盧麗琴，李　綱

(1.浙江省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江杭州 310014；2.上海復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院閔行分院腫瘤科，上海 201100)

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·論著·

358例肺癌患者K-ras基因的突變分析

盧麗琴1，李綱2△

(1.浙江省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江杭州 310014；2.上海復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院閔行分院腫瘤科，上海 201100)

摘要:目的分析358例肺癌患者K-ras基因突變的突變情況，為肺癌患者的個體化治療提供指導(dǎo)。方法通過嵌套和低變性溫度下的復(fù)合PCR(COLD-PCR)-測序法分析358例肺癌患者K-ras基因突變狀態(tài)。結(jié)果在358例肺癌患者中，K-ras基因總體突變率為8.10%。94份血漿標(biāo)本、250份腫瘤組織標(biāo)本、14份胸腔積液及腹水標(biāo)本中的突變率分別為2.13%、9.60%、7.14%。突變類型包括G12C、G12D、G12A、G12V、G13D、Q61H，3種不同標(biāo)本之間K-ras基因的突變率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.064 8)；男性與女性患者的突變率分別為6.96%、8.59%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.574 0)；30～<45歲、45～<60歲、大于或等于60歲患者中的突變率分別為4.76%、5.34%、9.22%，不同年齡段患者K-ras基因的突變率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.250 3)。結(jié)論肺癌患者K-ras基因突變類型主要為G12C、G12D、G12V、G13D，K-ras基因在不同標(biāo)本類型、不同性別、不同年齡之間的突變率無明顯差異。

關(guān)鍵詞:肺癌；K-ras基因；基因突變狀態(tài)

世界衛(wèi)生組織2014年報告指出，癌癥是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的首要原因，2012年有1 400萬新發(fā)癌癥病例，820萬人因癌癥死亡，新發(fā)病例數(shù)預(yù)計還將增加。2012年，男性發(fā)病率最高的是肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌和肝癌，女性發(fā)病率最高的是乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、宮頸癌和胃癌。肺癌是引起人類死亡最多的一種癌癥。世界新發(fā)病例中超過60%發(fā)生在非洲、亞洲和中南美洲，主要是由于吸煙、飲酒、不健康飲食和缺乏鍛煉所引起。

肺癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，后者占了80%，大部分確診的肺癌患者都處在晚期或已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移[1],化療是這部分患者可選的一種治療方法，但也只能增加幾個月的生存期[2]，表皮生長因子受體(EGFR)信號通路在細(xì)胞的增殖、生長、分化和遷移中發(fā)揮著重要的作用，這條通路的下游因子包括RAS/RAF/MAPK,編碼這條通路蛋白的基因突變可能都會影響到針對EGFR信號通路設(shè)計的靶向藥物的療效，因此，對這部分基因的檢測，就成為藥物能否使用的一個預(yù)測性生物標(biāo)記物[3-6]。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源358份臨床標(biāo)本來自全國上百家三級醫(yī)院358例肺癌患者，包括94份血漿標(biāo)本、250份組織標(biāo)本和14份胸腔積液及腹水標(biāo)本；其中來自男性230份，來自女性128份；來自30～<45歲患者21份，45～<60歲患者131份，≥60歲患者206份。所有參與本研究的肺癌患者或其家屬均簽署授權(quán)書，對上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行K-ras基因檢測知情同意。

1.2儀器與試劑離心機(jī)購自湘儀離心機(jī)儀器有限公司，PCR儀購自杭州博日科技有限公司，PCR產(chǎn)物序列測定由上海鼎安生物科技有限公司完成。DNA提取試劑盒購自Axygen Scientific Inc，Pfu酶購自上海申能博彩生物科技有限公司，dNTP購自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.3檢測方法(1)基因組DNA的提取按照試劑盒說明書進(jìn)行。(2)低變性溫度下的復(fù)合PCR(COLD-PCR)-測序法檢測K-ras基因突變狀態(tài)。用primer 5進(jìn)行引物設(shè)計，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，嵌套和COLD-PCR-測序法被用于檢測K-ras基因的突變。第1步進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,常規(guī)PCR反應(yīng)體系(10 μL)包括0.25 mmol/L的dNTP、0.5 μmol/L的引物、0.5單位的Taq DNA聚合酶和10 ng的模板DNA。PCR程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，接著進(jìn)行32個擴(kuò)增循環(huán)，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，然后72 ℃保持5 min。常規(guī)PCR方法被用于擴(kuò)增465 bp的大片段。所用引物為：正向5′-GTC GAT GGA GGA GTT TGT AAA TGA AGT-3′和反向 5′-TTC AGA TAA CTT AAC TTT CAG CAT AAT TAT CTT G-3′。第2步進(jìn)行COLD-PCR，COLD-PCR反應(yīng)體系(50 μL)包括：0.25 mmol/L的dNTP、0.5 μmol/L的引物、0.5單位的Taq DNA聚合酶和1 μL的大片段PCR產(chǎn)物。PCR程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；先進(jìn)行40個擴(kuò)增循環(huán)，80 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；隨后進(jìn)行15個擴(kuò)增循環(huán)，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；然后72 ℃，保持5 min。COLD-PCR方法用于擴(kuò)增155 bp的小片段。所用引物為：正向5′-GTC ACA TTT TCA TTA TTT TTA TTA TAA GG-3′和反向5′-TTT ACC TCT ATT GTT GGA TCA TAT TC-3′。第3步進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化測序，由上海鼎安生物科技有限公司完成。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物測序結(jié)果采用COLD-PCR-測序法檢測K-ras基因突變狀態(tài)，其代表性結(jié)果見圖1，顯示肺癌患者K-ras基因第13位密碼子由GGC突變?yōu)镚AC。

2.2不同標(biāo)本類型肺癌患者K-ras基因的突變情況本研究檢測了358例肺癌患者，K-ras基因總體突變率為8.10%。94份血漿標(biāo)本的突變率為2.13%，250份組織標(biāo)本的突變率為9.60%，14份胸腔積液及腹水標(biāo)本的突變率為7.14%，突變類型包括G12C、G12D、G12A、G12V、G13D、Q61H，3種不同標(biāo)本K-ras基因的突變率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.064 8)，見表1。

圖1　　對COLD-PCR產(chǎn)物測序的代表性圖譜

2.3不同性別肺癌患者K-ras基因的突變情況K-ras基因在230例男性患者中的突變率為6.96%，突變類型包括G12C、G12D、G12A、G12V、G13D，在128例女性患者中的突變率為8.59%，突變類型包括G12D、G12V、G13D、Q61H。不同性別K-ras基因的突變率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.574 0)，見表1。

2.4不同年齡群體肺癌患者K-ras基因的突變情況K-ras基因在21例30～<45歲患者中的突變率為4.76%，突變類型為G13D，131例45～<60歲患者中的突變率為5.34%，突變類型包括G12C、G12D、G12V、G13D，206例大于或等于60歲患者中的突變率為9.22%，突變類型包括G12C、G12D、G12A、G12V、G13D、Q61H。不同年齡段患者K-ras基因的突變率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.250 3)，見表1。

表1　　采用COLD-PCR-測序法檢測肺癌患者K-ras基因的突變頻率[n(%)]

-：無數(shù)據(jù)。

3討論

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移過程中釋放的中間產(chǎn)物，它有潛力為研究腫瘤的特征提供可用的生物活性物質(zhì)，從而監(jiān)測腫瘤的治療，CTCs能從血液中富集，并通過CellSearch?系統(tǒng)進(jìn)行計數(shù)，目前這種方法已經(jīng)被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于肺癌的相關(guān)檢測，判斷藥物反應(yīng)和療效[7-9]。但是CTCs最大的問題是如何有效地富集血液中的腫瘤細(xì)胞，由于患者個體差異較大，血液成分異常復(fù)雜，所含腫瘤細(xì)胞的比例也有很大差異，研究出一種普遍適用又高效的富集方法成為大家研究的熱點。

肺癌患者化療后的癌轉(zhuǎn)移是影響患者生存的一個重要原因，目前有研究認(rèn)為這種轉(zhuǎn)移是由于患者體內(nèi)還存在肺癌干細(xì)胞。如何識別、分離這些細(xì)胞，從而研究他們的遺傳和蛋白上的變化，開發(fā)出針對性的藥物成為將來研究的方向[10-11]。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者存在致癌基因突變，且以一種互斥的方式存在，這些癌基因包括EGFR、Kras、ALK、MET等[12]。這些致癌基因的突變有些能預(yù)測小分子酪氨酸激酶抑制劑靶向療法的療效[13-14]。所以，在確定一種給藥方案前，往往要同時檢測幾個基因的突變情況。本研究發(fā)現(xiàn)在Kras第12位密碼子中存在4種突變，包括G12C、G12D、G12A、G12V，在第13位密碼子中也存在2種突變，包括G13D、Q61H，這些不同的突變對藥物的療效是否有不同的影響，雖然已經(jīng)有些研究[15]，但還需要更多證據(jù)的支持。

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Analysis of K-ras gene mutation in 358 cases of lung cancer

LuLiqin1,LiGang2△

(1.DepartmentofOncology,ZhejiangProvincialPeople′sHospital,Hangzhou,Zhejiang310014,China;2.Department

ofOncology,MinhangBranchHospital,AffiliatedTumorHospitalofFudanUniversity,Shanghai201100,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the mutation situation of K-ras gene in 358 cases of lung cancer to provide the guidance for the personalized therapy of lung cancer.MethodsThe nested and low denatured temperature compound PCR(COLD-PCR) method was used to analyze the K-ras mutations situation in 358 patients with lung cancer.ResultsIn 358 lung cancer patients,the total mutation frequency of K-ras gene was 8.10%.The mutation rates were 2.13% in 94 plasma samples,9.60% in 250 tumor tissue samples and 7.14% in 14 pleural and ascites samples.The mutation types included G12C,G12D,G12A,G12V,G13D and Q61H,the mutation rate had no statistical difference among 3 kinds of samples (P=0.064 8);the mutation rate was 6.96% in male patients and 8.59% in female patients,the difference was not statistically significant(P=0.574 0);the mutation rates were 4.76% in the patients aged 30-<45 years old,5.34% in the patients aged 45-<60 years old and 9.22% in the patients aged ≥60 years old,the differences were not statistically significant (P=0.250 3).ConclusionThe mutation types of K-ras gene are mainly G12C,G12D,G12V and G13D.The mutation rate of K-ras gene has no significant differences among different types of sample,different genders and different ages.

Key words:lung cancer;K-ras;gene mutation status

(收稿日期：2015-09-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.013

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)03-0321-03

作者簡介：盧麗琴，女，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤治療方面的研究。△通訊作者，E-mail:13391071510@163.com。