范志亮，馮曉娟，李春巖，尹少華，田新英*，任文博(.河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科，河北 邢臺(tái) 0500；.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000；.河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院超聲科，河北 邢臺(tái) 0500；.天津市第五中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 00000)

?

·論著·

民醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病和頭痛病診治研究。

河北漢族人群谷胱甘肽硫-轉(zhuǎn)移酶Z1的基因多態(tài)性研究

范志亮1，2，馮曉娟3，李春巖2，尹少華1，田新英2*，任文博4(1.河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科，河北 邢臺(tái) 054001；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000；3.河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院超聲科，河北 邢臺(tái) 054001；4.天津市第五中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300000)

[摘要]目的探討河北漢族人群谷胱甘肽硫-轉(zhuǎn)移酶Z1(glutathione S-transferase zeta 1，GSTZ1)基因多態(tài)性的分布情況。方法應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法，對(duì)210例河北漢族正常人進(jìn)行GSTZ1 Lys32Glu基因多態(tài)性分析。結(jié)果河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu基因多態(tài)性符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，具有代表性。河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布和等位基因頻率分布與伊朗人群、澳大利亞人群、德國(guó)人群、美國(guó)人群差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；伊朗人群GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布和等位基因頻率分布與澳大利亞人群、德國(guó)人群、美國(guó)人群差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；澳大利亞人群、德國(guó)人群、美國(guó)人群GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布和等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。結(jié)論河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布和等位基因頻率有其獨(dú)特性。GSTZ1 Lys32Glu的基因多態(tài)性在地域和人種中的分布明顯不同。

[關(guān)鍵詞]基因；多態(tài)性；谷胱甘肽硫-轉(zhuǎn)移酶Z1；河北漢族

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.02.003

谷胱甘肽硫-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases，GSTs)是體內(nèi)Ⅱ相代謝酶家族的重要成員，在體內(nèi)活性氧產(chǎn)物的代謝中發(fā)揮了重要的作用，并且是體內(nèi)氧化/抗氧化系統(tǒng)的重要成員，可以保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激的損傷[1-2]。 GSTs基因多態(tài)性可能影響所編碼的酶的功能，可以導(dǎo)致機(jī)體對(duì)一些活性氧產(chǎn)物和毒素的敏感性的改變，引起DNA損傷，導(dǎo)致疾病的發(fā)生[3]。GSTs多態(tài)性與腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白癜風(fēng)、慢性阻塞性肺病、帕金森病等易感性的關(guān)系已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[4-5]。人類可溶性GSTs至少包括7 種,即alpa (A)、 mu (M)、pi (P)、theta (T)、zeta (Z)、sigma(S)、omega(O)。已證實(shí)GSTA1、GSTA2、GSTM1、GSTT1、GSTP1、GSTZ1 和GSTO1具有多態(tài)性，目前對(duì)GSTM1、GSTT1和GSTP1 的基因多態(tài)性研究較為深入，而對(duì)GSTZ1多態(tài)性的研究相對(duì)較少[6-7]。對(duì)我國(guó)GSTZ1基因多態(tài)性的分布鮮有報(bào)道。GSTZ1最常見(jiàn)多態(tài)性的是GSTZ1 Lys32Glu，導(dǎo)致A→G轉(zhuǎn)換[8]。本研究主要探討GSTZ1 Lys32Glu基因多態(tài)性在河北健康漢族人群中的分布，旨在了解疾病的發(fā)生機(jī)制,評(píng)估疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),篩檢高危人群,為疾病的治療及預(yù)防提供線索。

1資料與方法

1.1受試對(duì)象隨機(jī)選取2013年12月—2014年2月無(wú)直接血緣關(guān)系的健康河北漢族個(gè)體210例， 男性122例，女性88例，年齡22~72歲，平均(49.27±9.34)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①漢族；②出生地及籍貫均為河北??；③定居河北省已三代及三代以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①罹患任何遺傳傾向性疾病；②在取樣當(dāng)時(shí)，診斷出患有各種心腦血管疾病、腫瘤、精神異常及其他重大健康問(wèn)題。

所有受試對(duì)象均知情并簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法[9]分析GSTZ1 Lys 32 Glu的基因多態(tài)性。

1.2.1DNA的提取血液樣品DNA通過(guò)北京天根公司血液基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。①將-80 ℃凍存的抗凝血混勻，取300 μL放入1.5 mL離心管中，加入750 μL的細(xì)胞裂解液CL，顛倒混勻5次；②10 000 g離心1 min，棄上清，倒置于干凈吸水紙上停留2 min；③向此管中加入緩沖液FG和蛋白酶K的混合液151.5 μL，立即漩渦至溶液無(wú)團(tuán)塊；56 ℃水浴10 min，其間顛倒混勻數(shù)次；④加入異丙醇150 μL，顛倒混勻，10 000 g離心3 min，棄上清，倒置于干凈吸水紙上停留2 min；⑤加入70%乙醇150 μL，漩渦振蕩5 s，10 000 g離心3 min，棄上清，倒置于干凈吸水紙上停留5 min，空氣干燥5 min；⑥加入洗脫緩沖液TB 200 μL，低速漩渦5 s，65 ℃水浴1 h，其間顛倒混勻數(shù)次助溶。最后保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2PCR擴(kuò)增①設(shè)計(jì)引物(由上海生物工程技術(shù)有限公司合成):上游引物為，5′-TGACCACCCAGAAGTGTTAG-3′，下游引物為5′-AGTCCACAAGACACAGGTTC-3′。②PCR擴(kuò)增體系：總體積20 μL,體系終濃度1×PCR 緩沖液,0.2 mmol/L dNTP,引物各300 pmol/ L,模板DNA(25~50 ng),TaqDNA 聚合酶0.5 U。③PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 2 min,95 ℃變性20 s,65 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸3 min。

1.2.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物加樣于3%瓊脂糖(1 μL Goldview Ⅰ型核酸染色劑)上，100 V電壓條件下，電泳40 min之后，用全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，目的條帶于310 bp處顯影。

1.2.4限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析酶切反應(yīng)總體積為20 μL，含10 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物、10 U的限制性核酸內(nèi)切酶Alw 26I、2 μL 10 ×buffer、7.6 μL超純?nèi)ルx子水。以雙蒸水代酶作為陰性對(duì)照，37 ℃酶切16 h。取酶切產(chǎn)物5 μL，加樣于3%瓊脂糖凝膠上，100 V電壓電泳40 min，再用全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描。

1.2.5限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Alw26I酶酶切以后，電泳可見(jiàn)到185 bp、125 bp 2條條帶，即為AA基因型；若酶切后，產(chǎn)生159 bp、125 bp和26 bp 3條條帶，即為GG基因型；若酶切后，產(chǎn)生185 bp、159 bp、125 bp和26 bp 4條條帶，即為AG基因型。隨機(jī)從每種基因型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中選取5個(gè)，進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，其結(jié)果均與本實(shí)驗(yàn)相同(圖1)。

圖1GSTZ1 Lys32Glu擴(kuò)增后酶切結(jié)果

M.核酸分子標(biāo)準(zhǔn)；1、4、5.AG基因型；2.AA基因型；3.GG基因型(26 bp顯示欠清)

Figure 1GSTZ1 Lys32Glu enzyme digestion results after amplification

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，組間基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1GSTZ1 Lys32Glu基因Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)經(jīng)Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)(χ2=0.169，P=0.919)，說(shuō)明符合此定律，提示該樣本來(lái)自同一總體，具有代表性。

2.2伊朗、澳大利亞、德國(guó)、美國(guó)人群與河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型和等位基因分布頻率的比較伊朗人群、澳大利亞人群、德國(guó)人群、美國(guó)人群與河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型和等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。澳大利亞人群、德國(guó)人群、美國(guó)人群與伊朗人群差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而澳大利亞人群、德國(guó)人群、美國(guó)人群之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

在不同國(guó)家人群GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布構(gòu)成比中，河北漢族人群中AA基因型所占比例最高(23.33%)，明顯高于其他人群；GG基因型所占比例最低(24.77%)，明顯低于其他人群。在伊朗人群中，AA基因型所占比例最低(5.13%)，GG基因型所占比例是AA基因型的12.5倍(64.10%vs5.13%)。澳大利亞、德國(guó)和美國(guó)人群中AA基因型相對(duì)較少，AG和GG基因型所占比例基本相當(dāng)。 在等位基因分布構(gòu)成比中：河北漢族人群的A與G等位基因所占比例基本相等(49.29%vs50.71%)，而伊朗、澳大利亞、德國(guó)和美國(guó)人群G等位基因所占比率明顯高于A等位基因。見(jiàn)表1。

表1不同國(guó)家人群GSTZ1 Lys32Glu基因型分布的比較

Table 1　The comparisons of distributions of both genotype frequency and allele

*P<0.05與河北漢族人群比較#P<0.05與伊朗人群比較(χ2檢驗(yàn))

3討論

谷胱甘肽硫-轉(zhuǎn)移酶Zeta家族，是近來(lái)通過(guò)生物信息學(xué)方法和利用人類表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)的GST家族中的一種。存在于肝臟和其他組織的細(xì)胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)中[10]。目前研究表明能夠編碼GST的基因分別分布在至少7 條不同染色體上，構(gòu)成了一個(gè)超基因家族，編碼具有GST活性的蛋白。GSTZ1屬于其中一種，基因存在2種多態(tài)性，即DNA 序列94 和124 處的變化，從而分別導(dǎo)致Lys-32→ Glu 及Arg-42→Gly 的替代[4，9，11]。關(guān)于GSTZ1 Lys32Glu基因多態(tài)性與疾病易感性的研究國(guó)外已有許多報(bào)道，如Karaka-Celik 等[12]報(bào)道GSTZ1基因多態(tài)性和患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)聯(lián)。Saadat 等[13]研究表明GSTZ1 Lys32Glu基因多態(tài)性與先兆子癇無(wú)關(guān)，而GSTZ1 Arg42Gly基因多態(tài)性等位基因變化可降低患先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)。Rezaei等[14]研究表明，在早發(fā)雙相情感障礙型患者中，Glu32Lys和G-1002A的變異等位基因會(huì)增加患病的易感性。本研究主要研究河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu基因多態(tài)性的分布，為以后與疾病相關(guān)性研究做準(zhǔn)備。

本研究結(jié)果顯示GSTZ1 Lys32Glu的基因多態(tài)性在地域和人種中的分布明顯不同。河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu的基因存在多態(tài)性，符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，具有代表性。河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布和等位基因頻率分布與伊朗人群、澳大利亞人群、德國(guó)人群、美國(guó)人群明顯不同[14-17]。河北漢族人群中A等位基因占49.30%，明顯高于其他人群。Nafissi 等[18]研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)人A等位基因占48.9%，本研究結(jié)果與其高度一致。我國(guó)人口眾多，多民族大聚集，基因多態(tài)性與民族及區(qū)域環(huán)境相關(guān)，所以其他省份和民族是否存在GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布和等位基因頻率的差異，還需進(jìn)一步研究。A等位基因在中國(guó)人中高表達(dá)，是否會(huì)造成其下游編碼蛋白的活性下降，增加患遺傳性酪氨酸血癥的風(fēng)險(xiǎn)，還需擴(kuò)大樣本量和多中心研究證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)河北人群與其他人群不同，考慮人種和地域不同所致。伊朗人群A等位基因占20.5%，明顯低于中國(guó)河北漢族人群和澳大利亞、德國(guó)和美國(guó)人群，伊朗地處歐亞、印度洋與阿拉伯三大板塊交界處，環(huán)境特殊；伊朗人與中國(guó)漢族人和歐美人群明顯不同，其GSTZ1 Lys32Glu基因的多態(tài)性，考慮可能與人種和環(huán)境有關(guān)，當(dāng)然還需其他研究支持。本研究結(jié)果顯示，澳大利亞人群、德國(guó)人群、美國(guó)人群在GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布和等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。考慮三者人種相同，有相同遺傳背景，環(huán)境因素對(duì)基因多態(tài)性影響不大。本研究可以為人種起源提供一定依據(jù)。當(dāng)然，GSTs屬一個(gè)超家族，其他亞基因型是否也存在類似的不同，還需更多研究證實(shí)。

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(本文編輯：許卓文)

Genetic polymorphism of glutathione S-transferase zeta1 among healthy Han population in Hebei province

FAN Zhi-liang1，2，F(xiàn)ENG Xiao-juan3，LI Chun-yan2，

YIN Shao-hua1，TIAN Xin-ying2*，REN Wen-bo4

(1.Department of Neurology Ⅲ,the People′s Hospital of Xingtai City,Hebei Province,Xingtai

054001,China;2.Department of Neurology,the Second Hospital of Hebei Medical University，

Hebei Province,Shijiazhuang 050000,China;3.Department of Ultrasound,the People's

Hospital of Xingtai City,Hebei Province,Xingtai 054001,China;4.Department of

Neurology,the Fifth Central Hospital of Tianjin,Tianjin 300000,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the glutathione S-transferase zeta 1(GSTZ1)genetic polymorphisms among healthy Han population of Hebei province.MethodsUsing polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) to detect the genotypes of GSTZ1 Lys32Glu in 210 healthy Han population of Hebei province.ResultsThe genotype distribution of the healthy Hebei Han population is consistent with Hardy-Weinberg genetic equilibrium law.The distributions of both genotype frequency and allele frequency of GSTZ1 Lys32Glu in Hebei healthy Han population are significantly different from those in Iranian,Australian,German and American(P<0.05). The distributions of both genotype frequency and allele frequency of GSTZ1 Lys32Glu in Iranian are significantly different from those in Australian,German and American(P<0.05), however,there are no significant difference among Australian,German and American in the distributions of both genotype frequency and allele frequency of GSTZ1 Lys32Glu(P>0.05). ConclusionThe distributions of both genotype frequency and allele frequency of GSTZ1 Lys32Glu in Hebei healthy Han population own its characters.The distributions of GSTZ1 Lys32Glu in regions and races are significantly different.

[Key words]gene;polymorphism;glutathione S-transferase zeta 1;Hebei Han population

[中圖分類號(hào)]R394.3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2016)02-0133-04

通訊作者*。E-mail：txyhb@126.com

[作者簡(jiǎn)介]范志亮(1982-)，男，河北邢臺(tái)人，河北省邢臺(tái)市人

[基金項(xiàng)目]邢臺(tái)市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃(2013ZC171)

[收稿日期]2015-05-13；[修回日期]2015-06-04