路　蔓，龍　敏，劉　沖，陳　曦，王　琛，張惠中

(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院臨床實驗與檢驗科，陜西西安 710038)

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·論著·

鼠源性抗星形膠質(zhì)細胞上調(diào)基因1單克隆熒光抗體在惡性漿膜腔積液檢測中的應用*

路蔓，龍敏，劉沖，陳曦，王琛，張惠中

(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院臨床實驗與檢驗科，陜西西安 710038)

摘要:目的應用鼠源性抗星形膠質(zhì)細胞上調(diào)基因1(AEG-1)單克隆熒光抗體檢測惡性漿膜腔積液中的腫瘤細胞。方法應用PCR及Western-blot方法檢測漿膜腔積液脫落細胞中的AEG-1表達；用鼠源性抗AEG-1單克隆熒光抗體與惡性漿膜腔積液中的腫瘤細胞共孵育，同時采用良性病變的漿膜腔積液作為陰性對照。結(jié)果惡性漿膜腔積液脫落細胞中AEG-1表達呈陽性，而良性病變的漿膜腔積液脫落細胞中AEG-1表達為陰性或弱陽性；同時鼠源性抗AEG-1單克隆熒光抗體直接標記脫落細胞的結(jié)果與PCR和Western-blot檢測結(jié)果一致。結(jié)論鼠源性抗AEG-1單克隆熒光抗體為漿膜腔積液中的腫瘤細胞鑒定提供了新的實驗手段。

關(guān)鍵詞:鼠源性抗星形膠質(zhì)細胞上調(diào)基因1；單克隆抗體；熒光標記；漿膜腔積液

星形膠質(zhì)細胞上調(diào)基因1(AEG-1)是近年來發(fā)現(xiàn)的新的癌基因，Emdada等[1]于2009年對其做了進一步證實。該基因位于與多種惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的人類8號染色體(8q22)上，進一步研究表明其是促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個關(guān)鍵因子[2-3]。相關(guān)研究表明，AEG-1基因與多種惡性腫瘤，如肝細胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、食管癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。另有研究表明,人AEG-1基因的啟動子(-2710/+49)缺少TATA或CAAT盒，但含有多個Spl基序并富含GC序列，其中Spl基序可以與核因子-κB(NF-κB)相互作用，可能是AEG-1發(fā)揮功能的重要片段[5-6]?，F(xiàn)已證實AEG-1是Ras/PI3K/Akt/c-Myc信號轉(zhuǎn)導通路的下游靶分子，可以通過調(diào)控PI3K/Akt、NF-κB、Wnt/β-catenin、 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等多條信號途徑參與正常細胞轉(zhuǎn)化，腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，血管生成等多個腫瘤發(fā)生、發(fā)展的環(huán)節(jié)，并能介導腫瘤細胞自噬活性和化療耐藥。該基因?qū)Χ喾N惡性腫瘤的診斷和預后具有重要的臨床意義，可能成為腫瘤治療和抗癌藥物研發(fā)的新靶點。本實驗室前期通過雜交瘤技術(shù)獲得1株能穩(wěn)定分泌抗AEG-1單克隆抗體的雜交瘤細胞株(IE3)。本研究培養(yǎng)IE3細胞小鼠，腹腔內(nèi)注射制備腹水，提取并純化單克隆抗體，并用異硫氰酸熒光素(FITC)對單克隆抗體進行熒光標記。

1材料與方法

1.1標本來源收集臨床確診為惡性腫瘤，且常規(guī)中能查見大量異形有核細胞的漿膜腔積液，其中診斷為卵巢癌患者的腹水標本13份，診斷為肺癌并全身轉(zhuǎn)移患者的胸腔積液標本17份。并收集良性病變的漿膜腔積液作為陰性對照，其中診斷為肝硬化患者的腹水標本22份，診斷為心力衰竭患者的胸腔積液標本8份。

1.2儀器與試劑2720型PCR儀由美國基因泰克工程技術(shù)公司提供，DYY-8C雙穩(wěn)定時電泳儀、DYCP-40C半干式碳板轉(zhuǎn)移槽由北京六一生物科技有限公司提供，凝膠圖像分析儀由美國阿爾法科技有限公司提供，UBR4型干浴器由Grant Brother公司提供，BCD-628WACW冰箱由海爾公司提供，超凈工作臺由富康公司提供，生化培養(yǎng)箱由重慶永生實驗儀器廠提供。DNA標記物由西安潤德公司生物技術(shù)有限公司提供；Protein標記物由美國Thermo scientific公司提供；山羊抗小鼠二抗由中山生物技術(shù)有限公司提供；FITC及二甲基亞砜(DMSO)由美國Sigma公司提供；RNAiso Plus及反轉(zhuǎn)錄試劑盒由日本TaKaRa公司提供；氯仿、異丙醇、75%乙醇由天津市津北精細化工有限公司提供。

1.3檢測方法

1.3.1AEG-1蛋白檢測收集胸腔積液及腹水細胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR檢測AEG-1。(1)收集漿膜腔積液中的細胞提取RNA。①將胸腔積液及腹水離心收集細胞，3 000 r/min離心10 min，棄上清。②收集細胞，移入1.5 mL離心管中，加入1 mL RNAiso Plus，混勻放置10 min。③加入200 μL氯仿，震蕩混勻15 s以上，室溫放置5 min，離心(4 ℃，14 000 r/min，10 min)。④離心后液體分層，上層無色液體含RNA，小心吸取上層無色液體移入新的1.5 mL離心管中。⑤加入等體積異丙醇，混勻，15～30 ℃下孵育10～30 min，離心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)。⑥去上清，沉淀加入75%乙醇1 mL，震蕩30 s,離心(4 ℃，7 500 r/min，5 min)。⑦小心去上清，管內(nèi)沉淀在超凈臺中鼓風干燥3～5 min。⑧加入20 μL焦磷酸二乙酯(DEPC)水溶液溶解沉淀。(2)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄20 μL體系為：提取細胞的RNA模板2 μL、5×prime script 4 μL、ddH2O 14 μL。PCR擴增:37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ ∞。(3) PCR檢測AEG-1蛋白。Mix 20 μL體系為：2×Taq Mix 10 μL、ddH2O 8 μL、引物異黏蛋白(MTDH)1 μL、模板cDNA 1 μL。

1.3.2Western-blot檢測細胞蛋白(1)收集漿膜腔積液中的脫落細胞提取蛋白。①將胸腔積液及腹水離心收集細胞，用磷酸鹽緩沖液清洗一遍。②加入200 μL細胞裂解液、2 μL DMSO，4 ℃搖床30 min裂解細胞。③離心(4 ℃，14 000 r/min，15 min)，取上清。(2)Western-blot檢測細胞蛋白。將漿膜腔積液細胞裂解蛋白上樣，用純化后的抗AEG-1單克隆抗體作為一抗(1∶500稀釋)，用山羊抗小鼠作為二抗(1∶5 000稀釋)。

1.3.3鼠源性抗AEG-1單克隆熒光抗體檢測惡性漿膜腔積液中的腫瘤細胞(1)取新鮮抽取的漿膜腔積液1 mL，加入2 μL鼠源性抗AEG-1單克隆熒光抗體(1∶500稀釋)。(2)37 ℃避光搖床100 r/min反應30 min。(3)用磷酸鹽緩沖液離心(1 200 r/min，5 min)清洗3遍，除去未結(jié)合上的熒光單克隆抗體。(4)壓片，熒光顯微鏡鏡檢。

2結(jié)果

2.1病理科脫落細胞檢測卵巢癌及肺癌患者漿膜腔積液的脫落細胞中查見腫瘤細胞。

2.2PCR檢測AEG-1表達收集漿膜腔積液中的細胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR檢測AEG-1，見圖1。惡性漿膜腔積液脫落細胞中AEG-1呈陽性，而良性病變的漿膜腔積液脫落細胞中AEG-1呈陰性或弱陽性。

1、6：肝硬化腹水β-actin、AEG-1結(jié)果；2、7：心力衰竭胸腔積液β-actin、AEG-1結(jié)果；3、8：卵巢癌腹水β-actin、AEG-1結(jié)果；4、9：肺癌胸腔積液β-actin、AEG-1結(jié)果；M:蛋白標記物。

圖1PCR檢測AEG-1表達

2.3Western-blot檢測漿膜腔積液細胞AEG-1表達細胞蛋白檢測結(jié)果見圖2。惡性漿膜腔積液脫落細胞中AEG-1呈陽性，而良性病變的漿膜腔積液脫落細胞中AEG-1呈陰性或弱陽性，與PCR的檢測結(jié)果一致。

1:肝硬化腹水細胞裂解蛋白；2:心力衰竭胸腔積液細胞裂解蛋白；3:卵巢癌腹水細胞裂解蛋白；4:肺癌胸腔積液細胞裂解蛋白；B：對應4種細胞的β-actin結(jié)果。

圖2Western-blot檢測細胞蛋白

2.4漿膜腔積液中的異形有核細胞鼠源性抗AEG-1單克隆熒光抗體檢測漿膜腔積液中的異形有核細胞結(jié)果見圖3～4(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。在惡性漿膜腔積液中，F(xiàn)ITC標記的抗AEG-1單克隆抗體可與脫落的腫瘤細胞膜表面的AEG-1特異性結(jié)合，而在良性病變的漿膜腔積液中呈陰性?？笰EG-1單克隆熒光抗體直接標記脫落細胞的結(jié)果與PCR和Western-blot檢測結(jié)果一致。

3討論

AEG-1是近年來發(fā)現(xiàn)的新的癌基因。到目前為止的惡性腫瘤研究中，AEG-1表達于多種相關(guān)組織惡性腫瘤，包括肝細胞癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、腎癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、食管鱗狀細胞癌(ESSC)、黑色素瘤、多形性膠質(zhì)瘤(GBM)等，但其在正常組織和良性病變中表達不明顯[7-11]。對比分析癌組織和良性病變組織，已經(jīng)確定AEG-1是一項潛在的診斷癌癥及判斷預后的指標。漿膜腔積液是在疾病情況下，胸腔、腹腔或心包腔內(nèi)集聚的過多液體的總稱，是一種常見的臨床現(xiàn)象。最常見病因為惡性腫瘤(31.3%)，其次為結(jié)締組織疾病、結(jié)核、肝硬化、心功能不全等。由于AEG-1是一個在大多數(shù)惡性腫瘤中均表達的基礎性癌基因，因此檢測脫落細胞的AEG-1即可辨別漿膜腔積液的性質(zhì)，且具有很高的特異度。

雜交瘤技術(shù)是將經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞(SP-20)在體外融合在一起，融合后的雜交瘤細胞兼有骨髓瘤細胞無限繁殖和脾細胞分泌抗體的能力。這種細胞通過克隆化即可成為單克隆系，能產(chǎn)生大量針對同一抗原決定簇的抗體，這種抗體就稱為單克隆抗體。與多克隆抗體相比，單克隆抗體的特點是理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強，性質(zhì)穩(wěn)定，且便于人為處理和質(zhì)量控制，這些優(yōu)點使它一問世就受到高度重視。目前為止，人們已經(jīng)研究出各種單克隆抗體，其應用已經(jīng)涉及醫(yī)學、食品、農(nóng)業(yè)、衛(wèi)生、環(huán)境等眾多領域，單抗藥物的開發(fā)已經(jīng)成為生物醫(yī)學的新熱點。單克隆抗體廣泛用于基礎研究，疾病的診斷治療、預防，環(huán)境與食品衛(wèi)生的檢測，提純蛋白，優(yōu)生優(yōu)育，而且隨著單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展，將出現(xiàn)更加廣闊的前景。

本研究將鼠源性抗AEG-1單克隆抗體FITC標記可放大信號，有利于臨床檢測。在惡性漿膜腔積液中，F(xiàn)ITC標記的抗AEG-1單克隆抗體可與脫落的腫瘤細胞膜表面的AEG-1特異性結(jié)合，而在良性病變的積液中呈陰性，結(jié)

果提示，該熒光標記抗體具有腫瘤特異性，可為臨床惡性漿膜腔積液的早期診斷提供一定的理論基礎。

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Application of mouse anti AEG-1 monoclonal fluorescent antibody in malignant serous cavity effusions*

LuMan,LongMin,LiuChong,ChenXi,WangChen,ZhangHuizhong

(DepartmentofClinicalExperimentandLaboratory,TangduHospitalofFourth

MilitaryMedicalUniversity,Xi′an,Shaanxi710038,China)

Abstract:ObjectiveTo use mouse astrocytes elevated gene-1(AEG-1) monoclonal fluorescent antibody for detecting tumor cells in malignant serous cavity effusions.MethodsThe expression of AEG-1 in serous cavity effusion exfoliated cells by PCR and Western-blot;the mouse monoclonal anti-AEG-1 fluorescent antibody and tumor cells in malignant serous cavity effusions were co-incubated,meanwhile，the serous cavity effusions in benign lesions were taken as the negative control.ResultsThe AEG-1 expression was positive in malignant serous cavity effusions exfoliated cells,while which in benign lesion serous cavity effusion was negative or weakly positive;meanwhile the results of direct labelling in mouse anti AEG-1 monoclonal antibodies were consistent with the results by PCR and Western-blot.ConclusionMouse anti AEG-1 monoclonal fluorescence antibody can provide certain theoretical basis for the detection of tumor cells in serous cavity effusion.

Key words:mouse astrocytes elevated gene-1;monoclonal antibodies;fluorescently labeling;effusion

(收稿日期：2015-09-22)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.001

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)03-0289-03

作者簡介：路蔓，女，主管檢驗師，主要從事臨床檢驗基礎研究。

*基金項目：國家自然科學基金項目(81201525)。