孫硯輝，張廣獻，鄺棗園，張曉圓，張　韌

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生化教研室，廣東 廣州510006)

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UQCRB基因的原核表達和純化

孫硯輝，張廣獻，鄺棗園*，張曉圓，張韌*

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生化教研室，廣東 廣州510006)

(ChinJLabDiagn,2016,20:0004)

輔酶Q-細胞色素C還原酶結(jié)合蛋白(ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein，UQCRB)分子量為13.3-kDa，是基因定位于染色體8q22的線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ的亞單位[1]。離體、在體研究顯示UQCRB在血管新生中具有重要作用，UQCRB下調(diào)或缺失均會抑制血管新生(Angiogenesis)[2-5]。正常狀況下血管新生有利于生長發(fā)育、傷口愈合等[6]；但在病理狀態(tài)下，血管新生則與很多疾病的發(fā)生相關(guān)，如腫瘤、肝纖維化等[7]。UQCRB有望成為治療血管新生相關(guān)疾病的靶向目標(biāo)[3,5]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)一些中藥單體可能通過與UQCRB的相互作用而達到治療肝病的效果，為進一步研究UQCRB在肝病中的作用機制，我們自行設(shè)計引物后完成了UQCRB的克隆、原核表達和純化及驗證，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、細胞及載體DH5α菌株、BL21(DE3)菌株、pET28a(+)菌株、人肝癌SMMC-7721細胞均由本實驗室保存。

1.1.2主要試劑與儀器AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒(美國Axygen公司)、QuickCutTMNhe I限制酶(日本TaKaRa公司)、QuickCutTMXho I限制酶 (日本TaKaRa公司)、His-tag pAb(美國Bioworld)、羊抗兔IgG-HRP(武漢博士德生物工程有限公司)、pMDTM18-T Vector Cloning Kit (日本TaKaRa公司)、ACK5003NT Amicon○RPro Affinity Concentration Kit-Ni-NTA (德國Merck Millipore公司)、RNApure超純總RNA快速提取試劑盒 (北京艾德萊生物科技有限公司)、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(日本TaKaRa公司)。XO-150超聲波細胞破碎儀(南京先歐儀器制造有限公司)、NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo Scientific公司)、TGL-16高速臺式冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)、BioPhotometer(德國Eppendorf AG)、J1可更換鏡頭電子取景數(shù)字照相機(日本Nikon公司)、DYY-12型電泳儀(北京市六一儀器廠)、TP600 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(日本TaKaRa公司)、ABSON HtPot50干式恒溫儀(合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司) PowerPAac 3000電泳儀(美國 BIO-RAD公司)

1.2方法

1.2.1UQCRB全長基因的獲取首先從人肝癌SMMC-7721細胞提取總RNA，裂解液RL裂解細胞并滅活RNA酶，經(jīng)去蛋白液RE及漂洗液RW處理后得到總RNA，微量紫外分光光度儀測定。按5×PrimeScript Buffer 2 μl、1×PrimeScript RT Enzyme Mix I0.5 μl、Oligo dT Primer0.5 μl、Random 6 mers 0.5 μl、Total RNA 提取液3.5 μl、RNase Free dH2O 3 μl配制非特異性逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:50℃ 15 min；85℃ 5 s。采用自行設(shè)計由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成的特異性引物進行UQCRB全長基因擴增，上游引物5′端加NheI酶切位點、下游引物5′端加XhoI酶切位點。UQCRB forward Primer:5′-GCTAGCATGCGAGATGATACAATATACGA-3′，UQCRB reverse Primer:5′-CTCGAGTTACTTCTTTGCCCATTCTTCT-3′；反應(yīng)體系為：Premix TaqTMPCR預(yù)混液12.5 μl、非特異逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl、UQCRB forward Primer0.15 μl、UQCRB reverse Primer 0.15 μl、deionized water 10.2 μl；反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性8 min；94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個循環(huán)；72℃再延伸10 min。取一部分PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，剩余部分按1∶3體積加入NaI行UQCRB目的基因純化。

1.2.2UQCRB克隆載體的構(gòu)建按UQCRB蛋白基因PCR回收產(chǎn)物4 μl、T載體1 μl、SolutionI 5 μl體系連接UQCRB目的基因與T載體后，將連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞， 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h左右，取出后隨機挑取陽性菌落行PCR擴增，引物同1.2.1，菌落PCR體系為：Premix TaqTMPCR預(yù)混液12.5 μl、UQCRB forward Primer0.15 μl、UQCRB reverse Primer 0.15 μl、deionized water 12.2 μl；反應(yīng)條件同1.2.1，PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳。挑取PCR擴增產(chǎn)物UQCRB條帶陽性對應(yīng)的單克隆菌落在液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.3PET28a(+)-UQCRB重組蛋白原核表達載體的構(gòu)建分別對PET28a(+)質(zhì)粒、T-UQCRB質(zhì)粒進行NheI、XhoI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，分別割膠回收純化，將UQCRB全長基因與PET28a(+)載體片段連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h左右取出后隨機挑取陽性菌落行PCR擴增，引物同1.2.1，菌落PCR體系同1.2.2；反應(yīng)條件同1.2.1，PCR擴增陽性的菌落在液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.4UQCRB重組蛋白的原核表達將重組質(zhì)粒的表達菌BL21(DE3)37℃搖培過夜，取過夜培養(yǎng)菌液按1∶20的比例接種于溶菌肉湯培養(yǎng)基中(LB培養(yǎng)基)培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8時用IPTG終濃度1 mM 37℃誘導(dǎo)，分別在誘導(dǎo)3 h、4 h、5 h、6 h后收集菌液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以尋找最佳誘導(dǎo)時間；并至OD600=0.6-0.8時分別以終濃度0.6 mM、0.8 mM、1.0 mM、1.2 mM IPTG 37℃進行誘導(dǎo)，5 h后收集菌液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以尋找最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的配方為：4% SDS-PAGE濃縮膠、15% SDS-PAGE分離膠，電泳后用考馬斯亮藍R-250染色。

1.2.5UQCRB重組蛋白的純化因為PET-28a質(zhì)粒上帶his標(biāo)簽，采用Ni-NTA樹脂親和層析進行UQCRB蛋白的純化。Ni-NTA樹脂經(jīng)過Bind Buffer處理后與UQCRB蛋白室溫下緩慢振搖孵育60 min，Wash Buffer洗滌3次，用50 mM、80 mM、250 mM咪唑濃度分別洗脫His標(biāo)簽UQCRB融合蛋白，并進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以尋找最佳咪唑洗脫濃度。

1.2.6UQCRB重組蛋白的westernblot驗證IPTG誘導(dǎo)前的菌液、IPTG誘導(dǎo)后的菌液、純化的蛋白樣品以及蛋白Marker進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，300 mA電流恒流轉(zhuǎn)膜后，取出PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜polyvinylidene fluoride)依次采用5%脫脂奶粉-TBS封閉液、稀釋后的抗His-Tag5%脫脂奶粉-TBS及辣根過氧化物酶標(biāo)記的稀釋二抗溶液進行孵育，顯影、定影，室溫下晾干將膠片進行掃描。

2結(jié)果

2.1UQCRB全長基因的獲取

微量紫外分光測定人肝癌SMMC-7721細胞總RNA結(jié)果為OD260/OD280為2.02，濃度為142.8 ng/μl，反轉(zhuǎn)錄后的PCR擴增產(chǎn)物大小與UQCRB的基因片段大小一致見圖1。

圖1　UQCRB的逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物注：M：marker；1.反轉(zhuǎn)錄后的PCR產(chǎn)物

2.2UQCRB目的基因克隆載體的構(gòu)建

雙酶切后的小片段與UQCRB目的基因片段大小一致，經(jīng)測序證實序列完全正確。pBSK-UQCRB質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果見圖2。

2.3UQCRB蛋白原核表達載體的構(gòu)建

雙酶切后的小片段與UQCRB目的基因片段大小一致，經(jīng)測序證實序列及閱讀框架完全正確。PET28a(+)-UQCRB質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果見圖3。

2.4UQCRB蛋白的原核表達

無IPTG誘導(dǎo)組及細胞外液組均未見UQCRB蛋白條帶，IPTG誘導(dǎo)組均可見UQCRB蛋白條帶，大小與UQCRB蛋白預(yù)期相符，8M尿素PBS做為重新懸浮液組UQCRB融合蛋白條帶較其他PBS做為重新懸浮液組明顯加深加粗，5 h誘導(dǎo)時間效果較理想；隨著IPTG誘導(dǎo)濃度的提高，UQCRB融合蛋白條帶逐漸加粗。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳考染結(jié)果見圖4、圖5。

注：M1：1kb marker；M2：2000kb marker； 1：T 載體；2：T-UQCRB質(zhì)粒；3：T-UQCRB質(zhì)粒NheI、 XhoI雙酶切；4：T-UQCRB質(zhì)粒XhoI單酶切；5：T-UQCRB質(zhì)粒NheI單酶切；6：單克隆菌落菌液PCR產(chǎn)物圖2　 T-UQCRB質(zhì)粒酶切鑒定

注：M1：2000kb marker； M2：1kb marker；1：PET28a(+)質(zhì)粒；2：PET28a(+)-UQCRB質(zhì)粒；3：PET28a(+)-UQCRB質(zhì)粒NheI、XhoI雙酶切；4：PET28a(+)-UQCRB質(zhì)粒XhoI單酶切；5：PET28a(+)-UQCRB質(zhì)粒NheI單酶切；6：單克隆菌落菌液PCR產(chǎn)物圖3　PET28a(+)-UQCRB質(zhì)粒酶切鑒定

注：M:marker；1：IPTG誘導(dǎo)組菌液離心后的上清液；2：無IPTG誘導(dǎo)組；3：8M尿素PBS重新懸浮組；4：IPTG誘導(dǎo)3 h組；5：IPTG誘導(dǎo)4 h組； 6：IPTG誘導(dǎo)5 h組；7、IPTG誘導(dǎo)6 h組圖4　IPTG誘導(dǎo)His標(biāo)簽UQCRB融合蛋白原核表達時間的優(yōu)化

注：M:marker；1：0.6 mMIPTG誘導(dǎo)組；2：0.8 mM IPTG誘導(dǎo)組；3：1.0 mM IPTG誘導(dǎo)組；4：1.2 mM IPTG誘導(dǎo)組圖5　IPTG誘導(dǎo)His標(biāo)簽UQCRB融合蛋白原核表達IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化

2.5UQCRB蛋白的純化

Flow-through里會殘留少量UQCRB融合蛋白目的條帶，經(jīng)過3次Wash Buffer洗滌第3次Wash Buffer洗滌液里已見不到其他蛋白雜帶，只可見淡的His標(biāo)簽UQCRB融合蛋白目的條帶，洗脫UQCRB融合蛋白的50 mM、80 mM直至250 mM咪唑濃度洗脫液里均可見UQCRB融合蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳考染結(jié)果見圖 6。

注：M:marker；L：PET28a(+)-UQCRB質(zhì)粒陽性菌液表達裂解液(lysate)；F：flow-through；1：Wash Buffer洗滌液1；2：Wash Buffer洗滌液2；3：Wash Buffer洗滌液3；4：50 mM 咪唑濃度洗脫液；5：80 mM咪唑濃度洗脫液；6：250 mM咪唑濃度洗脫液

2.6UQCRB蛋白的westernblot驗證

誘導(dǎo)前樣品未見陽性條帶，IPTG誘導(dǎo)后樣品及純化蛋白樣品均可見陽性條帶且與UQCRB重組蛋白大小一致。westernblot結(jié)果見圖7。

3討論

本研究根據(jù)UQCRB基因特點自行設(shè)計引物獲得了其全長基因，并根據(jù)后續(xù)純化鑒定的需要，選用了含有His標(biāo)簽的pET-28a(+) Vector做為表達載體，采用高效表達的BL21(DE3)做為宿主菌進行了UQCRB重組蛋白的表達和純化，且通過Westernblot得到了證實。真核基因在大腸桿菌中的表達形式一般可分為細胞內(nèi)不溶性表達,即以包涵體形式存在；細胞內(nèi)可溶性表達；蛋白分泌型表達。SDS-PAGE結(jié)果證實UQCRB的表達主要為非蛋白分泌型表達，為細胞內(nèi)可溶性表達，會有部分包涵體形成，但可溶性UQCRB的量可以滿足需要，同時我們也對表達的時間及IPTG誘導(dǎo)濃度進行了優(yōu)化，盡量避免過表達等引起的包涵體形成增多等。我們采用Amicon? Pro Affinity Concentration Kit-Ni-NTA進行純化并對純化條件進行了摸索，不僅操作方便、蛋白純度高，且純化同時、可以進行濃縮換液等，較比應(yīng)用透析等濃縮換液方法等大大節(jié)省了時間，為進一步研究UQCRB與中藥有效成分的相互作用創(chuàng)造了有利條件。

注：M:marker；1：IPTG誘導(dǎo)前的菌液；2：IPTG誘導(dǎo)后的菌液；3：IPTG誘導(dǎo)后純化的蛋白樣品圖7　UQCRB蛋白的westernblot驗證

參考文獻：

[1]Malaney S,Heng HH,Tsui LC,et al.Localization of the human gene encoding the 13.3-kDa subunit of mitochondrial complex III (UQCRB) to 8q22 by in situ hybridization[J].Cytogenet Cell Genet,1996，73(4):297.

[2]Jung HJ,Shim JS,Lee J,et al.Terpestacin inhibits tumor angiogenesis by targeting UQCRB of mitochondrial complex III and suppressing hypoxia-induced reactive oxygen species production and cellular oxygen sensing[J].J Biol Chem,2010,285(15):11584.

[3]Jung HJ,Kim KH,Kim ND,et al.Identification of a novel small molecule targeting UQCRB of mitochondrial complex III and its anti-angiogenic activity[J].Bioorg Med Chem Lett,2011,21(3):1052.

[4]Jung HJ,Kim Y,Chang J,et al.Mitochondrial UQCRB regulates VEGFR2 signaling in endothelial cells[J].J Mol Med (Berl),2013,91(9):1117.

[5]Cho YS,Jung HJ,Seok SH,et al.Functional inhibition of UQCRB suppresses angiogenesis in zebrafish[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,433(4):396.

[6]Semenza GL .Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine[J].Cell,2012,148(3):399.

[7]Elpek,GO.,Angiogenesis and liver fibrosis[J].World J Hepatol,2015,7(3):377.

摘要：目的為研究UQCRB(ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)與中藥的作用機制，本實驗室進行了UQCRB基因的克隆、原核表達和純化。方法提取人肝癌SMMC-7721細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用特異引物進行PCR擴增獲取UQCRB基因全長，產(chǎn)物純化后連入T載體測定正確，克隆經(jīng)NheI、XhoI雙酶切后連入PET28a(+)載體，構(gòu)建PET28a(+)-UQCRB原核表達質(zhì)粒。在BL21(DE3)宿主菌中表達超聲處理后，應(yīng)用Amicon○RPro Affinity Concentration Kit-Ni-NTA純化，表達及純化產(chǎn)物用westernblot驗證。結(jié)果構(gòu)建了PET28a(+)-UQCRB表達質(zhì)粒，經(jīng)過酶切鑒定和測序鑒定正確。重組UQCRB在BL21(DE3)中的最優(yōu)表達條件為IPTG 1mM誘導(dǎo)5 h。Westernblot證實了表達和純化結(jié)果。結(jié)論重組UQCRB的原核表達和純化成功，為進一步研究UQCRB的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：UQCRB;克隆;表達;純化

Prokaryotic expression and purification of UQCRBSUNYan-hui,ZHANGGuang-xian,KUANGZao-yuan,etal.(CollegeofFundamentalMedicalScience，GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510006，China)

Abstract:ObjectiveTo study the interaction between UQCRB and traditional Chinese medicine,cloning,prokaryotic expression and purification of UQCRB (ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein) was done in our laboratory.MethodsTotal RNA was extracted from SMMC-7721 cells of human liver cancer.The UQCRB full length gene was obtained by PCR amplification after reverse transcription using specific primers and the PCR product was purified and cloned into T vector which was sequenced to be correct.After being digested by Restriction Enzymer NheI and XhoI,it was connected to PET28a (+)to construct prokaryotic expression plasmid of PET28a(+)-UQCRB.UQCRB recombinant protein was expressed in BL21 (DE3) host bacteria and purified Using Amicon○RPro Affinity Concentration Kit-Ni-NTA.Both the products of expression and purification was verified using Westernblot.ResultsExpression plasmid of PET28a(+)-UQCRB was constructed and measured by restriction enzyme digestion identification and sequencing analysis.It was optimal that the expression of recombinant UQCRB in BL21 (DE3) was induced 5 hours with 1mM IPTG.The product of expression and purification was confirmed to be UQCRB recombinant protein by Westernblot.ConclusionSuccess of prokaryotic expression and purification of recombinant UQCRB establishes the foundation of further study for the function of UQCRB.

Key words:UQCRB;Cloning;Expression;purification

(收稿日期：2015-10-15)

作者簡介：孫硯輝(1969-)，女，博士，講師。

中圖分類號：Q78

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-4287(2016)01-0004-04

*通訊作者

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(81102714)