任凌燕　徐　磊　趙　青　羅　皓　趙　怡

作者單位:210000 解放軍第四五四醫(yī)院

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β-欖香烯對(duì)人食管癌細(xì)胞EC9706增殖、凋亡及caspase-3的影響

任凌燕徐磊趙青羅皓趙怡

作者單位:210000 解放軍第四五四醫(yī)院

【摘要】目的研究β-欖香烯對(duì)人食管癌細(xì)胞EC9706增殖、凋亡及caspase-3表達(dá)的影響。方法采用不同濃度的β-欖香烯(0、10、20、30、40、50 μg/ml)處理細(xì)胞24 h，CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖活力。以50 μg/ml β-欖香烯處理細(xì)胞0、6、12、24 h，CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖活力。以不加β-欖香烯組作為對(duì)照組，選取50 μg/ml β-欖香烯處理細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率，分光光度法測(cè)定 caspase-3活性。結(jié)果隨著β-欖香烯濃度的增加，人食管癌細(xì)胞增殖活力逐漸下降，呈濃度依賴(lài)性(P<0.05)。以50 μg/ml β-欖香烯處理細(xì)胞 0、6、12、24 h，隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖活力下降，呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性(P<0.05)。相比對(duì)照組，50 μg/ml β-欖香烯處理細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05)，caspase-3活性明顯增加(P<0.05)。結(jié)論β-欖香烯可抑制食管癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡，并且其誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制可能與促進(jìn)caspase-3活化有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】β-欖香烯；人食管癌細(xì)胞；增殖；凋亡

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:202～204)

食管癌為我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，在我國(guó)全部惡性腫瘤中，其發(fā)病率和死亡率分別占第4位和第2位[1]。β-欖香烯是從中藥莪術(shù)中提取出來(lái)的二類(lèi)抗癌新藥，具有抗癌活性。也有較多研究[2-3]表明欖香烯對(duì)諸多腫瘤有抗癌效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用β-欖香烯對(duì)食管癌細(xì)胞的干預(yù)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及caspase-3活性的影響。

1材料與方法

1.1　材料

食管癌細(xì)胞株(EC9706)購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司，β-欖香烯購(gòu)自大連金港制藥有限公司；完全培養(yǎng)基采用DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素100 U/L、鏈霉素100 U/L(美國(guó)Gibco)；CCK-8試劑盒(東京同仁化學(xué))；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基)；caspase-3分光光度法測(cè)試劑盒(南京凱基)。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將食管癌細(xì)胞置于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2及飽和濕度。貼壁生長(zhǎng)至融合狀態(tài)，用0.25%胰蛋白酶0.53 mmol/L EDTA 消化，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行傳代。將細(xì)胞以 104個(gè)/ml接種在6孔板，細(xì)胞貼壁融合達(dá)70～80%時(shí)，更換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液同步化24 h。每次實(shí)驗(yàn)均采用同一代細(xì)胞，不同批次細(xì)胞重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.2不同濃度β-欖香烯處理細(xì)胞24 h后細(xì)胞增殖活力測(cè)定將細(xì)胞隨機(jī)分組：分別用含0、10、20、30、40、50 μg/ml的β-欖香烯加入培養(yǎng)基中，處理細(xì)胞24 h，96孔板中每孔加入CCK-8 20 μl,繼續(xù)在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下孵育4 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值，測(cè)定細(xì)胞增殖活力。

1.2.350 μg/ml的β-欖香烯處理細(xì)胞0、6、12、24 h后細(xì)胞增殖活力測(cè)定將細(xì)胞隨機(jī)分組：分別用含50 μg/ml的β-欖香烯加入培養(yǎng)基中，處理細(xì)胞0、6、12、24 h，96孔板中每孔加入CCK-8 20 μl,繼續(xù)在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下孵育4 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值，測(cè)定細(xì)胞增殖活力。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡以不含β-欖香烯的培養(yǎng)基處理組作為對(duì)照組。選取50 μg/ml的β-欖香烯加入培養(yǎng)基中，處理細(xì)胞24 h，0.25%胰酶(無(wú)EDTA)消化并收集細(xì)胞，PBS洗滌，Annexin Ⅴ/PI 染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5caspase-3活化程度的檢測(cè)細(xì)胞分組同1.2.4，干預(yù) 24 h，冰上裂解細(xì)胞,吸取50 μl含100～200 μg蛋白的細(xì)胞裂解液，加入Reaction Buffer、caspase-3 Substrate，避光孵育4 h。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)400 nm測(cè)定各組吸光值(OD值)，通過(guò)各組OD值/健康人血清組OD值的倍數(shù)來(lái)確定各組caspase-3活化程度。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1　不同濃度β-欖香烯處理細(xì)胞24 h后對(duì)細(xì)胞增殖

活力的影響

與0 μg/ml組OD值(2.34±0.46)比較，10、20、30、40、50 μg/ml組細(xì)胞增殖活力下降(OD值分別2.16±0.37、1.76±0.54、1.57±0.29、1.28±0.35、0.80±0.19)，并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

a為與0 μg/ml組比較，P<0.01;b為與50 μg/ml組比較，P<0.01。

2.2　50 μg/ml β-欖香烯處理細(xì)胞0、6、12、24 h后對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響

和0 h組OD值(2.46±0.18)比較,6、12、24 h組細(xì)胞增殖活力下降(OD值分別為1.48±0.46、1.27±0.35、0.74±0.24)，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

a為與0 μg/ml組比較，P<0.01。

2.3　50 μg/ml β-欖香烯處理細(xì)胞24 h時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組(0 μg/ml β-欖香烯)凋亡率[(1.21±0.59)%]比較，50 μg/ml β-欖香烯處理細(xì)胞24 h，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[凋亡率(16.21±0.32)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3　0、50 μg/ml β-欖香烯處理細(xì)胞24 h，對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.4　50 μg/ml β-欖香烯處理細(xì)胞24 h時(shí)對(duì) caspase-3活性的影響

與對(duì)照組(0 μg/ml β-欖香烯)相比，50 μg/ml β-欖香烯處理細(xì)胞24 h可明顯增加caspase-3活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4　0、50 μg/ml β-欖香烯處理細(xì)胞24 h，對(duì)細(xì)胞

3討論

欖香烯(1-甲基-1-乙烯基-2,4-異丙烯基-環(huán)己烷)提取自姜科植物莪術(shù)，這是一種新型的抗癌藥。欖香烯提取物是一種混合物，含有β-、δ-和γ-欖香烯，其中β-欖香烯是主要成分，在3種亞型中占60%～72%。在我國(guó)，欖香烯已經(jīng)在治療白血病以及腦部、乳腺、胸部、肝臟和其他組織的癌癥中顯示出療效[4]。作為一種抗癌藥，β-欖香烯的主要優(yōu)勢(shì)包括：對(duì)于許多類(lèi)型的癌癥具有廣譜抗癌效果，包括耐藥腫瘤，它不會(huì)導(dǎo)致多重藥物耐藥性，而且能夠逆轉(zhuǎn)對(duì)其他藥物產(chǎn)生的耐藥性并且毒性低。

已有大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)該藥對(duì)多種癌細(xì)胞有顯著的抑殺作用，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化，通過(guò)癌細(xì)胞S、G2、M 期調(diào)控點(diǎn)，阻滯S期細(xì)胞進(jìn)入G2、M 期。該藥不同于傳統(tǒng)的化療藥物之處：其無(wú)骨髓毒性，亦可提高機(jī)體免疫功能，升高白細(xì)胞數(shù)量，屬非細(xì)胞毒抗腫瘤藥[5]。與化療藥物聯(lián)合使用具有增敏減毒、提高患者生活質(zhì)量以及不良反應(yīng)輕微等顯著特點(diǎn)[6]。本研究顯示，β-欖香烯可以抑制食管癌細(xì)胞的增殖，并且其抑制作用與劑量、作用時(shí)間相關(guān)，呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。

細(xì)胞凋亡異常是多種疾病產(chǎn)生的發(fā)病機(jī)制，通常見(jiàn)于腫瘤、自身免疫疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管系統(tǒng)疾病等。腫瘤是一種細(xì)胞增殖和死亡均發(fā)生了異常的疾病，細(xì)胞凋亡不僅在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中有重要意義,而且化療、放療和生物治療的原理就是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)治療腫瘤的[7]。本研究結(jié)果提示：相比正常對(duì)照組，β-欖香烯可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡。

caspase蛋白酶家族屬于天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶,在機(jī)體細(xì)胞獲得凋亡信號(hào)后,caspase通過(guò)結(jié)合特異的輔因子而被激活,后經(jīng)一系列的切割,效應(yīng)caspase最終被激活,將其它酶蛋白作為級(jí)聯(lián)切割底物并引發(fā)細(xì)胞凋亡[8]。caspase-3是參與細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制，可通過(guò)與眾多蛋白因子的相互作用調(diào)控細(xì)胞凋亡[8]，它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段標(biāo)志[9]。caspase-3的表達(dá)不但反映了細(xì)胞凋亡水平，而且證明了凋亡啟動(dòng)因素的存在。本研究結(jié)果提示，β-欖香烯可促進(jìn)食管癌細(xì)胞caspase-3活化，這也可能是β-欖香烯誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

總之，本研究表明,β-欖香烯可抑制食管癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡，并且其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能與其促進(jìn)caspase-3活化有關(guān)。

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(編輯：甘艷)

Effect of β-elemene on Proliferation，Apoptosis and Activity of Caspase-3 of the Human Esophageal Carcinoma Cell EC9706

RENLingyan，XULei,ZHAOQing,etal.No.454HospitalofPLA,Nanjing,210000

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of β-elemene on the proliferation and apoptosis of human esophageal carcinoma cell EC9706,and to explore the possible mechanisms of apoptosis induced by β-elemene.MethodsHuman esophageal carcinoma cell EC9706 were incubated in vitro.Cells were treated with different concentrations of β-elemene (0、10、20、30、40、50 μg/ml)for 24 h or treated with 50 μg/ml β-elemene for 0,6,12 and 24 h,and the proliferation of EC9706 cells was evaluated by CCK-8.EC9706 cells were treated with 50 μg/ml β-elemene for 24 h.The apoptosis were tested by flow cytometry and the activity of caspase-3 was measured by spectrophotometry.ResultsThe proliferation of EC9706 cells was inhibited in the β-elemene in a certain range of concerntration(0~50 μg/ml).With the increase of β-elemene concerntration,the proliferation of EC9706 cells was inhibited in a concerntration-dependent manner (P<0.05) .Compared with EC9706 cells treated in 0 hours,the proliferation of EC9706 cells was significantly decreased in 6，12 and 24 hours(P<0.05).The apoptosis rate was greater when EC9706 cells were incubated in 50 μg/ml β-elemene for 24 h than that in 0 μg/ml β-elemene (P<0.05).At the meantime,the activity of caspase-3 in EC9706 cells was upregulated by β-elemene.ConclusionThe proliferation of EC9706 cells is inhibited by β-elemene in the concerntration-dependent and time-dependent manner.β-elemene induced apoptosis of EC9706 cells,which might be due to the activation of caspase-3.

【Key words】β-elemene;Human esophageal carcinoma cell;Proliferation;Apoptosis

(收稿日期2015-03-18修回日期 2015-09-22)

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)02-0202-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.02.008

通訊作者：趙怡