韓銀濤　劉劍鋒　王建輝　曹愛巧　魏勇　趙輝

摘要：為了解江蘇省某豬場的感染狀況，本試驗采用復(fù)合PCR技術(shù)，并結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查和臨床癥狀觀察、病理剖檢、病理切片等方法對發(fā)病的保育豬進(jìn)行診斷，結(jié)果顯示，PCR方法檢測出豬偽狂犬病毒和豬圓環(huán)病毒處有明顯條帶。結(jié)果表明該豬場存在豬偽狂犬病毒病與豬圓環(huán)病毒病的混合感染，采用經(jīng)實驗室診斷給出的綜合防治方案治療后，疫情得到控制。本次病例的診治為養(yǎng)豬業(yè)可能發(fā)生的豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒并的混合感染提供了有效的防治方法和借鑒經(jīng)驗。

關(guān)鍵詞：豬偽狂犬病毒；豬圓環(huán)病毒；混合感染；診治

豬偽狂犬病（porcine pseu-dorabies PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的豬和其他動物共患的一種急性傳染病，斷奶前后的仔豬發(fā)病表現(xiàn)為呼吸困難、咳嗽、流鼻涕、有的嘔吐、腹瀉，部分病豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。發(fā)病率為20%～40%，死亡率為30%左右。由于豬偽狂犬活疫苗的廣泛使用，在2011年以前，該病在豬群中已經(jīng)得到較好的控制，發(fā)病率很低。然而從2011年開始，華北、華中、華東及東北等部分地區(qū)的豬場先后發(fā)生豬偽狂犬病流行。

這次的流行的豬偽狂犬病臨床癥狀在仔豬中主要表現(xiàn)為高熱、食欲廢絕、呼吸困難、震顫及流涎等癥狀，后期神經(jīng)癥狀更明顯，死亡率哺乳仔豬可達(dá)95%，保育豬20%～30%。上述臨床癥狀與2011年以前的豬偽狂犬病臨床癥狀相似，但發(fā)病更急，發(fā)病率和死亡率更高，且常規(guī)免疫了豬偽狂犬疫苗的豬場也發(fā)病。包括哈爾濱獸醫(yī)研究所，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院等多家科研機構(gòu)已經(jīng)證實目前流行的豬偽狂犬病毒為新變異株，且Chaoye等采用高通量測序的方法及進(jìn)化樹分析表明目前中國新流行PRV毒株屬于基因Ⅱ型，而其他PRV毒株（如歐美分離株）屬于基因Ⅰ型，這一發(fā)現(xiàn)也解釋了為什么常規(guī)免疫Bartha疫苗（Ⅰ型）的豬場仍然大規(guī)模暴發(fā)豬偽狂犬病的原因。在針對新型偽狂犬的疫苗上市之前，如何防控新型偽狂犬病顯得尤為重要。2014年底，江蘇一常規(guī)免疫了豬偽狂犬疫苗豬場暴發(fā)新型豬偽狂犬病，現(xiàn)將診治情況報告如下：

1 發(fā)病情況及臨床癥狀

發(fā)病豬群來源于江蘇某豬場，1000頭基礎(chǔ)母豬，自2014年11月2015年1月期間，保育豬群出現(xiàn)了高燒（均在40℃以上）、流涎、共濟失調(diào)、食欲廢絕等臨床癥狀，后期出現(xiàn)了角弓反張、側(cè)臥劃水、癲癇等表現(xiàn)，發(fā)病率65%左右，死亡率約73%，發(fā)病豬群在轉(zhuǎn)往生長育肥舍后1月內(nèi)的死亡率仍高達(dá)到4.5%。

2 剖檢變化及顯微變化

選取病死豬剖檢，其主要剖檢變化為：肝臟彌散性白色壞死點（圖1AP84），脾臟少量紅色梗死點，扁桃體有潰瘍呈現(xiàn)（圖1BP84），肺臟背部有少量針尖狀出血點，腦部水腫。摘取病變組織臟器，中性福爾馬林固定，制作石蠟切片，HE染色觀察顯微變化，主要病理變化有：扁桃體炎性細(xì)胞嚴(yán)重缺失（圖2AP84）；腦部呈現(xiàn)包括衛(wèi)星現(xiàn)象，噬神經(jīng)元現(xiàn)象在內(nèi)的典型非化膿性腦炎組織病變（圖2BP84）；肝細(xì)胞變性，著色不均，竇狀隙增寬，充血，炎性細(xì)胞浸潤（圖2CP84）；肺臟間質(zhì)增寬（圖2DP84）。

3 病原檢測

選取發(fā)病豬的肺臟，大腦皮質(zhì)層，腹股溝淋巴結(jié)混合勻漿，采用天凈沙系列柱式動物DNAOUT提取試劑盒按說明書提取DNA以及柱式動物RNAOUT提取試劑盒按說明書提取RNA。所提取的DNA進(jìn)行豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒及豬鏈球菌PCR檢測。所提取RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PRRSV和CSFV的PCR檢測。采用25μL反應(yīng)體系（10×PCR Buffer：2.5μL；MgCl₂：2μL；dNTP：2μL；上下游引物：各0.2μL；TaqDNA聚合酶：0.2μL；模板DNA：1μL；ddH20：16.9μL）按表1參數(shù)進(jìn)行PCR擴增。擴增完后1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

檢測結(jié)果：1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果顯示只有豬偽狂犬野毒PRV gE在188處和豬圓環(huán)病毒2型PCV2在處有明顯條帶（見圖4），豬藍(lán)耳病病毒，豬瘟病毒，豬鏈球菌均為陰性。

4 控制措施及療效

根據(jù)檢測結(jié)果，判斷為豬偽狂犬感染，制定以下治療方案：①淘汰弱小發(fā)病豬；②疫苗免疫：Bartha-K61gE缺失苗：保育和生長豬緊急免疫，肌肉注射1頭份/頭，間隔1個月加強免疫一次，產(chǎn)房現(xiàn)有哺乳仔豬在21日齡斷奶時肌肉注射免疫1頭份（包括已達(dá)到21日齡但還未轉(zhuǎn)群的仔豬，該豬場21日齡斷奶，28日齡轉(zhuǎn)保育）；③修改原有豬偽狂犬常規(guī)免疫程序為：經(jīng)產(chǎn)母豬和公豬：每年普免4次，每3月1次；育肥豬：1～2日齡，滴鼻1頭份/頭，分兩個鼻孔滴鼻，56日齡肌肉注射1頭份/頭，100～110日齡肌肉注射1頭份/頭；④預(yù)防繼發(fā)感染：發(fā)病豬群拌料10%替米考星1kg/t+黃芪多糖1kg/t+磺胺間甲氧嘧啶鈉1kg/t+電解多維1kg/t；⑤消毒：酚類消毒劑每周帶豬消毒兩次，轉(zhuǎn)群或出欄后2%的氫氧化鈉對豬舍墻面、地面、過道及飼養(yǎng)設(shè)備等進(jìn)行徹底消毒，干燥。轉(zhuǎn)歸：緊急免疫一周后，保育豬和生長豬新發(fā)病豬數(shù)量顯著下降，原發(fā)病豬死亡率顯著降低，新轉(zhuǎn)入保育的仔豬未見發(fā)??；1月后疫情全部控制。

5 討論與小結(jié)

近年來，生豬疫病均以多病原混合感染或繼發(fā)感染為主要流行形式，在復(fù)雜疫病背景下的準(zhǔn)確快速診斷是控制生豬疫病的主要瓶頸。更深層次說，準(zhǔn)確區(qū)分原發(fā)病原和繼發(fā)病原，主要致病病原及次要病原是精確準(zhǔn)斷的前提。在本案例中，根據(jù)臨床癥狀及剖檢變化，鎖定了包括鏈球菌，豬偽狂犬病毒，豬呼吸與繁殖綜合征病毒，豬圓環(huán)病毒在內(nèi)的幾種病原，進(jìn)一步通過病原檢測確定感染病原為豬偽狂犬病毒和豬圓環(huán)病毒2型感染。但上述兩種病原哪種才是主要致病病原仍不能明確，這就需要借助病理學(xué)分析，組織學(xué)觀察顯示該病例有扁桃體壞死非化膿性腦炎，肝臟壞死，間質(zhì)性肺等主要病變，符合豬偽狂犬病主要病理變化，與豬圓環(huán)病毒感染主要病理變化有一定的差異（圓環(huán)病毒2型的主要病理變化為淋巴組織及肺臟間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞大量缺失，巨噬細(xì)胞浸潤），所以確定該病例是以豬偽狂犬病毒為主要致病病源，圓環(huán)病毒2型為次要病原的混合感染，在防治措施的制定中，要以防治豬偽狂犬病為主。

本案例同樣也是在常規(guī)免疫了豬偽狂犬疫苗的情況下出現(xiàn)的。通過剖檢變化和組織學(xué)檢測，與新型偽狂犬的病理變化相似，實驗室檢測結(jié)果為豬圓環(huán)病毒2型及株偽狂犬病毒為陽性。由于豬場常規(guī)免疫了勃林格的圓環(huán)疫苗，所以，筆者認(rèn)為雖然PCR檢測出了PCV2病原，但引起該疫情的主要因素仍然是豬偽狂犬病毒。

目前流行的豬偽狂犬毒株是由于抗原變異而致傳統(tǒng)疫苗的保護(hù)率有所下降或毒力增強兼抗原變異，致使常規(guī)免疫豬偽狂犬活疫苗的豬場依然易發(fā)偽狂犬病。研究顯示雖然使用現(xiàn)有疫苗不能完全保護(hù)流行毒株的感染，但是增加疫苗免疫次數(shù)（每年普免4次）與劑量（為3頭份），仍然可以使豬只獲得免疫保護(hù)，不出現(xiàn)偽狂犬病臨床癥狀。解偉濤等也研究了不同免疫策略對豬偽狂犬病防控效果的差異，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)疫苗增加免疫劑量和免疫次數(shù)，仍然可以有效防控新流行的PRV野毒。在本案例中，已明確豬偽狂犬病毒為主要致病病原，所以針對豬偽狂犬制定的新免疫程序，達(dá)到了良好的免疫效果，很快控制了疫情，進(jìn)一步證實了現(xiàn)有疫苗對新型豬偽狂犬病毒的免疫保護(hù)力。由于圓環(huán)病毒確定為次要病原，且豬場已經(jīng)常規(guī)免疫了勃林格的圓環(huán)苗，所以未針對圓環(huán)病毒調(diào)整免疫方案，但由于上述兩種病原均為免疫抑制性疾病，容易造成其他細(xì)菌的繼發(fā)感染，故針對該階段豬易感染的副豬嗜血桿菌，鏈球菌，放線桿菌，巴氏桿菌等制定了抗生素給藥方案，達(dá)到了良好的預(yù)防效果。

總結(jié)：在豬偽狂犬病毒為主要致病病原的混合感染中，偽狂犬疫苗免疫尤為重要，然而疫苗免疫并不能清除病毒，豬一旦感染偽狂犬病病毒便終生帶毒。所以，對豬場豬偽狂犬的監(jiān)測同樣重要。建議，每季度檢測1次免疫抗體，每半年檢測1次PRV gE抗體。采血檢查的比例根據(jù)群體大小而定，一般大于300頭基礎(chǔ)母豬的豬場不少于10%，低于300頭母豬的豬場絕對數(shù)量不低于30份。檢測出抗體水平合格，gEELISA鑒別診斷為陰性的定為健康豬群；抗體水平不合格，gE-ELISA鑒別診斷為陰性的豬只，應(yīng)立即補注疫苗；gE-EusA鑒別診斷為陽性者及隱性感染帶毒者，一律淘汰處理，不能當(dāng)做種豬飼養(yǎng)。

（編輯：狄慧）