賀仕清 鄒云龍 雷北平

·基礎(chǔ)研究·

高壓氧對(duì)腦外傷大鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸水平的影響

賀仕清1鄒云龍1雷北平2

目的研究高壓氧對(duì)腦外傷大鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸水平的影響。方法通過制作大鼠腦外傷模型，設(shè)計(jì)隨機(jī)實(shí)驗(yàn)分組：模型對(duì)照組、高氣壓組、高濃度氧組和高壓氧組給予腦外傷大鼠治療；同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。分別于第3天、第6天、第9天取大鼠全腦測(cè)量谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）的含量。結(jié)果大鼠腦損傷后腦組織中Glu、Asp含量明顯升高，高壓氧可明顯下調(diào)Glu、Asp含量，與模型對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而高氣壓組、高濃度氧組不能明顯抑制Glu、Asp表達(dá)，與模型對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論高壓氧可以顯著抑制腦外傷大鼠腦組織中興奮性氨基酸釋放從而減輕腦外傷后繼發(fā)性腦損害，而高氣壓、高濃度氧不能明顯抑制興奮性氨基酸的釋放。

腦損傷；興奮性氨基酸；高壓氧治療

腦外傷是臨床常見急癥之一。腦外傷后有關(guān)腦組織繼發(fā)性損害的機(jī)制存在多種學(xué)說[1]：其中興奮性氨基酸（excitatory amino acids，EAA）的毒性作用是腦外傷繼發(fā)性腦損傷重要的致傷機(jī)制之一[2]；EAA主要是谷氨酸（glutamic acid，Glu）和天冬氨酸（aspartic acid，Asp）。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）治療腦缺血進(jìn)行了廣泛的研究，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多數(shù)顯示HBO有一定療效，但對(duì)其作用的機(jī)制尚不清楚[3]。本研究探討HBO在治療腦外傷大鼠中對(duì)抗興奮性氨基酸的興奮性神經(jīng)毒性和改善預(yù)后方面的作用，為HBO在臨床治療腦外傷的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wister大鼠98只，體質(zhì)量280 g左右，SD大鼠購(gòu)買于武漢大學(xué)動(dòng)物部。隨機(jī)設(shè)空白對(duì)照組動(dòng)物18只與模型對(duì)照組對(duì)照。

二、模型動(dòng)物

用5%水化氯醛腹腔注射麻醉 （300 mg/kg體重），用BIM-Ⅲ型撞擊機(jī)撞擊頭部（頭部固定），重量800 g，高度30 cm，制作重型腦外傷動(dòng)物模型。

三、實(shí)驗(yàn)分組

取存活動(dòng)物90只，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分組設(shè)空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、高氣壓組、高濃度氧組和高壓氧組，每組18只。各組標(biāo)記。

四、分組處理

高壓氧組大鼠置于高壓氧艙內(nèi)1次/d，純氧洗艙5 min，升壓10 min至0.1 MPa（2 ATA）后穩(wěn)壓，吸純氧60 min，穩(wěn)壓時(shí)保證艙內(nèi)氧濃度為（85±5）%，減壓10 min出艙，總時(shí)間為85 min。高氣壓組大鼠置于高壓氧艙內(nèi)1次/d，空氣洗艙5 min，氮?dú)馍龎海ú桓淖兣搩?nèi)氧分壓）10 min至0.1 MPa（2 ATA）后空氣穩(wěn)壓60 min，減壓10 min出艙。高濃度氧組大鼠置于高壓氧艙內(nèi)1次/d，不升壓，純氧洗艙85 min。模型對(duì)照組大鼠制作腦外傷模型后不再做處理?？瞻讓?duì)照組不做處理，與模型對(duì)照組對(duì)照。

分別于第3天、第6天和第9天在各組中隨機(jī)斷頭處死每組6只大鼠，取腦組織稱重后，按20 mg/ml加入5%三氯醋酸，在冰浴下用玻璃組織勻漿機(jī)勻漿10 min，在0～4℃下以15 000 r/min離心15 min，去除蛋白，取上清液-20℃保存，待測(cè)。

五、高效液相色譜儀檢測(cè)興奮性氨基酸含量

40 μl氨基酸樣品加入100 μl氟化乙醛反應(yīng)液振蕩15 s后25℃放置反應(yīng)2 min，進(jìn)樣20 μl，采用線性梯度洗脫，結(jié)果用色譜工作站處理 （外標(biāo)法定量：先將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行色譜分析，求得含量與色譜峰面積或峰高的關(guān)系，并將此關(guān)系繪制成定量校準(zhǔn)曲線，然后將樣品進(jìn)行色譜分析，根據(jù)其對(duì)應(yīng)的峰面積或峰高求出樣品中的組分含量）。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、隨機(jī)分組的SD大鼠體重

五組SD大鼠的平均體重進(jìn)行了單因素方差分析，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析五組大鼠平均體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 五組SD大鼠平均體重比較（±s）

表1 五組SD大鼠平均體重比較（±s）

F=2.709，P=0.086

組別 例數(shù) 平均體重（g）空白對(duì)照組 18 273±4.09模型對(duì)照組 18 278±5.16高氣壓組 18 272±5.24高濃度氧組 18 266±4.63高壓氧組 18 270±3.98 F值 2.709 P值 ＞0.05

二、EAA在腦外傷大鼠腦內(nèi)的表達(dá)

本研究用Glu和Asp結(jié)果作為興奮性氨基酸的代表。分別于第3天、第6天和第9天時(shí)在各組中隨機(jī)斷頭處死6只SD大鼠?？瞻讓?duì)照組、模型對(duì)照組、高氣壓組、高濃度氧組和高壓氧組組大鼠腦中EAA含量如表2～4所示。結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較（第3天、第6天、第9天），大鼠腦損傷后其腦組織中Glu和Asp含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較（第3天、第6天、第9天），經(jīng)高氣壓、高濃度氧處理后氨基酸含量均有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），經(jīng)高壓氧處理后顯著性下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2、表3、表4）。

表2 腦外傷SD大鼠第3天腦內(nèi)谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

表2 腦外傷SD大鼠第3天腦內(nèi)谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

與空白對(duì)照組比較：cP＜0.05、eP＜0.05、gP＜0.05、iP＜0.05、dP＜0.05、fP＜0.05、hP＜0.05、jP＜0.05；與模型對(duì)照組比較：eP＞0.05、gP＞0.05、fP＞0.05、hP＞0.05，而iP＜0.05、jP＜0.05；與高氣壓組比較：gP＞0.05、hP＞0.05，而iP＜0.05、jP＜0.05；與高濃度氧組比較：iP＜0.05、jP＜0.05

興奮性氨基酸水平谷氨酸 天冬氨酸空白對(duì)照組 6 3 2.65±0.29a 1.05±1.02b模型對(duì)照組 6 3 13.72±2.27c 5.15±1.54d高氣壓組 6 3 12.34±1.95e 5.01±1.77f高濃度氧組 6 3 12.56±2.51g 4.98±1.82h高壓氧組 6 3 4.43±1.53i 2.03±1.05jF值 45.48 10.44 P值 ＜0.01 ＜0.01實(shí)驗(yàn)分組 標(biāo)本例數(shù)處理時(shí)間（d）

表3 腦外傷SD大鼠第6天腦內(nèi)谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

表3 腦外傷SD大鼠第6天腦內(nèi)谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

與空白對(duì)照組比較：mP＜0.05、oP＜0.05、qP＜0.05、sP＜0.05、nP＜0.05、pP＜0.05、rP＜0.05、tP＜0.05；與模型對(duì)照組比較：oP＞0.05、qP＞0.05、pP＞0.05、rP＞0.05，而sP＜0.05、tP＜0.05；與高氣壓組比較：qP＞0.05、rP＞0.05，而sP＜0.05、tP＜0.05；與高濃度氧組比較：sP＜0.05、tP＜0.05

興奮性氨基酸水平谷氨酸 天冬氨酸空白對(duì)照組 6 6 2.95±0.47k 1.54±1.38l模型對(duì)照組 6 6 14.28±2.67m 5.63±1.07n高氣壓組 6 6 13.94±2.56o 5.81±1.49p高濃度氧組 6 6 13.55±1.63q 5.43±1.99r高壓氧組 6 6 4.72±1.21s 2.74±1.67tF值 51.58 9.58 P值 ＜0.01 ＜0.01實(shí)驗(yàn)分組 標(biāo)本例數(shù)處理時(shí)間（d）

表4 腦外傷SD大鼠第9天腦內(nèi)谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

表4 腦外傷SD大鼠第9天腦內(nèi)谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

與空白對(duì)照組比較：wP＜0.05、yP＜0.05、#P＜0.05、*P＜0.05、xP＜0.05、zP＜0.05、$P＜0.05、**P＜0.05；與模型對(duì)照組比較：yP＞0.05、#P＞0.05、ZP＞0.05、SP＞0.05，而*P＜0.05、**P＜0.05；與高氣壓組比較：#P＞0.05、$P＞0.05，而*P＜0.05、**P＜0.05；與高濃度氧組比較：*P＜0.05、**P＜0.05

興奮性氨基酸水平谷氨酸 天冬氨酸空白對(duì)照組 6 9 3.17±0.82u 2.25±1.92v模型對(duì)照組 6 9 15.33±1.86w 1.37±1.98x高氣壓組 6 9 14.25±2.71y 7.31±1.64z高濃度氧組 6 9 13.55±2.03# 5.69±1.86$高壓氧組 6 9 4.84±1.95* 2.44±1.81**F值 51.07 11.47 P值 ＜0.01 ＜0.01實(shí)驗(yàn)分組 標(biāo)本例數(shù)處理時(shí)間（d）

討論

腦外傷是臨床常見急癥之一。腦外傷后有關(guān)腦組織繼發(fā)性損害的機(jī)制，也存在很多說法[1]：（1）EAA的毒性作用；（2）代謝過程的改變（包括高能量代謝、高分解代謝、糖耐受性降低等）；（3）單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的改變（去甲腎上腺素、多巴胺及5-羫色胺等）；（4）神經(jīng)肽的改變(神經(jīng)降壓素及生長(zhǎng)抑素等）；（5）內(nèi)環(huán)境水、電解質(zhì)的改變（Ca2+超載）[4]；（6）氧自由基等。其中EAA是腦外傷繼發(fā)性腦損傷重要的致傷機(jī)制之一[2]。

從表2～4可以看出EAA（Glu、Asp）在大鼠正常腦組織中低表達(dá)，但在腦外傷后腦組織中明顯高表達(dá)，隨著受傷時(shí)間的延長(zhǎng)EAA較受傷第3天、第6天高呈稍高表達(dá)；經(jīng)高氣壓、高濃度氧處理后第3天、第6天、第9天較模型對(duì)照組比較，EEA表達(dá)有所降低，但高氣壓組、高濃度氧組與模型對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)高壓氧處理后第3天、第6天、第9天與空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、高氣壓組、高濃度氧組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高壓氧能有效抑制腦外傷大鼠腦內(nèi)EEA在釋放；高壓氧組與空白對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)不能完全抑制EEA達(dá)到正常腦組內(nèi)EEA的水平；研究已經(jīng)證明：腦外傷后腦缺血、氧氧和糖源供應(yīng)不足，腺苷三磷酸生成減少，誘導(dǎo)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞去極化，使突觸前膜電壓依賴性Ca2+通道開放，Glu大量釋放到突觸間隙；另外突觸前膜由于能量缺乏，對(duì)Glu的重?cái)z取受到抑制，進(jìn)一步增加了細(xì)胞外Glu的堆積。大量的Glu激活突觸后膜N-甲基-D-天冬氨酸受體，引起Ca2+大量?jī)?nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，并啟動(dòng)一系列神經(jīng)細(xì)胞損傷的病理反應(yīng)，如激活Ca2+依賴性蛋白溶解酶、核酸內(nèi)切酶、磷脂酶、一氧化氮合酶等。其中激活的蛋白溶解酶能降解細(xì)胞骨架；激活的磷脂酶A2和環(huán)氧合酶可催化產(chǎn)生氧自由基，引起炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡；激活的一氧化氮合酶催化產(chǎn)生過量的一氧化氮，能與超氧陰離子形成過氧亞硝酸根離子和輕自由基，損傷線粒體膜，使線粒體形成漏洞，開放線粒體轉(zhuǎn)換孔，致使離子平衡紊亂[5]；大量的Glu激活代謝型Glu受體，從而激活了與Ca2+蛋白相偶聯(lián)的磷脂酞肌醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞通透性發(fā)生改變，使大量的Na+和C1-進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，水被動(dòng)進(jìn)入胞內(nèi)引起細(xì)胞腫脹，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死和凋亡[6]。因此，在腦損傷的過程中EAA的神經(jīng)毒性作用既是損傷腦組織的啟動(dòng)者又是執(zhí)行者[7]。

通過研究已證實(shí)的EAA興奮性神經(jīng)毒性機(jī)制與目前高壓氧治療腦外傷的作用機(jī)制，高壓氧抑制EAA釋放改善神經(jīng)功能及愈后的機(jī)理推測(cè)如下：（1）高壓氧可以提高血氧含量及氧分壓，使血氧彌散能力增強(qiáng)，改善缺血部位周圍組織氧的供給[8]，可抑制突觸前膜電壓依賴性Ca2+通道過度開放，從而抑制Glu大量釋放到突觸間隙；另外，改善突觸前膜能量缺乏，可改善Glu的重?cái)z取，進(jìn)一步減輕細(xì)胞外Glu的堆積；最終挽救半暗帶區(qū)的細(xì)胞，對(duì)缺血腦組織起到極大保護(hù)作用，最終降低死亡率和致殘率。（2）高壓氧抑制大量的Glu釋放，因此未能激活代謝型Glu受體，從而抑制與Ca2+蛋白相偶聯(lián)的磷脂酞肌醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終穩(wěn)定細(xì)胞通透性，使大量的Na+和C1-未能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，緩解細(xì)胞腫脹，最終減輕細(xì)胞壞死和凋亡。此外，高壓氧有a-腎上腺素樣的作用，可使腦血管收縮，腦血流量減少，阻斷腦缺氧、腦水腫的惡性循環(huán)，從而降低顱內(nèi)壓，減輕腦水腫[9]。高壓氧可促進(jìn)血管再生和側(cè)枝循環(huán)的建立，改善局部循環(huán)，減輕局部腦水腫；降低血液粘滯度，抑制血栓形成，從而改善腦的微循環(huán)和血液灌注[10]；減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[11]，提高腦組織清除氧自由基的能力，降低細(xì)胞免受損害[12]。由此聯(lián)系臨床：早期應(yīng)用高壓氧對(duì)顱腦損傷具有明顯療效；重癥顱腦損傷昏迷患者的最佳治療時(shí)機(jī)是創(chuàng)傷后7～30 d[13]；應(yīng)嚴(yán)格掌握人艙治療指征，適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段給予適量的高壓氧治療，否則容易產(chǎn)生高壓氧中毒[14]。治療過程中監(jiān)測(cè)顱內(nèi)壓、腦灌注壓、腦血流量、腦組織氧分壓和腦溫等[15]。本研證實(shí)高壓氧能有效抑制EAA的釋放，從而減輕EAA的神經(jīng)興奮性毒性作用對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷；高氣壓、高濃度氧不能有效抑制EAA的釋放。高壓氧能有效抑制EAA的釋放的確切分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of hyperbaric oxygen on the level of excitatory amino acids in the brain of rats with brain injury

He Shiqing1,Zou Yunlong1,Lei Beiping2.1Department of Neurosurgery,Affiliated Nanhua Hospital of South China,Hengyang 421002,China;2Department of Neurosurgery,169 General Hospital of Chinese PLA,Hengyang 421002,China

Zou Yunlong,Email:13973422100@139.com

ObjectiveTo study the effect of hyperbaric oxygen on the level of excitatory amino acids in the brain of rats with brain injury.MethodsBy making the models of traumatic brain injury in rats and design randomized experimental group:model control group,high pressure group,high concentration oxygen group and hyperbaric oxygen group were treated with brain injury rats.The contents of glutamic acid（Glu)and aspartate（Asp)were measured in rats at third days,sixth days and ninth days respectively.The contents of glutamic acid（Glu)and aspartate（Asp)were measured in rats at third days,sixth days and ninth days respectively.ResultsThe content of Glu and ASP in the brain tissue of rats with brain injury increased significantly and hyperbaric oxygen can be significantly reduced content of Glu and ASP.Compared with model control group,there were significant differences（P＜0.05).The high pressure group and high concentration oxygen group could not significantly inhibit the expression of Glu and Asp.Compared with the model group had no significant difference（P＞0.05).ConclusionHyperbaric oxygen can significantly inhibit the release of excitatory amino acids in brain tissue of rats with traumatic brain injury and reduce the secondary brain damage after traumatic brain injury,while high pressure,high concentration of oxygen can not significantly inhibit the release of EAA.

Cerebral injury;Excitatory amino acids；Hyperbaric oxygen therapy

2016-04-30）

（本文編輯：張麗）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2016.05.007

湖南省衛(wèi)生廳一般項(xiàng)目（B2010-056)

421002 衡陽(yáng)，南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院神經(jīng)外科1；421002 衡陽(yáng)，中國(guó)人民解放軍第一六九總醫(yī)院高壓氧科2

鄒云龍，Email：13973422100@139.com

賀仕清,鄒云龍,雷北平.高壓氧對(duì)腦外傷大鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸水平的影響[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2016,2(5): 289-292.