凋亡細(xì)胞數(shù)量高于調(diào)強(qiáng)放療前(圖2A～2D)；調(diào)強(qiáng)放療前AI為(24.25±6.34)，調(diào)強(qiáng)放療后AI為(35.07±13.71)，調(diào)強(qiáng)放療后AI明顯高于調(diào)強(qiáng)放療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.840，P=0.005)。調(diào)強(qiáng)放療前AI/PI為(0.433±0.205)，調(diào)強(qiáng)放療后AI/PI為(1.262±0.779)，調(diào)強(qiáng)放療后AI/PI明顯高于調(diào)強(qiáng)放療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.367，P=0.005)。

2.2臨床分期對調(diào)強(qiáng)放療前后PI、AI和AI/PI的影響調(diào)強(qiáng)放療前Ⅲ期患者的PI和AI明顯高于Ⅱb期，調(diào)強(qiáng)放療后Ⅲ期患者的PI低于Ⅱb期患者，AI高于Ⅱb期患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；調(diào)強(qiáng)放療后Ⅱb期和Ⅲ期的AI/PI與調(diào)強(qiáng)放療前比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，但I(xiàn)MRT前和IMRT后不同臨床分期AI/PI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

圖1AIMRT前Ki-67蛋白的表達(dá)(IHC×400)

圖1B IMRT 后Ki-67 蛋白的表達(dá)(IHC×400)

圖2AIMRT前(TUNEL法 光鏡×400)

圖2BIMRT后(TUNEL法 光鏡×400)

圖2CIMRT前(TUNEL法 熒光顯微鏡×400)

圖2DIMRT后(TUNEL法 熒光顯微鏡×400)

表1　不同臨床分期IMRT前、后PI、AI和AI/PI的比較(-x±s)

注：與Ⅱb期比較，*P<0.05；與IMRT前比較，△P<0.05。

3討論

軟組織肉瘤是起源于間葉組織、發(fā)生在骨骼肌等軟組織的一類原發(fā)性惡性腫瘤。傳統(tǒng)治療方式多為截肢或局部切除。盡管截肢能獲得較好的局部控制,但手術(shù)后生活質(zhì)量明顯下降。因腫瘤緊鄰血管神經(jīng)束，為了保留患肢功能，局部切除后常無法保證切緣陰性或小切緣，故單純局部切除因受局部解剖因素的限制，難以達(dá)到廣泛切除的邊界，復(fù)發(fā)率高。軟組織肉瘤的復(fù)發(fā)率高與切緣陽性率高直接相關(guān)[6-7]。

術(shù)前放療用于保肢手術(shù)的輔助治療效果已得到肯定[8]。術(shù)前放療還可以殺滅“反應(yīng)區(qū)”內(nèi)的“衛(wèi)星灶”，減少手術(shù)操作可能造成的腫瘤播散或種植，在提高保肢率的同時可取得較高的局部控制率。目前關(guān)于軟組織肉瘤術(shù)前放療多為常規(guī)放療，療程長，放療后纖維化及術(shù)后切口并發(fā)癥發(fā)生率高。本研究將IMRT技術(shù)用于軟組織肉瘤術(shù)前放療，可降低術(shù)前放療的毒性反應(yīng)，同時保證療效。

Ki-67能可靠地反映細(xì)胞的增殖活性，有利于惡性腫瘤治療方法的選擇和治療效果的評估。Ki-67表達(dá)越高，腫瘤對放射線照射越敏感[9]。以Ki-67表達(dá)變化來評估新輔助放療對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，在其他腫瘤的研究中已有相關(guān)報道。Andrade等[10]報道新輔助放化療后，直腸癌組織中以Ki-67標(biāo)記的腫瘤增殖指數(shù)明顯下降下降。Hafeez等[11]研究表明Ki-67的表達(dá)是早期乳腺癌患者保乳術(shù)后的預(yù)后因素之一，治療后Ki-67表達(dá)越高，預(yù)后越差，反之，預(yù)后越好。

軟組織肉瘤病理分級對臨床分期影響較大，Ⅱb期與Ⅲ期病理分級分別為G2和G3，其余分期指標(biāo)基本一致。本研究表明，尤文氏肉瘤、滑膜肉瘤及多形性肉瘤(Ⅲ期)等的Ki-67表達(dá)較高，增殖指數(shù)越高，放射敏感性好，療效好；相反，脂肪肉瘤、纖維肉瘤及惡性神經(jīng)鞘瘤(Ⅱb期)等的Ki-67表達(dá)相對較低，增殖指數(shù)較低，這與軟組織肉瘤生物學(xué)行為相符。本組患者IMRT后Ki-67的表達(dá)(增殖指數(shù))較IMRT前明顯下降(P<0.05)，Ⅱb期和Ⅲ期患者在IMRT前、后增殖指數(shù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明術(shù)前IMRT能降低軟組織肉瘤細(xì)胞增殖活性，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。Ki-67標(biāo)記的增殖指數(shù)能較好地反映術(shù)前IMRT的敏感性，術(shù)前IMRT后增殖指數(shù)的降低可能提示軟組織肉瘤患者較好的預(yù)后。

細(xì)胞凋亡是有別于細(xì)胞壞死的一種細(xì)胞死亡形式，是一種程序化過程。近年來的研究表明，細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、療效及預(yù)后密切相關(guān)，已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)[12]。放射線可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]，達(dá)到控制或消滅腫瘤的目的，放療后如果腫瘤組織凋亡指數(shù)(AI) 明顯上調(diào)，說明腫瘤細(xì)胞對放療敏感，療效及預(yù)后相對較好。

劉福坤等[14]研究術(shù)前輔助放療對直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示：新輔助放療后直腸癌細(xì)胞的凋亡指數(shù)高于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提出放療主要通過促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生治療作用。

本研究結(jié)果顯示：惡性程度較高的軟組織肉瘤，如尤文氏肉瘤、滑膜肉瘤和多形性肉瘤等Ⅲ期患者經(jīng)術(shù)前IMRT后，腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)較治療前明顯升高(P<0.05)；脂肪肉瘤、纖維肉瘤和惡性神經(jīng)鞘瘤等Ⅱb期患者IMRT后凋亡指數(shù)也有增高，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但變化程度不如尤文氏肉瘤等顯著，這與此類腫瘤對放射線敏感程度較高有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：IMRT后凋亡指數(shù)較治療前明顯升高，說明IMRT可不同程度地誘導(dǎo)軟組織肉瘤細(xì)胞的凋亡，從而可以通過治療前、后的凋亡情況評價軟組織肉瘤新輔助放療的療效。

腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡是評價治療敏感程度和疾病預(yù)后的重要指標(biāo)。放射線是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖來清除腫瘤細(xì)胞，因此術(shù)前IMRT療效應(yīng)以凋亡和增殖的綜合因素評價。本研究采用AI/PI作為判定術(shù)前IMRT療效的指標(biāo)，結(jié)果顯示IMRT前和IMRT后不同臨床分期AI/PI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，認(rèn)為AI/PI更能客觀、準(zhǔn)確、穩(wěn)定地評估軟組織肉瘤新輔助放療的療效。AI、PI及AI/PI可否作為軟組織肉瘤預(yù)后判斷的指標(biāo)，還需長期隨訪，分析其與復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等臨床特征的關(guān)系，進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯王艷)

The effect of prepoperative intensity modulated radiation therapy on cell

proliferation and apoptosis in the limb soft tissue sarcoma

ZHOU Yang1， XIE Pengming1， XU Suling2， ZHOU Mei3， BAI Jingping1

(1DepartmentofBoneandSoftTissueOncology,2DepartmentofRadiationOncology，

3DepartmentofPathology，theAffiliatedTumorHospital，XinjiangMedicalUniversity，

Urumqi830011，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of preoperative intensity-modulated radiation therapy (IMRT) on proliferation and apoptosis in limbs soft tissue sarcoma. MethodsThe 23 limbs soft tissue sarcoma patients in treatment of preoperative IMRT + surgery between January 2012 and December 2013 in department of Bone and soft tissue oncology of the affiliated tumor hospital in Xinjiang Medical University were selected and analyzed by self-contrast study. The expression of Ki-67 was detected by immunohistochemical technique, indicated with the proliferation index (PI) and apoptosis index (AI) was detected by TUNEL. ResultsPI after IMRT was significantly lower than that before IMRT (P<0.05); AI after IMRT was significantly higher than that before IMRT (P<0.05); AI/PI after IMRT was significantly higher than that before IMRT (P<0.05). Before IMRT, PI and AI in stage Ⅲ were significantly higher than stage Ⅱb; after IMRT, PI in stage Ⅲ was below than that in stage Ⅱb, while AI in stage Ⅲ was higher than that in stage Ⅱb, in which the differences were statistically significant (P<0.05); in clinical staging Ⅱb and Ⅲ, the differences of AI/PI before and after IMRT were statistically significant (P<0.05); before and after IMRT, the differences of AI/PI in different clinical stages were not statistically significant (P>0.05). ConclusionIMRT can induce apoptosis of soft tissue sarcoma cells and inhibit the proliferation, and AI/PI ratio can evaluate the effect of preoperative IMRT in limbs soft tissue sarcoma.

Keywords:intensity-modulated radiation therapy; soft tissue sarcomas; proliferation index; apoptosis index; Ki-67

通信作者：姚華，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：健康管理，E-mail：535052988@qq.com。

作者簡介：王育珊(1983-)，女，衛(wèi)生事業(yè)管理主管醫(yī)師，碩士，研究方向：健康管理。

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)科技計劃項(xiàng)目(201517102)

[收稿日期：2015-04-20]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.01.017

中圖分類號：R738.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)01-0077-04