朱紅林， 徐 靖， 陳健曉， 王效寧

(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所， 農(nóng)業(yè)部作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制海南科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站， 海南省農(nóng)作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 ?？?571100)

蘆筍全雄試管苗的繁育技術(shù)

朱紅林， 徐 靖， 陳健曉， 王效寧*

(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所， 農(nóng)業(yè)部作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制海南科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站， 海南省農(nóng)作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 ?？?571100)

為給蘆筍全雄試管苗的規(guī)?；a(chǎn)提供可靠的技術(shù)途徑，以大田蘆筍莖段為外植體，采用組織培養(yǎng)的方法，研究建立蘆筍全雄試管苗繁育技術(shù)。結(jié)果表明：0.1%升汞溶液消毒8 min最佳，外植體污染率為0，成活率達(dá)100%；以MS為基本培養(yǎng)基，6-BA濃度為0.4 mg/L時(shí)，外植體芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)100%；6-BA和NAA配合使用，繼代增殖最佳，繁殖周期為30 d，增殖系數(shù)為5.88；以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加1.0 mg/L IBA、0.1 mg/L NAA、1.0 mg/L PP333和15 mg/L Spm時(shí)，生根率為86.67%，根多、長、粗壯，且有須根，利于煉苗移栽成活。

蘆筍； 全雄； 試管苗； 繁育技術(shù)

蘆筍(Asparagusofficinalis)屬百合科天門冬屬多年生草本宿根植物，又稱石刁柏、龍須菜，是一種低熱量高營養(yǎng)的保健蔬菜，被譽(yù)為世界十大名菜之一，享有蔬菜之王的美稱，同時(shí)其又對(duì)高血壓、心臟病、癌癥有特殊的療效[1-2]。由于其食用和藥用價(jià)值俱佳，在歐美各國、日本、東南亞等國際市場(chǎng)中已成為不可替代的高級(jí)營養(yǎng)蔬菜和保健食品，市場(chǎng)需求日益增加，供不應(yīng)求[3]。蘆筍雌雄異株，在一般情況下(常規(guī)種大田內(nèi))，雌雄株各占1/2，而雄株產(chǎn)量一般比雌株產(chǎn)量高20%～30%，但蘆筍種子生產(chǎn)困難，成本高，蘆筍種苗的缺乏限制我國蘆筍產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在蘆筍組織培養(yǎng)方面進(jìn)行了諸多研究，并取得了較大發(fā)展，但蘆筍組培試管苗生根難、生根率不穩(wěn)定和移栽成活率低仍是蘆筍試管苗實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的制約因素[5-7]，仍需進(jìn)一步研究。因此，筆者擬在前人研究的基礎(chǔ)上，通過生根培養(yǎng)基中加入多效唑(PP333)和精胺(Spm)，探索建立高效的蘆筍全雄試管苗高效快繁技術(shù)，以期解決蘆筍優(yōu)質(zhì)種苗缺乏問題，為蘆筍產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

20株格雷斯綠蘆筍雄株由東方光華現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供。

1.2 外植體消毒及接種

于晴天午后，選取20～25 cm莖，取其頂上約15 cm段。在超凈工作臺(tái)上用75%酒精消毒30 s，選用1%NaClO溶液振蕩浸泡消毒時(shí)間設(shè)為10 min、13 min、15 min和17 min 4個(gè)處理；用0.1% HgCl2溶液振蕩浸泡消毒，時(shí)間設(shè)為6 min、8 min、10 min和12 min 4個(gè)處理，無菌水沖洗5遍。將消毒的外植體切成約1.5～2.0 cm長的單節(jié)莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(圖示A)，15 d后，統(tǒng)計(jì)污染率和存活率。

污染率=(污染外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%。

存活率=(存活的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%

1.3 培養(yǎng)條件的設(shè)計(jì)

1.3.1 誘導(dǎo)培養(yǎng) 以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加6-BA 0、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L和1.5 mg/L 5個(gè)濃度水平，每瓶接種4 個(gè)外植體，每處理接種10瓶。接種30 d后統(tǒng)計(jì)莖段芽誘導(dǎo)率，其間觀察誘導(dǎo)出芽的生長狀況(圖示B)。

1.3.2 繼代增殖培養(yǎng) 經(jīng)誘導(dǎo)長出的嫩莖新梢切成單節(jié)莖段，接種到以MS為基本培養(yǎng)基、分別添加不同濃度6-BA(0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L和0.6 mg/L)和NAA(0、0.05 mg/L、0.1 mg/L和0.2 mg/L)的培養(yǎng)基中，共16個(gè)處理，每個(gè)處理5瓶，每瓶5個(gè)單節(jié)莖段，培養(yǎng)30 d后記錄生長情況，并統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽數(shù)，計(jì)算繁殖系數(shù)(圖示C)。

1.3.3 生根培養(yǎng) 切取增殖培養(yǎng)所得芽頂部長約1 cm(圖示D)，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基的確定分兩步：第一步，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)3因素4水平的正交試驗(yàn)：IBA(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5mg/L和2.0 mg/L)、KT(0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L和0.5 mg/L)、PP333(0、1.0 mg/L、2.0 mg/L和3.0 mg/L)，共16個(gè)處理，每個(gè)處理15瓶，每瓶3株，觀察記錄根生長情況，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率，確定IBA、KT、PP333的最佳組合濃度；第二步，第一步中確定的最佳組合濃度培養(yǎng)基中分別添加Spm 0、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L和20 mg/L 5個(gè)濃度水平，每個(gè)處理15瓶，每瓶3株，觀察記錄開始生根天數(shù)及根生長情況，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率(圖示E)。

1.3.4 共同培養(yǎng)條件 誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)基中添加白砂糖30 g/L，生根培養(yǎng)基中加白砂糖20 g/L，卡拉膠均為6.0 g/L，培養(yǎng)基pH 5.8。培養(yǎng)溫度(28±1)℃，光照10 h/d，光照強(qiáng)度為2 000 lx以上。

注：A為外植體，B為外植體誘導(dǎo)出芽，C為莖段增值叢生芽，D為生根培養(yǎng)，E為組培苗生根。

Note: A, explants; B, buds induced from explants; C, multiple shoot from stem segments; D, rooting culture; E, rooting of tissue culture seedling.

圖示 筍全雄試管苗繁育植株形態(tài)

Fig. Plant morphology bred by all-male tube seedlings ofA.officinalis

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2007 數(shù)據(jù)分析庫進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑各消毒時(shí)間對(duì)蘆薈全雄試管苗的消毒效果

不同的消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)外植體消毒效果有較大的差別，同一種消毒劑，隨著消毒時(shí)間的延長污染率降低，但對(duì)外植體的損傷越大(表1)。短時(shí)間內(nèi)，0.1%HgCl2溶液的消毒效果比1%NaCIO溶液的消毒效果好。但0.1%HgCl2溶液對(duì)幼嫩莖段的損傷較大，莖尖長約3 cm的幼嫩莖段在用0.1%HgCl2溶液消毒8 min時(shí)，存活率≤20%。減少0.1%HgCl2溶液的消毒時(shí)間至6 min，莖尖和莖段出現(xiàn)嚴(yán)重污染。綜合考慮污染率和存活率，外植體的最佳取材為莖尖3 cm以下長約12 cm的莖段，最佳消毒方案為0.1%HgCl2溶液消毒8 min，存活率達(dá)100%。

2.2 不同濃度6-BA 處理蘆筍全雄試管苗的芽生長情況

從表2看出，接種培養(yǎng)7 d后，外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上直接從莖節(jié)處分化出芽點(diǎn)。6-BA 對(duì)蘆筍莖段芽誘導(dǎo)影響較大，當(dāng)培養(yǎng)基中不加6-BA時(shí)，芽誘導(dǎo)率僅為7.5%；而當(dāng)6-BA濃度為0.4 mg/L時(shí)，外植體100%誘導(dǎo)出芽，芽生長快而粗壯；6-BA濃度繼續(xù)升高，芽誘導(dǎo)率反而下降，出現(xiàn)黃化、玻璃花芽；當(dāng)6-BA濃度達(dá)1.5 mg/L時(shí)，只有愈傷組織，不分化芽。

表1 不同消毒劑各消毒時(shí)間對(duì)蘆筍全雄試管苗的消毒效果

表2 不同濃度6-BA 處理蘆筍全雄試管苗芽的生長情況

2.3 不同激素組合處理蘆筍全雄試管苗根與芽的增殖

2.3.1 根誘導(dǎo) 由表3數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析，IBA、KT和PP3333個(gè)因子對(duì)蘆筍莖尖根誘導(dǎo)的影響均達(dá)顯著水平，其中IBA影響作用大于KT和PP333，三者的相互作用對(duì)根誘導(dǎo)的影響顯著，適宜的配比，根誘導(dǎo)的效果最好。經(jīng)多重比較，IBA 1.0 mg/L與0.5 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L差異顯著，當(dāng)IBA濃度為1.0 mg/L 時(shí)，NAA 0.1 mg/L與0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L的差異也達(dá)顯著水平，當(dāng)IBA濃度為1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L時(shí)，PP3331.0 mg/L與0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L的差異也達(dá)顯著水平。IBA1.0 mg/L與NAA 0.10 mg/L、PP3331.0 mg/L三者配合，根誘導(dǎo)率最大，根系生長狀況也最好。

表3 不同激素組合處理蘆筍全雄試管苗根的分化情況

注:同列中不同字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)(下同)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicated 5% significant level. The same below.

2.3.2 牙增殖 從表4可看出，單節(jié)莖段在16種激素組合處理中的增殖系數(shù)差異顯著，最高達(dá)5.88，最低只有0.2。6-BA濃度低于或高于0.4 mg/L時(shí)，叢生芽增殖系數(shù)都較低，差異顯著。說明，較低和較高濃度的6-BA對(duì)叢生芽的增殖效果均不理想。經(jīng)對(duì)各處理的增殖系數(shù)進(jìn)行方差分析，6-BA和NAA對(duì)叢生芽增殖的影響均達(dá)顯著差異水平，其中6-BA對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)影響作用大于NAA；6-BA和NAA的相互作用對(duì)叢生芽增殖的影響達(dá)顯著差異水平，兩者適宜的配比，叢生芽的增殖效果最好。經(jīng)多重比較，6-BA 0.4 mg/L與0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.6 mg/L差異顯著，當(dāng)6-BA濃度為0.4 mg/L 時(shí)，NAA 0.1 mg/L與0、0.05 mg/L、0.20 mg/L的差異也達(dá)顯著水平，6-BA 0.4 mg/L與NAA 0.10 mg/L兩者配合，叢生芽的增殖系數(shù)最大，生長狀況也最好。

表4 不同激素組合處理蘆筍全雄試管苗的芽增殖情況

2.4 不同濃度精胺(Spm)處理蘆筍全雄試管苗的根生長情況

從表5可看出，在5種不同處理中，試管苗在株高上無顯著性差異，根誘導(dǎo)率、根數(shù)量、根長度和根平均直徑均存在差異顯著。隨著Spm濃度的升高，根誘導(dǎo)率呈先上升后下降趨勢(shì)，Spm濃度為15 mg/L時(shí)，根誘導(dǎo)率最高，達(dá)80.67%。同時(shí)，根數(shù)量最多、最長、最粗壯，且有須根，根質(zhì)最佳，利于煉苗移栽。

表5 不同Spm 濃度處理蘆筍全雄試管苗的根分化情況

3 結(jié)論與討論

1) 建立了蘆筍全雄試管苗高效繁育技術(shù)。于晴天午后，剪取雄蘆筍植株莖段作外植體，用0.1%升汞溶液消毒8 min，接種于培養(yǎng)基MS+ 6-BA0.4 mg/L +白糖30 g/L +卡拉膠6.0 g/L(pH 5.8)中誘導(dǎo)，再將誘導(dǎo)的芽切割成單節(jié)莖段置于培養(yǎng)基MS+6-BA 0.4 mg/L +NAA 0.1 mg/L +30 g/L白糖+6.0 g/L卡拉膠(pH 5.8)中繼代增殖，30 d后，切取增殖培養(yǎng)所得芽頂部約1 cm長，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA1.0 mg/L + NAA0.1 mg/L + PP3331.0 mg/L + Spm 15 mg/L+白糖20 g/L +卡拉膠6.0 g/L(pH=5.8)中(其余莖段置于增殖培養(yǎng)基培養(yǎng))。外植體芽誘導(dǎo)率為100%，繼代增殖繁殖周期為30 d，增殖系數(shù)平均5.88，生根率86.67%。

2) 多效唑(PP333)是一種植物生長延緩劑，能控長矮化，提高葉綠素含量，增強(qiáng)植物抗逆性。PP333主要是通過阻礙貝殼杉烯向異貝殼杉烯酸的氧化，抑制赤霉素的生物合成發(fā)揮生理效應(yīng)[8]。在植物組織培養(yǎng)中，適當(dāng)濃度的多效唑均有利于植物愈傷組織的誘導(dǎo)、芽增殖、壯苗和生根等方面[9]。本研究結(jié)果顯示，1.0 mg/L PP333有利于提高蘆筍組培苗的生根率，改善根質(zhì)，并促使壯苗。

精胺(spermine, Spm )是一種普遍存在于植物體內(nèi)，對(duì)植物生長發(fā)育有廣泛影響的多胺類化合物，許多研究表明，精胺對(duì)促進(jìn)植物細(xì)胞分化、加速莖(芽)和根的生長有重要作用[10]。楊洪強(qiáng)等[11]研究證實(shí)，外源Spm可增加蘋果幼苗新根數(shù)量；Hummel等[12]研究發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)根系中內(nèi)源Spm含量在0.1 μmol/L時(shí)，對(duì)根的長度影響最大；鄒英寧等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Spm濃度為1 mmol/L時(shí)有利于金柑組培苗植株生長和根系生長。本研究結(jié)果表明，生根培養(yǎng)基中加入15 mg/L Spm，可促進(jìn)蘆筍組培苗發(fā)根早、根多粗壯，且有須根，利于煉苗移栽。Spm促進(jìn)植株生長和根系的形態(tài)可能與其提高植物組織內(nèi)碳水化合物的含量關(guān)系密切，但其關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。

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(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Propagation Technique of All-male Tissue Culture ofAsparagusofficinalis

ZHU Honglin, XU Jing, CHEN Jianxiao, WANG Xiaoning*

(CerealCropResearchInstitute,HainanAcademyofAgriculturalSciences/ScientificObservationstationofHainanforCropGeneResourcesandGermplasmInnovation,MinistryofAgriculture,Haikou,Hainan571100,China)

To offer a credible way for seedling mass production of all-maleA.officinalis, stem segments from fieldA.officinaliswere cultured to establish a rapid propagation technique system. Results:0.1% HgCl2solution for eight minutes made a good effect, the contamination rate was 0, the survival rate was 100%; When the 6-BA concentration was 0.4 mg/L, in the MS basic culture medium, the rate of bud induction was the highest, 100%; 6-BA combined with NAA made a good subculture multiplication, the reproductive cycle was 30 days, and the proliferation coefficient was 5.88. When 1.0 mg/L IBA, 0.1 mg/L NAA, 1.0 mg/L PP333and 15 mg/L Spm were added to the 1/2MS basic culture medium, the rooting rate was 86.67%, and roots were the longest and thickest with fibrous roots, which was suitable for transplanting of plantlets.

Asparagusofficinalis; all-male; tube seedling; propagation technique

2015-08-31； 2016-03-27修回

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“蘆筍全雄試管苗高效繁育技術(shù)研究”(314153)

朱紅林(1973-)，女，助理研究員，碩士，從事植物組織培養(yǎng)研究。E-mail:714420368@qq.com

*通訊作者：王效寧(1973-)，男，研究員，碩士，從事作物遺傳育種研究。E-mail:13368939015@163.com

1001-3601(2016)04-0151-0024-04

S644.6

A