鄭志忠,諶　迪,劉韶松,明艷林

(1.華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361021；

2.廈門華僑亞熱帶植物引種園 藥用植物與植物藥研發(fā)中心，福建 廈門 361002)

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非洲加納籽乙醇提取物的生物活性研究

鄭志忠1,2,諶迪2,劉韶松2,明艷林1,2

(1.華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361021；

2.廈門華僑亞熱帶植物引種園 藥用植物與植物藥研發(fā)中心，福建 廈門 361002)

摘要：采用MTT法研究了非洲加納籽乙醇提取物的抗肝癌活性，并研究了其對(duì)DPPH自由基的清除能力。結(jié)果表明，加納籽95%乙醇提取物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721和Bel7402具有較好的抑制活性，IC50值分別為(124.05±11.35) μg·mL-1和(157.05±3.94) μg·mL-1；不同濃度乙醇提取的加納籽乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力均明顯強(qiáng)于Vc。該研究可為非洲加納籽的生物活性研究及生物活性成分的分離提供參考。

關(guān)鍵詞：非洲加納籽；乙醇提取物；生物活性；DPPH自由基

非洲加納籽(Griffonia simplicifoliaBaill.)，屬于豆科、云實(shí)亞科、加納籽屬的灌木植物，原產(chǎn)于加納、象牙海岸、科特迪瓦和多哥等西非國家[1-2]。在西非地區(qū)，加納籽有著悠久的民間藥用史。其葉和葉汁可分別用來治療外傷及與膀胱和腎臟相關(guān)的疾??；此外，加納籽還可以用來治療腹瀉、嘔吐、胃痛；而最廣為人知的則是其抗菌和激發(fā)性欲的特性[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，加納籽的主要活性成分是5-羥基色氨酸(5-hydroxytryptophan，5-HTP)。5-HTP是一種氨基酸類物質(zhì)，也是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)的前體物質(zhì)，能提高腦部5-HT濃度、抑制憂郁、促進(jìn)褪黑素合成、改善睡眠質(zhì)量等。然而5-HTP的分布范圍窄，目前發(fā)現(xiàn)僅在加納籽中有大量存在。鑒于5-HTP的良好活性，近年來，5-HTP在美國、英國和加拿大被當(dāng)作膳食補(bǔ)充劑銷售；我國對(duì)此類藥物的需求量也在不斷增加。由于非洲加納籽資源有限，加之大量的采集和物流成本的不斷增加，致使5-HTP的生產(chǎn)成本居高不下。為了更好地可持續(xù)利用這一植物種質(zhì)資源，在我國熱帶和南亞熱帶地區(qū)引種馴化這一物種就顯得尤為重要。

作者在此以加納籽為原料，研究了加納籽乙醇提取物的抗肝癌和清除DPPH自由基的活性，以期為后續(xù)分離純化加納籽中的活性成分奠定基礎(chǔ)。

1實(shí)驗(yàn)

1.1　試劑與儀器

加納籽、5-HTP，天醫(yī)堂(廈門)生物工程有限公司；肝癌細(xì)胞SMMC7721、Bel7402，中國科學(xué)院細(xì)胞庫；二苯基苦基苯肼(DPPH)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)，Sigma公司；DMEM、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，Gibco公司；新生牛血清，HyClone公司；青霉素鈉、鏈霉素鈉，Sangon公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

N-1200BV-WD型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA；UV-2802H型紫外可見分光光度計(jì)，Unico；超純水機(jī)，Pallcorporation；MODULYOD-230型冷凍干燥機(jī)、MULTISKANMK3型酶標(biāo)儀，Thermo。

1.2　方法

1.2.1加納籽乙醇提取物的制備及TLC分析

分別稱取4份300g加納籽粉末于三角瓶中，依次加入5倍量25%、50%、75%、95%乙醇溶劑，50 ℃下水浴浸提12h，抽濾，濃縮提取液，獲得加納籽乙醇提取物。

取50g加納籽用15倍量蒸餾水于80 ℃下浸提2h，共提取2次，提取液經(jīng)抽濾濃縮至40mL(生藥量為1.25g·mL-1)后用4倍量無水乙醇攪拌均勻，靜置4h后，1 500×g離心2次，棄去沉淀，上清液濃縮至干得樣品1。將殘?jiān)?倍量95%乙醇于60 ℃浸提24h后, 經(jīng)抽濾濃縮至干得樣品2。

取50g加納籽直接用4倍量95%乙醇于60 ℃浸提24h后, 經(jīng)抽濾濃縮至干得樣品3。

取樣品1、2、3用適量甲醇溶解后，分別以石油醚∶乙酸乙酯=2∶1、正丁醇∶水∶乙酸=12∶5∶3為展開劑、碘熏為顯示劑進(jìn)行TLC分析。

1.2.2MTT法測(cè)定加納籽乙醇提取物的抗肝癌活性

取對(duì)數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞SMMC7721和Bel7402，經(jīng)0.25%的胰酶消化，配制成5×104個(gè)·mL-1的單細(xì)胞懸液，每孔100 μL(空白組不接種細(xì)胞)接種于96孔板；37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24h后，分別用180 μL的對(duì)照組培養(yǎng)液和含不同濃度(6.25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1、25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1)的加納籽乙醇提取物的樣品組培養(yǎng)液替換，每組重復(fù)3次；培養(yǎng)72h后，每孔加入20 μL0.5mg·mL-1的MTT；再培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)基，加入150 μLDMSO溶液振蕩10min后，測(cè)定492nm處的吸光度(A)，并按式(1)計(jì)算細(xì)胞抑制率。

(1)

1.2.3DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[4-7]的方法，將樣品用DMSO溶液配制成不同濃度(0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1、10 mg·mL-1、20 mg·mL-1、40 mg·mL-1)溶液，備用。另配制pH值5.6的0.1 mol·L-1醋酸緩沖液和3 mmol·L-1的DPPH乙醇溶液，避光保存。將紫外可見分光光度計(jì)用醋酸緩沖液調(diào)零，取1.0 mL醋酸緩沖液、1.8 mL無水乙醇溶液及0.1 mL DPPH乙醇溶液混勻，再加入0.1 mL樣品液(空白組添加0.1 mL的DMSO溶液)混勻，30 ℃下避光保存20 min后，測(cè)定517 nm處吸光度(A)，重復(fù)3次，按式(2)計(jì)算自由基清除率。

(2)

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果與討論

2.1　加納籽乙醇提取物的化學(xué)成分分析

以曬干的加納籽為原料，分別用25%、50%、75%、95%乙醇溶劑提取，提取液濃縮至干，收率依次為2.05%、20.51%、6.26%、3.15%。從收率來看，50%乙醇提取物最高，25%乙醇提取物最少。加納籽乙醇提取物的TLC如圖1所示。

由圖1可知，5-HTP、樣品1~3用小極性展開劑展開后發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分較少(圖1a)；而用較大極性展開劑展開后發(fā)現(xiàn)其主要化學(xué)成分為5-HTP，其它成分較少(圖1b)。

2.2　加納籽乙醇提取物的抗肝癌活性

采用MTT法測(cè)定不同濃度的加納籽乙醇提取物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721和Bel7402的體外抑制效果，結(jié)果見表1。

由表1可知，95%乙醇提取物對(duì)SMMC7721和Bel7402均有較好的抑制作用，對(duì)肝癌細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為(124.05±11.35)μg·mL-1和(157.05±3.94)μg·mL-1，明顯好于5-HTP，而其它提取物抑制效果均不明顯。該結(jié)果表明，加納籽95%乙醇提取物中可能存在其它對(duì)肝癌細(xì)胞有較高抑制率的化學(xué)成分，也可能是其它化學(xué)成分對(duì)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生了協(xié)同抑制效應(yīng)。

1~4.5-HTP、樣品1、樣品2、樣品3

Fig.1 TLC Analysis of ethanol extracts from

GriffoniasimplicifoliaBaill.

表1加納籽乙醇提取物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721

和Bel7402的IC50

Tab.1IC50of ethanol extracts fromGriffoniasimplicifolia

Baill. on hepatoma cell SMMC7721 and Bel7402

2.3　加納籽乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力(表2)

表2加納籽乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

Tab.2　DPPH Free radical scavenging capacity of

由表2可知，加納籽25%、50%、75%、95%乙醇提取物、5-HTP及陽性對(duì)照Vc對(duì)DPPH自由基均有較好的清除能力，IC50分別為(0.18±0.14) mg·mL-1、(0.35±0.15) mg·mL-1、(0.28±0.07) mg·mL-1、(0.15±0.07) mg·mL-1、(6.06±2.37) mg·mL-1、(0.53±0.30) mg·mL-1，加納籽乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力比陽性對(duì)照Vc要強(qiáng)，說明加納籽中存在自由基清除能力強(qiáng)的化學(xué)成分。雖有文獻(xiàn)[8]報(bào)道5-HTP具有一定的抗氧化性，但在本實(shí)驗(yàn)中其對(duì)DPPH自由基清除能力并不明顯，可見加納籽中存在其它對(duì)DPPH自由基有較高清除能力的化學(xué)成分，有待進(jìn)一步研究。

3結(jié)論

以非洲加納籽為原料，通過MTT法研究了其乙醇提取物的抗肝癌活性及對(duì)DPPH自由基的清除能力。結(jié)果表明，加納籽95%乙醇提取物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721和Bel7402具有較好的抑制活性，IC50值分別為(124.05±11.35) μg·mL-1和(157.05±3.94) μg·mL-1；不同濃度乙醇提取的加納籽乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力均明顯強(qiáng)于Vc。該研究可為非洲加納籽的生物活性研究及生物活性成分的分離提供參考。

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Bioactivity of Ethanol Extracts fromGriffoniaSimplicifoliaBaill.

ZHENG Zhi-zhong1,2,CHEN Di2,LIU Shao-song2,MING Yan-lin1,2

(1.CollegeofChemicalEngineering,HuaqiaoUniversity,Xiamen361021,China;

2.TheResearchandDevelopmentCenterforMedicinalPlantsandPlantDrugs,

XiamenOverseasChineseSubtropicalPlantIntroductionGarden,Xiamen361002,China)

Abstract：The anti-hepatoma activities of different concentration of ethanol extracts from Griffonia simplicifolia Baill. were measured by MTT assay,and DPPH free radical scavenging capacity of ethanol extracts from Griffonia simplicifolia Baill. were studied as well.Results showed that 95% ethanol extract from Griffonia simplicifolia Baill. had good inhibitory activity on hepatoma cell SMMC7721 and Bel7402,with half-inhibition concentration(IC50) of (124.05±11.35) μg·mL-1and (157.05±3.94) μg·mL-1,respectively.This study may provide references for bioactivity research and bioactive ingredients separation of Griffonia simplicifolia Baill..

Keywords：Griffonia simplicifolia Baill.;ethanol extract;bioactivity;DPPH free radical

中圖分類號(hào)：R 284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)01-0033-03

通訊作者

作者簡介：鄭志忠(1984-)，男，福建莆田人，助理研究員，主要從事天然產(chǎn)物抗腫瘤活性研究；：明艷林，研究員，博導(dǎo)，E-mail：xmyanlin@gmail.com。

收稿日期：2015-07-31

基金項(xiàng)目：廈門市科技惠民計(jì)劃資助項(xiàng)目(3502Z20154083)

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.01.008