胡慧瓊，劉　斌，王　紅，吳增輝

(1．湖北中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖北荊州 434020；2．湖北荊州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北荊州 434020)

?

·臨床研究·

類風(fēng)濕因子對酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和電化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測甲型肝炎IgM的影響探討

胡慧瓊1，劉斌2，王紅1，吳增輝1

(1．湖北中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖北荊州 434020；2．湖北荊州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北荊州 434020)

摘要:目的探討高濃度類風(fēng)濕因子(RF)對酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)檢測甲型肝炎病毒IgM 抗體(Anti-HAV IgM)的影響，為臨床明確診斷甲型肝炎提供依據(jù)。方法60例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者采用免疫比濁法檢測RF，用ELISA和ECLIA分別檢測Anti-HAV IgM，并比較RF吸附前后ELISA檢測Anti-HAV IgM的吸光度(OD)值的差異。結(jié)果60例RA患者血清中，2例確診甲型肝炎患者采用ELISA和ECLIA法均檢測出Anti-HAV IgM陽性，另58例ELISA法檢出Anti-HAV IgM陽性11例，陽性率18.96%(11/58)；ECLIA檢出Anti-HAV IgM陽性1例，陽性率1.72%(1/58)，明顯低于ELISA法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。將58例RA患者血清用純化的人IgG膠乳顆粒試劑吸附后重新進(jìn)行ELISA檢測，僅有2例陽性，吸附后的OD值較吸附前明顯降低 (P<0.05)。結(jié)論血清中高濃度RF會引起ELISA檢測Anti-HAV IgM的假陽性，而對ECLIA法檢測結(jié)果干擾較小。

關(guān)鍵詞:類風(fēng)濕因子；假陽性；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；甲型肝炎病毒IgM 抗體；電化學(xué)發(fā)光免疫分析

甲型肝炎病毒(HAV)是廣泛傳播的肝炎致病因子，它主要通過糞-口消化道途徑引起人類感染。血清HAV IgM 抗體(Anti-HAV IgM)是確定急性HAV感染的可靠指標(biāo)[1]，患者于發(fā)病后1～ 4周血清中即可檢出Anti-HAV IgM，3個月后滴度下降，6～8個月后不易查出。故凡Anti-HAV IgM陽性，特別是滴度較高時，常提示為急性HAV感染或復(fù)發(fā)，目前臨床上檢測Anti-HAV IgM的常用方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[2-3]。但在日常工作中發(fā)現(xiàn)，部分類風(fēng)濕因子(RF)陽性，尤其是濃度較高的患者，用此方法檢測Anti-HAV IgM時有假陽性出現(xiàn)。本研究通過對60例RF陽性患者分別用ELISA和電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)檢測Anti-HAV IgM，以進(jìn)一步探討RF對Anti-HAV IgM檢測的影響，為臨床明確診斷提供客觀依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料荊州市中心醫(yī)院住院和門診收治的60例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者，RF處于高濃度狀態(tài)，120～460 IU/mL，排除乙型肝炎、丙型肝炎，肝功能異常的患者，其中男27例，女33例，年齡18～75歲。所有患者均于清晨空腹抽取靜脈血2.0 mL，3 500 r/min離心，分離出血清后于-20 ℃ 保存到同批檢測。

1.2儀器與試劑RF檢測儀器為羅氏E601，RF羅氏原裝配套試劑盒；ELISA法檢出Anti-HAV IgM，酶標(biāo)儀為Thermo熱電Multiskan MK3，試劑盒由山東濰坊3V生物工程有限公司提供；ECLIA法檢出Anti-HAV IgM，儀器為羅氏E601，試劑為羅氏診斷甲型肝炎原裝配套試劑盒。

1.3檢測方法RF采用免疫比濁法定量檢測；Anti-HAV IgM分別采用ELISA和ECLIA法檢出。用純化的人IgG膠乳顆粒試劑50 μL吸附50 μL RF血清后混合，在37 ℃水浴反應(yīng)30 min后，10 000 r/min離心15 min取上清，進(jìn)行ELISA檢測Anti-HAV IgM。以上檢測均按試劑盒說明嚴(yán)格操作。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用配對χ2檢驗(yàn)。RF吸附前后ELISA檢測Anti-HAV IgM的結(jié)果采用配對t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1RF吸附前60例高濃度(120～460 IU/mL)RA患者中，2例患者ELISA和ECLIA試驗(yàn)均檢測出Anti-HAV IgM陽性，確診為甲型肝炎患者。另58例高濃度RA患者，ELISA檢出血清中Anti-HAV IgM陽性11例(OD≥0.15為陽性)，陰性47例，Anti-HAV IgM的陽性率為18.96%(11/58)；ECLIA檢測出Anti-HAV IgM陽性1例(標(biāo)本的Cut-off值大于或等于1為陽性)，陰性57例，Anti-HAV IgM的陽性率為1.72%(1/58)。在高濃度RF血清中，ECLIA檢測Anti-HAV IgM的陽性率明顯低于ELISA法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　　ELISA和ECLIA檢測 Anti-HAV IgM 的比較

*：P<0.05，與ECLIA法比較。

2.2RF吸附后60例高濃度RA患者中，除2例已經(jīng)確診甲型肝炎外，將其余58例高濃度RA患者的血清標(biāo)本用純化的人IgG膠乳顆粒試劑按1∶1的比例混合吸附后，用ELISA法檢測Anti-HAV IgM，RF吸附前ELISA 法檢測的11例陽性，其中有9例轉(zhuǎn)化為陰性，只有2例陽性，吸光度(OD)值分別為0.183、0.256，見表2。其中OD值為0.183的血清吸附RF前后ECLIA檢測都為陰性；OD值為0.256的血清吸附RF前后ECLIA檢測都為陽性。因此ELISA檢測高RF水平血清，假陽性率為15.51%，明顯高于ECLIA法0%。比較58例人IgG膠乳顆粒試劑吸附RF前后ELISA法檢測的OD值，吸附后的OD值明顯低于吸附前的OD值(t=3.716，P<0.05)。

表2　　11例RF吸附前后ELISA檢測的OD值

3討論

RA是一種病因未明的慢性、以炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性疾病。在臨床上RF主要用于診斷RA，其檢出率可達(dá)80%～90%。RA患者血清中RF呈持續(xù)陽性者和RF滴度呈高水平者，預(yù)后往往較差[4]。RF是針對IgG Fc片段上抗原表位的一類自身抗體，可分為IgM、IgA、IgG、IgD、IgE五型，其中IgM型占60%～78%，是臨床檢驗(yàn)中常規(guī)方法所檢出的主要類型。至今為止，世界范圍內(nèi)的HAV毒株被分為6個基因型Ⅰ～Ⅳ，但只有Ⅰ～Ⅲ型能感染人類[5]。據(jù)文獻(xiàn)報道RF陽性對于ELISA法檢測甲型肝炎與丙型肝炎IgM抗體均有干擾[6]。雖然由非特異性抗體引起的分析干擾的發(fā)生率近年來已經(jīng)明顯下降，但是所有的免疫檢出仍然存在假陽性和假陰性的可能性[7-8]。在日常工作中發(fā)現(xiàn)，部分RF陽性,尤其是濃度較高的患者，ELISA方法檢測Anti-HAV IgM時有假陽性出現(xiàn)。在本研究中，RF吸附前，58例RF高濃度患者中，ELISA檢出Anti-HAV IgM陽性11例，陽性率為18.96%(11/58)；11例高濃度RF血清標(biāo)本用純化的人IgG膠乳顆粒試劑吸附后(按1∶1的比例混合)，其中有9例轉(zhuǎn)化為陰性，只有2例為陽性，OD值分別為0.183、0.256。說明在RF吸附前此9份標(biāo)本ELISA檢出的Anti-HAV IgM陽性是由RF干擾所致，假陽性率為15.51%。用ECLIA檢測58例RF陽性的血清，陽性1例，其陽性率為 1.72%(1/58)，并且該陽性RF血清經(jīng)吸附后ELISA和ECLIA檢出的Anti-HAV IgM均為陽性，假陽性率(0%)明顯低于ELISA的15.51%。這說明高濃度RF對ELISA檢測Anti-HAV IgM有一定的影響，會出現(xiàn)假陽性，而對ECLIA檢測干擾較小。其原因推測為 ELISA檢測Anti-HAV IgM時，血清中抗HAV特異性抗體與RF同時結(jié)合固相抗人u鏈抗體載體，再加入特異抗原，隨后與加入的酶標(biāo)抗體(動物IgG)反應(yīng)，該抗體可分為兩個片段，F(xiàn)ab段和Fc段，RF可與抗體的Fc 段結(jié)合。當(dāng)RF 抗原的決定簇與IgG分子上段的空間結(jié)構(gòu)有互補(bǔ)性時才有可能結(jié)合，即只有標(biāo)本中血清存有能與IgG結(jié)合的RF時，并且RF必須達(dá)到一定的濃度，才能夠有效地與標(biāo)本中的病毒肝炎IgM抗體競爭，和抗u鏈結(jié)合產(chǎn)生較高的非特異性結(jié)合，已結(jié)合于固相載體上的RF會結(jié)合酶標(biāo)記物，進(jìn)而與顯色劑反應(yīng)造成假陽性。ECLIA法采用雙抗體夾心法[9]，標(biāo)本中的IgM與HAV抗原和釕標(biāo)記的Anti-HAV形成雙抗體夾心復(fù)合物，通過鏈霉親和素與生物素的特異性結(jié)合使復(fù)合物結(jié)合到固相載體順磁性微粒上，大大提高了檢測的靈敏度，RF濃度低于3 200 U/mL沒有任何干擾。該方法不受黃疸(膽紅素小于50 mg/dL)，溶血(血紅蛋白小于1.75 g/dL)和脂血等干擾，且Anti-HAV IgM高劑量鉤狀效應(yīng)不會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

據(jù)文獻(xiàn)報道，使用 TaqMan Rt-PCR方法可以檢測HAV核酸RNA[10]，但因成本相對較高還未普及。因此在對高濃度RF血清標(biāo)本進(jìn)行Anti-HAV IgM檢測時，最好是對RF先中和，然后再進(jìn)行ELISA檢測，陽性者可以使用ECLIA法進(jìn)行復(fù)檢。有條件者還可以使用 TaqMan Rt-PCR方法檢測HAV核酸RNA，通過結(jié)合臨床病史和其他檢查結(jié)果進(jìn)行綜合判斷，排除干擾，以此來提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

參考文獻(xiàn)

[1]Chakvetadze C,Mallet V,Gaussec L,et al.Acute hepatitis A virus infection without IgM antibodies to hepatitis A virus[J].Ann Intern Med,2011,154(7):507-508.

[2]郭愛群，唐榮德，劉社炎，等．甲、丙、丁、戌型四型肝炎病毒抗體檢測結(jié)果分析[J]．海南醫(yī)學(xué)，2005，16(8)：142-143．

[3]李建國，呂民，馮福，等．?？谑袃和仔透窝卓贵w監(jiān)測及免疫效果分析[J]．中華流行病學(xué)雜志，2002，23(3)：238．

[4]王惠敏，王金明．類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者IgA IgM類風(fēng)濕因子的檢測及臨床意義[J]．醫(yī)學(xué)信息:上旬刊，2010，23(12)：4601-4602．

[5]Belalov IS,Isaeva OV,Lukashev AN.Recombination in hepatitis A virus:evidence for reproductive isolation of genotypes[J].J Gen Virol,2011,92(Pt 4):860-872.

[6]景紅麗．類風(fēng)濕因子(RF)對HAV-lgM、HCV-lgM抗體檢測的影響[J]．大家健康:中旬版，2013，7(1)：35-36．

[7]Kricka LJ.Interferences in immunoassay-stin a threat[J].Clin Chem,2000,46(8):1037-1038.

[8]Eriksson S,Halenius H,Pulkki K,et al.Negative interference in cardiac troponin I immunoassays by circulating troponin autoantibodies[J].Clin Chem,2005,51(5):839-847.

[9]李紅．電化學(xué)發(fā)光免疫法檢出抗HAV-IgM[J]．世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2013，13(13)：234-235．

[10]徐德順，盧亦愚，嚴(yán)菊英，等．甲肝病毒TaqMan PCR檢測方法的建立[J]．中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2007，8(3)：229-232．

(收稿日期：2015-10-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.040

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)03-0380-03