李 偉，湯 杰，譚榮威，曹 庸，陳運(yùn)嬌＊

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

醇提水沉與水提醇沉對(duì)桉葉多酚提取物抗氧化活性的影響

李 偉1,2，湯 杰1,2，譚榮威1,2，曹 庸1,2，陳運(yùn)嬌1,2＊

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

本文以氧化自由基吸收能力(ORAC)、DPPH自由基清除能力以及多酚含量為指標(biāo)，探討醇提水沉法、水提醇沉法對(duì)桉多酚提取物抗氧化性的影響。結(jié)果表明，醇提水沉法上清液組分ORAC值高于其沉淀組分，也高于水提醇沉法的沉淀組分和其上清液組分。醇提水沉上清液組分多酚含量以及清除DPPH自由基活性均強(qiáng)于其他組分。因此可得醇提水沉法優(yōu)于水提醇沉法，這對(duì)桉多酚后期的分離純化起到指導(dǎo)作用。

醇提水沉；水提醇沉；氧化自由基吸收能力(ORAC)；DPPH自由基

桉樹(Eucalyptus)具有生長快、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、抗病蟲害能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是世界性造林樹種[1]。我國引進(jìn)桉樹已經(jīng)有100多年歷史，桉樹人工林種植面積約450萬hm2，廣泛種植于華南、廣西等地，每年桉樹葉的產(chǎn)量為2000多萬噸[2-4],除了少部分用來提取桉葉油之外，大部分被焚燒，導(dǎo)致環(huán)境污染。目前較多的研究主要集中在桉樹種植、木材加工等方面，對(duì)于桉葉活性成分研究相對(duì)較少。

現(xiàn)有研究表明，桉葉中除含有揮發(fā)性芳香油以外，還含有大量黃酮類化合物、?；g苯三酚衍生物、非揮發(fā)性萜類及其苷類、鞣質(zhì)等活性物質(zhì)[5]。同時(shí)，植物多酚因其具有較強(qiáng)的抗氧化性以及對(duì)氧自由基的清除能力而逐漸成為研究熱點(diǎn)之一。多酚提取方法主要有溶劑浸提法、超聲波提取法和微波提取法，不同提取方法提取出的物質(zhì)有不同的活性成分。一種合理的提取方法能最大限度地提取出有效成分并且還有可能除去不相關(guān)的成分[6]。本實(shí)驗(yàn)采用溶劑提取法中醇提水沉法與水提醇沉法對(duì)桉多酚抗氧化活性影響進(jìn)行比較研究，旨在選出最合理的提取方式，為后續(xù)分離純化乃至生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)所用的乙醇、過硫酸鉀、三氯乙酸、鐵氰化鉀、Na2CO3、維生素C、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、H2O2、鄰二氮菲、FeSO4、甲硫氨酸、核黃素為分析純試劑，均在有效期內(nèi)使用；DPPH?(2，2-二苯代苦味肼基)、福林-酚試劑，均為Sigma公司試劑。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FW100型高速萬能粉碎機(jī)：(天津市華鑫儀器廠)；R204旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：(上海申生科技有限公司)；FD-1型冷凍干燥機(jī)：(北京博醫(yī)康技術(shù)公司)；AL 104電子天平：(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；KQ-500B型超聲波清洗器：(昆山市超聲儀器有限公司)；pH計(jì)：(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；SH-D真空泵：(河南予華儀器有限公司)；WZ-100恒溫水浴鍋：(上海申生科技有限公司)；U-3010紫外可見分光光度計(jì)：(日本日立公司)；MK-3酶標(biāo)儀：(Thermo Labsystems 公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料

桉葉取自巨尾桉(E.grandis×E.uropnhlla)廣林九號(hào)，采于廣東湛江，自然陰干，粉碎。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別設(shè)計(jì)醇提水沉和水提醇沉兩種提取方法對(duì)“廣林九號(hào)”桉樹葉進(jìn)行提取和純化，并對(duì)不同提取方法中所得粗提液、上清液和沉淀物組分進(jìn)行多酚含量、抗氧化活性等分析測定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)3組重復(fù)。

1.2.2 醇提水沉法與水提醇沉法純化桉多酚工藝試驗(yàn)

夏循禮等[7]分別采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究了提取溶劑濃度、提取次數(shù)、提取時(shí)間、溶劑用量以及醇沉溶劑濃度等對(duì)醇提水沉法和水提醇沉法提取杜仲(Eucommia ulmoides)葉活性成分的影響。本文在作者團(tuán)隊(duì)研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行方法優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)方法為：

醇提水沉法：桉葉粉2 g，以60%乙醇為提取溶劑，料液比1:25，常溫下提取1 h后濃縮至無醇味，待冷卻后高速離心得到上清液與沉淀，上清液與沉淀分別濃縮干燥得到干樣備測。

水提醇沉法：桉葉粉5 g，以水為提取溶劑，料液比1:20，常溫提取1 h后，濃縮至近干，加入90%乙醇沉淀，待冷卻，高速離心得到上清液與沉淀，分別濃縮干燥后備測。

沉淀率按如下公式計(jì)算：

沉淀率=[沉淀質(zhì)量/(沉淀質(zhì)量+溶液中干物質(zhì)質(zhì)量)]*100%

1.2.3 分離各組分多酚含量測定

較為常用的植物多酚測定方法有：酒石酸亞鐵比色法、福林-酚比色法等[8-9]。其中，福林-酚比色法是根據(jù)酚類化合物在堿性條件下可以將鎢鉬酸還原，生成藍(lán)色的化合物，顏色的深淺與酚含量呈正相關(guān)，在760 nm波長下測吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測定樣品的總多酚含量，參照凌關(guān)庭[8]所述多酚測定方法對(duì)桉葉總多酚進(jìn)行測定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取真空干燥至恒重的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品44.3mg，用50%甲醇溶解并定容至100mL。以此溶液分別配成濃度為8.86、17.72、35.44、52.16、70.88和88.60 μg·mL-1的溶液。分別取上述不同濃度溶液 1mL加到10mL比色管中，然后依次加入1mL去離子水，0.5mL已稀釋2倍的福林-酚試液，1.5mL 26.7% Na2CO3溶液，最后用水定容至10mL，室溫下反應(yīng)2 h，在760 nm下測定其吸光度。由吸光度對(duì)濃度進(jìn)行回歸分析，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試樣測定：準(zhǔn)確稱取桉多酚粗提物、醇提水沉上清液組分、醇提水沉沉淀組分、水提醇沉上清液組分、水提醇沉沉淀組分各10mg，用50%甲醇溶解。取1mL樣品加到10mL比色管中，依次加入去離子水1mL、福林-酚試液0.5mL、26.7% Na2CO3溶液1.5mL，然后用水定容至10mL，室溫下反應(yīng)2 h，在760 nm下測定其吸光度。測定的吸光度代入所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得試樣中總多酚的含量，以沒食子酸含量計(jì)。

1.2.4 分離各組分抗氧化活性指數(shù)(ORAC)

抗氧化活性指數(shù)(ORAC)參照文獻(xiàn)[10-11]測定 。AAPH溶液的制備：精確稱取AAPH 414.00mg，以磷酸鹽緩沖液溶解并定容至10mL量瓶，即得濃度為153mmol·L-1的AAPH溶液。

FL溶液的制備：精確稱取FL 40.00mg，以PH7.4的75mmol·L-1磷酸鹽緩沖液溶解定容為25mL，制成4.25mmol·L-1的FL溶液，記為FL母液A。精確吸取FL 母液A 50 μL置50mL 量瓶中以上述緩沖液定容至刻度，得到4.25×10-3mmol·L-1溶液，記為FL母液B；FL母液A，B均于4℃冷藏。實(shí)驗(yàn)時(shí)精確吸取FL母液B 500 μL置25mL量瓶中，以上述緩沖液定容至刻度，即得8×10-3mmol·L-1的稀釋液。

Trolox溶液的制備：精確稱取Trolox 2.50mg，以甲醇溶解并定容至10mL量瓶，即得1mmol·L-1的Trolox溶液。實(shí)驗(yàn)時(shí)分別精確吸取Trolox甲醇溶液1000、800、600、400、200和100 μL于10mL量瓶中，pH 7.4的75mmol·L-1磷酸鹽緩沖液定容，配成不同濃度Trolox溶液。

樣品的制備：精確稱取樣品以甲醇適量溶解，配制成1000mg·L-1母液，繼而以磷酸鹽緩沖液稀釋成10mg·L-1的樣品溶液備測。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精確吸取FL稀釋液100 μL于96孔熒光板中，以激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長514 nm進(jìn)行測定并記錄熒光值(記為A0)。隨后加入不同濃度Trolox溶液50 μL振蕩3min，37℃溫育10min后迅速加入AAPH 液50 μL啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)過程中每隔1.5min測定一次熒光值(記為Fn)。直至熒光值衰減至直線。按式(1)計(jì)算熒光衰退曲線下的面積(AUC)、式(2)計(jì)算保護(hù)面積(Net AUC)，以Trolox溶液濃度為橫坐標(biāo)，以NetAUC為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試樣測定：分別稱取桉多酚粗提物、醇提水沉上清液組分、醇提水沉沉淀組分、水提醇沉上清液組分、水提醇沉沉淀組分各10mg，用50%甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，搖勻。準(zhǔn)確吸取各樣品溶液100 μL加入10mL容量瓶中并用pH7.4磷酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻，按上述方法測定不同樣品ORAC值。

1.2.5 分離各組分清除DPPH自由基活性

參照文獻(xiàn)[12-13]的方法，將桉多酚、醇提水沉上清液組分、醇提水沉沉淀組分、提水醇沉上清液組分、水提醇沉沉淀組分用50%甲醇配成0.1mg·mL-1濃度，取上述配好樣品0.2mL 及1×10-4mol·L-1DPPH溶液3.8mL加入同一具塞試管中搖勻，在室溫下密閉靜置30min，用純?nèi)軇┳鲄⒈?，?17 nm波長下測定吸光度。根據(jù)式(3)計(jì)算每種提取液對(duì)DPPH自由基的清除率：

其中：As為加0.2mL提取液后DPPH溶液的吸光度；

Asb為0.2mL提取液+3.8mL溶劑(甲醇)后的吸光度；

Ac為0.2mL溶劑(甲醇)+3.8mL DPPH溶液的吸光度。

根據(jù)上述方法測定其清除率，根據(jù)回歸方程求出清除率達(dá)50%時(shí)的樣品濃度即IC50。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010與SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理，采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇提水沉與水提醇沉法沉淀得率研究

多酚類物質(zhì)引起具有較多的極性基團(tuán)而帶有較強(qiáng)的極性，可溶于水、乙醇、丙酮等親水性有機(jī)溶劑。根據(jù)相似相溶的原理，醇提水沉與水提醇沉法利用的是乙醇與水之間的極性差異，從而進(jìn)一步純化抗氧化組分。由表1可以看出，醇提水沉法沉淀率明顯高于水提醇沉法沉淀率。醇提水沉法與水提醇沉法均通過沉淀分離從而達(dá)到提高沉淀或者溶液部分中抗氧化物質(zhì)含量的目的。綜合分析，醇提水沉法采用的是60%濃度的乙醇溶液作為提取溶劑，溶液將桉葉中大量較弱的極性物質(zhì)提取出來，因而水沉之后產(chǎn)生了28.4%的水不溶物；而桉葉中較弱極性物質(zhì)含量多于不溶于90%乙醇的強(qiáng)極性物質(zhì)，因而沉淀率較低，只有12.22%。袁春龍等[14]以70%乙醇做浸提劑對(duì)葡萄皮渣中的多酚物質(zhì)進(jìn)行浸提在優(yōu)化工藝條件下多酚得率達(dá)80%左右。但作為食品添加劑或者功能食品的原材料則必須使用安全、無毒的提取溶劑，因而往往采用乙醇、水體系用于多酚提取。

2.2 分離各組分多酚含量分析

如圖1所示，多酚含量的測定以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制沒食子酸濃度—吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線，多酚含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)體系760 nm波長下吸光值為縱坐標(biāo)，并計(jì)算回歸方程。

表1 醇提水沉法與水提醇沉法沉淀率

圖1 多酚含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 分離得到的各組分總酚含量

通過測定不同樣品反應(yīng)后吸光值，結(jié)果如圖2所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示桉葉粗提物多酚含量達(dá)41.9%，經(jīng)醇提水沉后，上清液干燥物多酚含量增加至43.2%。而水提醇沉法，上清液干燥物多酚含量為42.0%，而其沉淀干燥物多酚含量顯著低于其他各組分(P<0.05)，為32.2%。本研究團(tuán)隊(duì)田宏[15]對(duì)桉多酚成分抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：提取物中酚類物質(zhì)的含量與抗氧化性成正相關(guān)，初步判斷桉葉非揮發(fā)性成分其抗氧化活性的物質(zhì)為多酚類。王俊亮等[16]研究表明，比較桉葉不同萃取物抗氧化能力與其總酚含量關(guān)系，總酚含量越多，抗氧化能力越強(qiáng)，其抗氧化能力與其總酚含量成正相關(guān)，因此桉葉中主要為多酚類物質(zhì)起到抗氧化作用的功效。因此，相比于水提醇沉，醇提水沉后上清液干燥物多酚含量的增加有利于提高其抗氧化性。

2.3 分離各組分ORAC值變化

通過ORAC法評(píng)價(jià)醇提水沉法、水提醇沉法2種分離純化方法制備上(上清液)、下(沉淀)組分的抗氧化活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：

圖3 分離得到的各組分ORAC值

Osawa等[17]用硫氰酸鹽和TBA研究了從藍(lán)桉(E.globulus)中分到的正三十三烷-16，18-二酮、4-羥基三十三烷-16，18-二酮的抗氧化活性，結(jié)果表明在水-醇系中均具有明顯的抗氧化活性，其活性高于維生素E和丁羥胺尼唑，而在油系中無抗氧化活性。由圖3可以看出，醇提水沉與水提醇沉法均有一定的抗氧化組分純化效果，本實(shí)驗(yàn)以正交優(yōu)化后提取工藝桉葉粗提物為對(duì)照，分別比較了2種方法分離各組分抗氧化活性，醇提水沉法去除沉淀后上清液干物質(zhì)ORAC值顯著高于醇提水沉下層和水提醇沉下層(P<0.05)。而且水提醇沉法不論沉淀還是上清液干物質(zhì)組分ORAC值均低于粗提物。

2.4 分離各組分清除DPPH自由基活性分析

根據(jù)評(píng)價(jià)抗氧化活性采用兩種或兩種以上方法的原則，采用DPPH法評(píng)價(jià)醇提水沉法與水提醇沉法各組分抗氧化活性，結(jié)果如圖4：

圖4 分離得到的各組分清除DPPH自由基活性

田玉紅[18]采用DPPH自由基清除法分別評(píng)價(jià)了桉葉揮發(fā)性成分(油相成分和水溶性成分)的抗氧化性能。桉葉的水溶性揮發(fā)成分(IC50為0.46-3.15mg·mL-1)對(duì)DPPH自由基的清除作用比油相成分(IC50為0.74-26.96mg·mL-1)顯著增強(qiáng)，分析是桉葉水溶性揮發(fā)成分中含有的酚類物質(zhì)作用的結(jié)果。由圖4可知，桉葉粗提物對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到33.1%，經(jīng)醇提水沉后，上清液干燥物對(duì)DPPH自由基清除率上升至35.23%，而水提醇沉上清液干燥物、水提醇沉沉淀部分清除率均顯著小于粗提物和醇提水沉上清液干燥物、水提醇沉沉淀部分(P<0.05)。

3 結(jié)論

通過研究比較醇提水沉和水提醇沉提取桉多酚對(duì)抗氧化活性的影響，以多酚含量、ORAC以及DPPH為指標(biāo)，醇提水沉法提取后得到的多酚總量和抗氧化活性均高于水提醇沉法，得出醇提水沉法優(yōu)于水提醇沉法。本研究提供了一種制備桉多酚的科學(xué)方法，為進(jìn)一步優(yōu)化其工藝以及后續(xù)分離純化打下基礎(chǔ)。

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The Effect of Water-extraction and Alcohol-precipitation Method and Alcohol-extraction and Water-precipitation Method on the Antioxidant Activity ofEucalyptusPolyphenols

LI Wei1,2, TANG Jie1,2, TAN Rong-wei1,2, CAO Yong1,2, CHEN Yun-jiao1,2
(1.College of Food Science, South China Agricultural University,Guangzhou510642,Guangdong,China; 2.Guangdong Province Engineering Research Center for Bioactive Natural Products,Guangzhou510642,Guangdong,China)

In this study, we considered the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) value, DPPH free radical scavenging activity and polyphenols content as indexes to compare the antioxidant activity of compounds obtained from eucalypt leaves by the water-extraction and alcohol-precipitationmethod (WEAP) to those obtained by the alcohol-extraction and water-precipitationmethod (AEWP). The results showed that the ORAC value of supernatant from AEWP was higher than those of the precipitation from AEWP, and higher than the supernatant and precipitation from WEAP. Similarly, the DPPH free radical scavenging activity and polyphenols content of supernatant from AEWP were highest among those four components. In conclusion, AEWP was better than WEAP, and it played a guiding role for purification ofEucalyptuspolyphenols.

alcohol-extraction and water-precipitationmethod; Water-extraction and alcohol-precipitationmethod; oxygen radical absorbance capacity; DPPH free radical

TQ463

A

廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目(2015A030310118)；廣東省自然科學(xué)基金自由申請項(xiàng)目(2016A030313394)；廣東省教育廳科研項(xiàng)目(平臺(tái))( 2013gjhz0003)

李偉(1991— )，男，在讀碩士，主要從事天然活性物分離純化研究.E-mail: 13535584901@163.com

＊通訊作者：陳運(yùn)嬌(1984— )，女，講師.E-mail: yunjiaochen@scau.edu.cn