莊　彪　閔志均　王廷峰　張　鵬　倪　熊　瞿惠龍　丁育明

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miRNA-34a對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的影響

莊彪閔志均王廷峰張鵬倪熊瞿惠龍丁育明

【摘要】目的研究微小RNA-34a(microRNA-34a，miR-34a)在人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116中的過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的影響及其機(jī)制。方法設(shè)計(jì)合成并構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白 (GFP)的miR-34a真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞。通過(guò)Realtime PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后miR-34a的表達(dá)變化。MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后HCT116細(xì)胞增殖能力變化，Transwell法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后HCT116細(xì)胞侵襲能力改變，western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果miR-34a轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后其表達(dá)量增加到(7.32±1.34)倍，而HCT116細(xì)胞增殖能力也受到顯著抑制，下降到(0.49±0.10)；Bcl-2蛋白受到miR-34a表達(dá)的抑制，而B(niǎo)AX的表達(dá)則受到miR-34a表達(dá)的增強(qiáng)；HCT116細(xì)胞侵襲能力在miR-34a過(guò)表達(dá)后顯著增強(qiáng)，相應(yīng)的MMP-2和MMP-9表達(dá)也出現(xiàn)顯著增強(qiáng)。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。結(jié)論miR-34a的過(guò)表達(dá)能夠抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移，與調(diào)控Bcl-2/BAX和MMP-2和-9蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】人結(jié)腸癌細(xì)胞；miRNA-34a；增殖；侵襲

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:179～182)

結(jié)腸癌(cancer of colon)作為中國(guó)最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率占胃腸道腫瘤的第3位。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，中國(guó)的結(jié)腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，與社會(huì)環(huán)境、生活方式和遺傳等因素密切相關(guān)。深入探究結(jié)腸癌的病因和機(jī)制，對(duì)結(jié)腸癌的早期診斷、臨床治療及預(yù)后均有顯著意義。微小 RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)在進(jìn)化上結(jié)構(gòu)高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，近年來(lái)大量研究早已證實(shí)，miRNA在多種惡性腫瘤的病理進(jìn)程中起到了極為重要的調(diào)控作用[1]。其中MicroRNA-34a(miR-34a)能夠作為抑癌基因p53的效應(yīng)分子從而抑制多種癌細(xì)胞的增殖[2]，但對(duì)于miR-34a在結(jié)腸癌中的作用和機(jī)制研究仍相對(duì)空白，本研究通過(guò)構(gòu)建 miR-34a表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，研究miRNA-34a的表達(dá)在結(jié)腸癌中的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的作用，并探討其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1　細(xì)胞株與主要試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自GIBCO公司，miRNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，Real-time PCR Taqman 試劑購(gòu)自Takara公司，MTT試劑購(gòu)自Sigma公司，miR-34a真核表達(dá)載體(GAUGUUCUAUUGAAGAGUGUUUG)和陰性對(duì)照miR-34a-none control (NC:GGACACGAAATCTATGCGCGTG)及攜帶GFP熒光蛋白表達(dá)的重組質(zhì)粒由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)并合成，轉(zhuǎn)染試劑 lipofectmin2000 購(gòu)自 Invitrogen公司，Western blot相關(guān)試劑(上樣緩沖液，蛋白marker，電泳液和轉(zhuǎn)膜液，顯色液)購(gòu)自碧云天公司，第一抗體和第二抗體購(gòu)自Cell signalling Technology公司，其他常用試劑購(gòu)自Sigma公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1 000 U/ml青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，放置于37 ℃，5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，每2～3天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合>80%后使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，種板培養(yǎng)或傳代。

1.2.2miR-34a轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞消化重懸后，使用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋到105個(gè)/ml，將2 ml細(xì)胞種到6孔板中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)24 h后，待細(xì)胞融合>50%后更換無(wú)血清培養(yǎng)基，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。提前按照試劑說(shuō)明書(shū)制備轉(zhuǎn)染溶液，在500 μl DMEM 中加入 5 μg 質(zhì)粒混勻，室溫孵育 5 min；在DMEM中再加入 10 μl 脂質(zhì)體 lipofectmin 2000 混勻，室溫孵育 5 min；將上述2種稀釋液混勻，室溫孵育 20 min。將混合物加入6 孔板中，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后12 h后更換DMEM完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3miR-34a表達(dá)檢測(cè)培養(yǎng)HCT116細(xì)胞使用QIAGEN公司miRNA提取試劑盒提取總miRMA后，使用TaqMan MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將上述提取的miRNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min；以 TaqMan MicroRNA 檢測(cè)試劑盒對(duì)上述制備得到的cDNA進(jìn)行 real-time PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s 及 60 ℃ 1 min，共 40個(gè)循環(huán)。PCR 完成后，在羅氏LC480軟件上分析基因的擴(kuò)增情況，得到相應(yīng)的 Ct 值。以 U6為內(nèi)參來(lái)校正PCR 模板的拷貝數(shù)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，基因相對(duì)表達(dá)量采用 2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.2.4Western blotmiR-34a轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的HCT116 細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，加入10 μl的RIPA裂解液，10 min后提取總蛋白，BCA法蛋白定量蛋白濃度，各組取50 μg蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜到PVDF膜，用5% milk-TBS將膜封閉1 h，加入相應(yīng)的第一抗體，靜置于4 ℃過(guò)夜。次日使用TBST漂洗，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，DAB顯影拍照。

1.2.5MTT 檢測(cè)細(xì)胞的增殖miR-34a轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的HCT116 細(xì)胞以105/ml 密度接種于 96孔板中，加入200 μl DMEM完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染后置于 37 ℃、5% CO2孵箱中分別培養(yǎng) 24、36、 48 h和72 h后，去除培養(yǎng)液，加入10 μl/每孔的MTT 后在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h 后，觀察到明顯的顏色變化后再用酶標(biāo)儀讀取每孔的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.6Transwell腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力miR-34a轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的HCT116 細(xì)胞分別接種于6孔板中。本研究使用8 μm孔徑的Corning小室檢測(cè)HCT116細(xì)胞的侵襲能力。單層Matrigel膠提前包被小室濾膜，在上室孔中加入轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的HCT116 細(xì)胞(105個(gè))，在下室中加入DMEM完全培養(yǎng)基，靜置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后。去除培養(yǎng)基，使用4%多聚甲醛固定，蘇木精染色，置于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲率/%=(穿透細(xì)胞數(shù)/空白對(duì)照組穿透細(xì)胞數(shù))×100% 。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件完成，數(shù)據(jù)采用MEAN±SEM 表達(dá)，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　miR-34a轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞上調(diào)miR-34a的表達(dá)

在miR-34a表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞24 h后，熒光檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，miR-34a轉(zhuǎn)染的HCT116細(xì)胞中可見(jiàn)攜帶GFP綠色熒光蛋白，表明轉(zhuǎn)染成功。提取細(xì)胞總miRNA進(jìn)行Reltime PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的HCT116細(xì)胞的miR-34a表達(dá)水平增加了(7.32±1.34)倍(與空白對(duì)照組相比，P<0.001)，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組的miR-34a表達(dá)水平比較無(wú)顯著性差異，其中陰性對(duì)照組為(0.99±0.01)，空白對(duì)照組為(1.00±0.03)(圖1)。因此可以明確，miR-34a表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后能夠顯著上調(diào)miR-34a的表達(dá)。

圖1　Realtime PCR檢測(cè)HCT116細(xì)胞中miR-34a表達(dá)

2.2　miR-34a 轉(zhuǎn)染抑制HCT116細(xì)胞的增殖

對(duì)轉(zhuǎn)染miR-34a后的HCT116細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測(cè)。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-34a過(guò)表達(dá)的HCT116細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制，下降到(0.49±0.10)(與空白對(duì)照組相比，P<0.001)，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組miR-34a表達(dá)水平比較無(wú)顯著性差異，其中陰性對(duì)照組為(1.00±0.08)，空白對(duì)照組為(0.99±0.06)(圖2)，表明miR-34a與HCT116細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān)。

圖2　MTT法檢測(cè)結(jié)果

2.3　miR-34a轉(zhuǎn)染對(duì)Bcl-2和BAX蛋白表達(dá)的影響

Bcl-2和BAX蛋白是細(xì)胞凋亡分子機(jī)制研究的重要靶分子。Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，miR-34a轉(zhuǎn)染組的Bcl-2條帶灰度明顯降低，而B(niǎo)AX條帶灰度則顯著增強(qiáng)，但空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(圖3)，表明miR-34a可能通過(guò)調(diào)控Bcl-2和BAX蛋白表達(dá)而抑制HCT116細(xì)胞的增殖。

圖3　Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.4　miR-34a轉(zhuǎn)染對(duì)HCT116侵襲能力的影響

Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-34a過(guò)表達(dá)的HCT116細(xì)胞的侵襲能力受到顯著抑制，下降到(62.67±8.23)%(與空白對(duì)照組相比，P<0.001)，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組miR-34a表達(dá)比較無(wú)顯著性差異，其中陰性對(duì)照組為(93.32±10.20)%，空白對(duì)照組為(100.50±8.13)%(圖4)，表明miR-34a可能參與了HCT116細(xì)胞的侵襲過(guò)程。

圖4　Transwell法檢測(cè)結(jié)果

2.5　miR-34a轉(zhuǎn)染對(duì)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的活性與結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，miR-34a轉(zhuǎn)染組的MMP-2和MMP-9的條帶灰度明顯降低，其中MMP-9的條帶灰度減弱更為明顯，但空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比，MMP-2和MMP-9無(wú)顯著差異(圖5)，表明miR-34a可能通過(guò)調(diào)控MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)而抑制HCT116細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

圖5　Western blot檢測(cè)結(jié)果

3討論

結(jié)腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例多達(dá)800萬(wàn)人，具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、惡性程度高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，而其病因和機(jī)制尚未得到明確的認(rèn)識(shí)，給治療帶來(lái)了極大的困難[3]。進(jìn)一步研究揭示結(jié)腸癌發(fā)病的分子機(jī)制和藥物靶點(diǎn)，具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

MicroRNA是1種近年逐漸明確的內(nèi)源性非編碼的單鏈小分子RNA，其結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上高度保守，能夠通過(guò)與目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄mRNA的3’-UTR端特異性配對(duì)結(jié)合而發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，從而促進(jìn)目標(biāo)基因mRNA的降解或抑制其翻譯轉(zhuǎn)錄，從而達(dá)到調(diào)控靶蛋白表達(dá)的作用[4]。近年的大量研究表明，存在多種不同功能的miRNA位于腫瘤相關(guān)基因組的染色體區(qū)域，并能通過(guò)與目的基因的相互作用而對(duì)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為產(chǎn)生不同的調(diào)控作用，尤其是與癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5-6]。miRNA 的功能學(xué)研究為多種腫瘤，包括結(jié)腸癌的診斷和治療提供了新的研究思路和方向，并且通過(guò)應(yīng)用miRNA的表達(dá)載體或相應(yīng)的反義miRNA 來(lái)提高或降低特定miRNA 的表達(dá)，從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的作用已取得了一定的研究成果[7]。已有研究明確，在結(jié)腸癌患者的病變組織中能夠檢測(cè)到多種miRNA出現(xiàn)差異性表達(dá)，例如Wang P等的研究顯示，miRNA-21靶向調(diào)控Cdc25a的表達(dá)而對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和周期產(chǎn)生抑制作用[8]，而miRNA-143和-145在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和化療敏感性等方面的作用已經(jīng)相對(duì)明確，成為具有潛在的診斷和治療價(jià)值的靶點(diǎn)[9]。早有研究顯示，miR-34a能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G1期而抑制其增殖，同時(shí)也能抑制其侵襲轉(zhuǎn)移能力[10]，此外miR-34a在前列腺癌、肝癌和肺癌等多種腫瘤中展示出多種不同機(jī)制的調(diào)控作用，而被認(rèn)為是具有重要價(jià)值的腫瘤抑制因子[11-13]，但是miR-34a 在結(jié)腸癌中的作用研究目前尚相對(duì)較少。

為了探討miR-34a的表達(dá)在結(jié)腸癌中的作用，本研究根據(jù)microRNA作用原理設(shè)計(jì)合成了miR-34a的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，采用real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果明確了轉(zhuǎn)染細(xì)胞后miR-34a表達(dá)顯著上升，在此基礎(chǔ)上我們發(fā)現(xiàn)，miR-34a的過(guò)表達(dá)抑制了HCT116細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。上述結(jié)果表明，miR-34a在HCT116細(xì)胞中起到抑制腫瘤相關(guān)基因的作用，提示miR-34a可作為結(jié)腸癌基因治療的潛在靶點(diǎn)，這與其他的研究結(jié)果一致[14]。一些研究也發(fā)現(xiàn)，部分miRNA具有調(diào)控部分與癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白，例如miRNA-146b能夠通過(guò)靶向調(diào)控MMPs的表達(dá)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力[15]。因此我們進(jìn)一步研究了與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白表達(dá)，而與前面的研究結(jié)果相一致的，Bcl-2表達(dá)被抑制而B(niǎo)AX表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的MMP-2和MMP-9的表達(dá)受到抑制，提示miR-34a通過(guò)調(diào)控Bcl-2/BAX和MMP-2和-9蛋白的表達(dá)而降低了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的能力。

綜上所述，本研究證實(shí)miR-34a的過(guò)表達(dá)能夠抑制人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，這一作用可能是通過(guò)調(diào)控Bcl-2/BAX和MMP-2和-9蛋白的表達(dá)相關(guān)，初步揭示了miR-34a在結(jié)腸癌的治療和診斷中的潛在價(jià)值，為后續(xù)的深入研究提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(編輯：吳小紅)

Effects of miRNA-34a on Cell Proliferation and Invasion in Human Colon

Cancer Cell HCT116

ZHUANGBiao,MINZhijun,WANGTingfeng,etal.ShanghaiPudongHospital,Shanghai,201300

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of microRNA-34a (miR-34a) overexpression on cell proliferation and invasion in human colon cancer cell line HCT116.MethodsA portable green synthesis fluorescent protein (GFP) of miR-34a eukaryotic expression vector was designed and established to stably transfect HCT116 cells.Realtime PCR was used to verify the expression of miR-34a after expression vector transfection.MTT assay was used to determine the changes of HCT116 cell proliferation.Transwell assay was performed to measure the cell invasion ability of HCT116 cells.ResultsAfter transfection of miR-34a into HCT116 cells,the expression of miR-34a increased by(7.32±1.34) folds and cell proliferation ability was significantly inhibited,which was reduced to(0.49±0.10) compared with the control group.Bcl-2 protein expression was inhibited by miR-34a transfection,but the expression of BAX was enhanced by miR-34a transfection.The invasion of HCT116 cells was also significantly increased by miR-34a transfection,which was accompanied by MMP-2 and MMP-9 up-regulation.There was no significant difference in the negative control group and the control group.ConclusionOverexpression of miR-34a can inhibit the proliferation and invasion in human colon cancer cells HCT116,and it is closely correlated with the regulation of Bcl-2/BAX and the expression of MMP-2 and-9 proteins.

【Key words】Human colon cancer cells;miRNA-34a;Proliferation;Invasion

(收稿日期2015-03-23修回日期 2015-11-20)

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.3+5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)02-0179-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.02.002

通訊作者：莊彪

基金項(xiàng)目：上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科技發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)基金(編號(hào)：PW2014A-28)
作者單位:201300上海市浦東醫(yī)院