徐　蕓，沙喜陽(yáng)，吳　睿，黃士栩，楊文婷

(武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430065)

?

云南紅豆杉中紫杉烷類(lèi)化合物的提取工藝優(yōu)化

徐蕓，沙喜陽(yáng)，吳睿，黃士栩，楊文婷

(武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430065)

摘要：以云南紅豆杉樹(shù)皮為原料，采用纖維素酶法提取其中的紫杉烷類(lèi)化合物。以酶處理時(shí)間、酶用量、酶處理溫度、料液比為考察因素，以紫杉烷類(lèi)化合物得率為考核指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳工藝條件為：酶處理時(shí)間1.0 h、酶用量0.6%、酶處理溫度45 ℃、料液比1∶16(g∶mL)，在此條件下，紫杉烷類(lèi)化合物的得率為0.898%。該提取工藝操作簡(jiǎn)單，提取條件溫和、穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：云南紅豆杉；纖維素酶；紫杉烷類(lèi)化合物；正交實(shí)驗(yàn)

云南紅豆杉(Taxus yunnanensis)為紅豆杉科紅豆杉屬的常綠喬木，又名西南紅豆杉，是我國(guó)紅豆杉四大品種之一[1-3]，主產(chǎn)于云南西北部及西部、四川西南部與西藏東南部[4]。從該植株中可提取紫杉醇、10-脫乙?；涂ǘ、?10-DAB)等紫杉烷類(lèi)化合物。紫杉醇作為目前發(fā)現(xiàn)的最好的抗癌藥物之一，對(duì)多種晚期癌癥(如卵巢癌和乳腺癌等)有療效[5-7]。10-DAB具有紫杉烷類(lèi)化合物母核結(jié)構(gòu)，可以通過(guò)測(cè)定其含量考察紫杉烷類(lèi)化合物的得率。紅豆杉樹(shù)皮堅(jiān)硬，紫杉烷類(lèi)化合物的提取效率較低，不利于紅豆杉資源的充分利用。作者采用纖維素酶法對(duì)紅豆杉樹(shù)皮進(jìn)行處理，以提高其中紫杉烷類(lèi)化合物的提取效率；以10-DAB得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察酶處理時(shí)間、酶用量、酶處理溫度以及料液比對(duì)紫杉烷類(lèi)化合物得率的影響，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)提取工藝條件，擬為紅豆杉資源的充分利用提供參考[8-9]。

1實(shí)驗(yàn)

1.1　材料、試劑與儀器

云南紅豆杉樹(shù)皮，杭州民泰中藥飲片有限公司。

纖維素酶(活力大于30U·mg-1，進(jìn)口分裝)；10-DAB標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于95%)，紅豆集團(tuán)；無(wú)水乙醇(分析純)，天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司；檸檬酸(分析純)，天津凱通化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸鈉(分析純)，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；石油醚(分析純，沸程60~90 ℃)，天津百世化工有限公司。

752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；KQ-50E型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；TDZ5-WS型離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘麓離心機(jī)儀器有限公司；中藥材粉碎機(jī)，浙江瑞安春海藥材機(jī)械廠。

1.2　方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精確稱(chēng)取10mg10-DAB，甲醇溶解并定容于100mL容量瓶，得濃度為0.1mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL于6個(gè)10mL容量瓶中，定容后，227nm下測(cè)定其吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、濃度(c)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得線(xiàn)性回歸方程為A=33.375c-0.0317，R2=0.9994。

1.2.2紅豆杉樹(shù)皮中紫杉烷類(lèi)化合物得率的測(cè)定

取適量云南紅豆杉樹(shù)皮放入粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)30目篩。以料液比1∶3(g∶mL)用石油醚浸泡粉末12h，除去脂類(lèi)及部分脂溶性色素，然后于40 ℃下烘干除去溶劑，得云南紅豆杉樹(shù)皮粉末，陰涼處保存?zhèn)溆肹10]。精密稱(chēng)取一定量的紅豆杉樹(shù)皮粉末和纖維素酶，加入一定量的pH=5的檸檬酸緩沖溶液，置于一定溫度下保溫一定時(shí)間后，5 000r·min-1離心5min，去上清液，加入無(wú)水乙醇20mL超聲處理30min，5 000r·min-1離心5min，上清液用無(wú)水乙醇稀釋一定倍數(shù)，吸取適量的提取液，按1.2.1方法測(cè)定吸光度。根據(jù)下式計(jì)算紫杉烷類(lèi)化合物得率。

得率=[c×V×稀釋倍數(shù)/m]×100%

式中：c為提取液中紫杉烷類(lèi)化合物的濃度，mg·mL-1；V為提取液的體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)

1)酶處理時(shí)間對(duì)得率的影響

稱(chēng)取5份1.0g云南紅豆杉樹(shù)皮粉末，加入10mg纖維素酶和10mLpH=5的檸檬酸緩沖溶液，分別于40 ℃下保溫0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h，其它步驟同1.2.2。

2)酶處理溫度對(duì)得率的影響

稱(chēng)取5份1.0g云南紅豆杉樹(shù)皮粉末，加入10mg纖維素酶和10mLpH=5的檸檬酸緩沖溶液，分別于35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃下保溫1.0h，其它步驟同1.2.2。

3)酶用量對(duì)得率的影響

稱(chēng)取5份1.0 g云南紅豆杉樹(shù)皮粉末，分別加入0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的纖維素酶，再加入10 mL pH=5的檸檬酸緩沖溶液，40 ℃下保溫1.0 h，其它步驟同1.2.2。

4)料液比對(duì)得率的影響

稱(chēng)取5份1.0 g云南紅豆杉樹(shù)皮粉末，加入10 mg纖維素酶，分別按料液比(g∶mL，下同)1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16加入pH=5的檸檬酸緩沖溶液，40 ℃下保溫1.0 h，其它步驟同1.2.2。

1.2.4正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以酶處理時(shí)間、酶用量、酶處理溫度以及料液比為考察因素，以得率為考核指標(biāo)，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.1The factors and levels of orthogonal experiment

水平因素A.酶處理時(shí)間hB.酶用量%C.酶處理溫度℃D.料液比g∶mL11.00.6351∶1221.50.8401∶1432.01.0451∶16

2結(jié)果與討論

2.1　單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1酶處理時(shí)間對(duì)得率的影響(圖1)

圖1　酶處理時(shí)間對(duì)得率的影響

由圖1可知，當(dāng)其它條件一定時(shí)，1.0 h是纖維素酶對(duì)云南紅豆杉樹(shù)皮粉末作用的最佳時(shí)間，超過(guò)1.0 h后，溶液中紫杉烷類(lèi)化合物的得率開(kāi)始呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)?，酶的作用具有高效性，在一定時(shí)間內(nèi)，纖維素酶對(duì)紫杉烷類(lèi)化合物的提取過(guò)程持續(xù)進(jìn)行；但超過(guò)一定時(shí)間后，纖維素酶的活力隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減弱，導(dǎo)致提取作用減弱或停止。因此，確定最佳酶處理時(shí)間為1.0 h。

2.1.2酶處理溫度對(duì)得率的影響(圖2)

圖2　酶處理溫度對(duì)得率的影響

由圖2可知，其它條件不變時(shí)，紫杉烷類(lèi)化合物的得率隨著酶處理溫度的升高而逐漸上升，在酶處理溫度為40 ℃時(shí)達(dá)到最高，超過(guò)40 ℃后逐漸下降。原因主要是溫度對(duì)纖維素酶的活力有一定的影響，溫度過(guò)低時(shí)酶的活力較低而不易達(dá)到最佳水平；溫度過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致酶活力降低或者失活，從而導(dǎo)致得率降低。因此，確定最佳酶處理溫度為40 ℃。

2.1.3酶用量對(duì)得率的影響(圖3)

圖3　酶用量對(duì)得率的影響

由圖3可以看出，在一定條件下，隨著酶用量的增加，紫杉烷類(lèi)化合物得率升高，在酶用量為0.8%時(shí)，紫杉烷類(lèi)化合物得率最高；酶用量超過(guò)0.8%以后，紫杉烷類(lèi)化合物得率下降。這是因?yàn)椋赣昧科蜁r(shí)，纖維素酶對(duì)底物提取作用不完全，導(dǎo)致紫杉烷類(lèi)化合物的得率偏低；當(dāng)酶用量過(guò)多時(shí)，酶對(duì)其它成分的提取作用也加強(qiáng)，導(dǎo)致提取液中的雜質(zhì)增多，影響了酶對(duì)紫杉烷類(lèi)化合物的提取作用。因此，確定最佳酶用量為0.8%。

2.1.4料液比對(duì)得率的影響(圖4)

圖4　料液比對(duì)得率的影響

由圖4可知，一定條件下，隨料液比的降低，纖維素酶的提取效果逐漸提高，紫杉烷類(lèi)化合物的得率逐漸升高；在料液比達(dá)到1∶14時(shí)紫杉烷類(lèi)化合物的得率最高，提取效果最好；當(dāng)料液比繼續(xù)降低時(shí)，紫杉烷類(lèi)化合物的得率下降，提取效果下降。一般，料液比越小，即溶劑用量越大，提取物的得率越高，但是當(dāng)溶劑用量達(dá)到一定值后，紫杉烷類(lèi)化合物的提取已經(jīng)基本完全，若繼續(xù)加大溶劑用量，不僅會(huì)造成單位體積提取液中紫杉烷類(lèi)化合物濃度的降低，提取液中溶出的其它成分也增多，而且還會(huì)造成溶劑和資源的浪費(fèi)。因此，確定最佳料液比為1∶14。

2.2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析(表2)

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

Tab.2　Results and analysis of orthogonal experiment

由表2可以看出，影響紫杉烷類(lèi)化合物得率因素的大小順序?yàn)镈>B>A>C，即料液比>酶用量>酶處理時(shí)間>酶處理溫度。最優(yōu)提取工藝條件為A1B1C3D3，即酶處理時(shí)間1.0 h、酶用量0.6%、酶處理溫度45 ℃、料液比1∶16。

2.3　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按A1B1C3D3工藝條件進(jìn)行3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在最優(yōu)工藝條件下，紫杉烷類(lèi)化合物的平均得率為0.898%，3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的RSD=0.85%，表明此工藝條件重復(fù)性良好。

3結(jié)論

采用纖維素酶法處理紅豆杉樹(shù)皮，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)酶法提取紫杉烷類(lèi)化合物的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝條件為：酶處理時(shí)間1.0 h、酶用量0.6%、酶處理溫度45 ℃、料液比1∶16(g∶mL)。在最優(yōu)工藝條件下，纖維素酶法提取云南紅豆杉樹(shù)皮中紫杉烷類(lèi)化合物的得率可達(dá)0.898%。

使用無(wú)毒的無(wú)水乙醇為提取溶劑，不僅縮短了工藝時(shí)間，簡(jiǎn)化了工藝流程，還減少了有機(jī)溶劑的用量以降低對(duì)環(huán)境的污染。料液比對(duì)酶法提取紅豆杉樹(shù)皮中紫杉烷類(lèi)化合物的影響相對(duì)較大，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格控制料液比以保障紫杉烷類(lèi)化合物的得率。纖維素酶法處理的工藝條件較溫和、穩(wěn)定，可為其工業(yè)化應(yīng)用提供一定參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]蘇建,史紅星,王麗軍,等.南方紅豆杉樹(shù)皮的化學(xué)成分研究[J].中藥材,2014,37(2):243-251.

[2]姚曉,步達(dá),陳建偉,等.南方紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)及其紫杉烷二萜類(lèi)成分的分析[J].中草藥,2014,45(18)：2692-2702.

[3]趙春芳,余龍江,劉智,等.中國(guó)紅豆杉中主要紫杉烷類(lèi)物質(zhì)的分布研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2005,25(1):89-93.

[4]王炳義.南方紅豆杉有效成分研究[D].蘇州：蘇州大學(xué), 2013.

[5]李代軍.紫杉烷類(lèi)抗腫瘤藥物進(jìn)展[J].科學(xué)時(shí)代,2013,(1).

[6]陳坤成,馮思良,劉克良.紫杉烷類(lèi)抗腫瘤藥物臨床研究進(jìn)展[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志,2013,40(3)：271-276.

[7]陳明.新型紫杉烷類(lèi)衍生物的設(shè)計(jì)、合成及抗腫瘤活性研究[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué),2014.

[8]韓金玉,肖劍,王華,等.紫杉醇的提取與純化技術(shù)[J].中草藥,2000,31(10):789-792.

[9]金洪順,樓惠琴,蔣世春,等.從紅豆杉中提取紫杉醇的工藝研究[J].廣州化工,2014,42(10):88-91.

[10]王志剛.曼地亞紅豆杉中紫杉醇的提取分離工藝及測(cè)定研究[D].長(zhǎng)沙：中南大學(xué),2007.

Optimization on Extraction Process of Taxanes fromTaxusYunnanensis

XU Yun，SHA Xi-yang，WU Rui，HUANG Shi-xu，YANG Wen-ting

(CollegeofEnvironmentalandBiologicalEngineering，WuhanTechnology

andBussinessUniversity,Wuhan430065,China)

Abstract：The taxanes were extracted from bark of Taxus yunnanensis by cellulase method.Using enzyme treatment time,dosage of enzyme,enzyme treatment temperature,solid-liquid ratio as factors and the taxanes yield as an index,the extraction process was optimized by singal factor experiment and orthogonal experiment.Results showed that,the optimal extraction conditions were as follows:enzyme treatment time 1.0 h,dosage of enzyme 0.6%,enzyme treatment temperature 45 ℃ and solid-liquid ratio 1∶16(g∶mL).Under above conditions,the yield of taxanes was 0.898%.The extraction process was simple in operation and the extraction conditions were stable and mild.

Keywords：Taxus yunnanensis;cellulase;taxane;orthogonal experiment

中圖分類(lèi)號(hào)：O 629

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)01-0039-04

作者簡(jiǎn)介：徐蕓(1994-)，女，湖北孝感人，研究方向：天然產(chǎn)物提取，E-mail：1924337061@qq.com；通訊作者：楊文婷，講師，E-mail：47389578@qq.com。

收稿日期：2015-09-24

基金項(xiàng)目：武漢工商學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(S201416)，武漢工商學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目(A2014018)

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.01.010