涂傳龍，莊聰文，石曉磊，翁向群

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院僑賓科，福建 福州　350025)

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漆黃素逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激鼠認(rèn)知損害及其機(jī)制

涂傳龍，莊聰文，石曉磊，翁向群

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院僑賓科，福建 福州350025)

摘要：目的探討漆黃素是否逆轉(zhuǎn)慢性束縛應(yīng)激小鼠認(rèn)知損害及其機(jī)制。方法用CD1小鼠建立慢性束縛應(yīng)激模型，漆黃素(25 mg·kg-1·d-1)灌胃給藥14 d。Morris水迷宮檢測(cè)空間學(xué)習(xí)記憶功能，Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)變化。結(jié)果漆黃素明顯改善應(yīng)激鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能，提高海馬細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK磷酸化水平，同時(shí)增加突觸蛋白synapsin I、PSD95表達(dá)。ERK特異性阻斷劑U0126完全阻斷漆黃素改善認(rèn)知。結(jié)論漆黃素改善慢性應(yīng)激鼠認(rèn)知功能，可能通過ERK通路調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：漆黃素；慢性束縛應(yīng)激；Morris水迷宮；海馬組織

應(yīng)激常激活下丘腦—垂體—腎上腺軸和提高應(yīng)激激素，即糖皮質(zhì)激素水平[1]。慢性應(yīng)激常損害海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶功能[2]。海馬與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，而其富含糖皮質(zhì)激素受體，因此，海馬組織特別易感于糖皮質(zhì)激素升高，糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期升高，比如慢性應(yīng)激，常損害海馬組織結(jié)構(gòu)，包括神經(jīng)生化、興奮性、神經(jīng)元形態(tài)，甚至神經(jīng)元死亡[3-4]。因此，慢性應(yīng)激常損害海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶功能，比如Y-迷宮空間學(xué)習(xí)記憶[5]。漆黃素(3,3',4',7-四羥基黃酮)屬于黃酮類化合物，富含于草莓等水果、蔬菜，口服可透過血腦屏障[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)漆黃素能夠抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞死亡[7]，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的活性[8]，易化海馬腦片長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)[9]，改善阿爾茨海默病(alzheimer’s disease, AD)認(rèn)知功能[10]。因此，既往這些研究表明漆黃素具有改善腦學(xué)習(xí)記憶功能。

漆黃素是否改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的認(rèn)知損害尚未見報(bào)道，我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢性束縛應(yīng)激導(dǎo)致認(rèn)知損害，包括海馬依賴的依賴的空間學(xué)習(xí)記憶功能。為證實(shí)漆黃素是否改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的認(rèn)知損害，慢性應(yīng)激鼠給予漆黃素，并觀察漆黃素是否改善認(rèn)知功能，同時(shí)探討具體的細(xì)胞分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物雄性CD1(ICR)小鼠8～10周齡，CD1小鼠購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2002-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)于環(huán)境溫度24～27℃，自由獲得食物和水，光照周期12 h。動(dòng)物適應(yīng)1周后才開始實(shí)驗(yàn)處理。

1.2藥品及試劑漆黃素粉末購買于美國(guó)Sigma公司，純度≥98%，漆黃素溶解于5%羧甲基纖維素鈉溶液，連續(xù)漆黃素灌胃(25 mg·kg-1) 14 d,對(duì)照組給予等體積5%羧甲基纖維素鈉溶液。U0126，ERK特異性阻斷劑，溶于50%二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，最終濃度為1 mg·L-1，漆黃素給藥前30 min雙側(cè)背側(cè)海馬微量注射U0126，每側(cè)注射量為0.5 μL，每天注射1次，連續(xù)給藥14 d。ERK抗體(cell signaling technology公司)、Phospho-ERK抗體(cell signaling technology公司)、Synapsin I抗體(Abcam公司)、PSD95抗體(Abcam公司)。

1.3慢性束縛應(yīng)激CD1鼠塞于50 mL通風(fēng)離心管，保持小鼠僅能呼吸運(yùn)動(dòng)，每天3 h，連續(xù)21 d，束縛應(yīng)激結(jié)束后放回飼養(yǎng)籠。束縛應(yīng)激期間對(duì)照鼠禁飲禁食3 h。

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)據(jù)以往報(bào)道[11]，略作修改。迷宮置于空間信息豐富的實(shí)驗(yàn)周圍環(huán)境，作為動(dòng)物學(xué)習(xí)過程中的空間參照物，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間周圍環(huán)境信息固定不變。水迷宮均分為4個(gè)象限，將平臺(tái)置于其中一象限中央，作為實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物逃離水環(huán)境的唯一途徑，保持平臺(tái)位置固定不變。選擇剩下的3個(gè)象限作為動(dòng)物的入水點(diǎn)，動(dòng)物面向池壁放入水中，每天訓(xùn)練4次，分別從4個(gè)象限入水，且每天所有動(dòng)物入水點(diǎn)的順序保持一致。訓(xùn)練時(shí)間為60 s，動(dòng)物放入水中，若動(dòng)物在60 s內(nèi)找到平臺(tái)，則尋平臺(tái)成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺(tái)上停留15 s，以便動(dòng)物觀察周圍環(huán)境。若動(dòng)物在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，結(jié)束此次訓(xùn)練并記錄潛伏期為60 s，并引導(dǎo)動(dòng)物登陸平臺(tái)并使其在平臺(tái)上停留15 s。每天每只動(dòng)物4次訓(xùn)練的潛伏期、游泳路程、游泳速度的平均值，作為評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。經(jīng)過5 d的訓(xùn)練學(xué)習(xí)，第6天撤去平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。將動(dòng)物從原平臺(tái)象限的對(duì)角象限面向池壁放入水中，檢測(cè)60 s內(nèi)在原平臺(tái)象限的時(shí)間比，作為評(píng)價(jià)空間記憶能力的重要指標(biāo)。

1.5突觸小體的準(zhǔn)備與Western blot適量海馬組織加入勻漿液(0.32 mol·L-1蔗糖，4 mmol·L-1HEPES (pH 7.4)，1×蛋白酶抑制劑混合物)中勻漿，勻漿液1 000×g、4℃離心10 min，上層液12 000×g、4℃離心15 min，細(xì)胞碎片重新加入勻漿液(0.32 mol·L-1蔗糖，4 mmol·L-1HEPES (pH7.4)，1×蛋白酶抑制劑混合物)中勻漿，勻漿液12 000×g、4℃離心15min，突觸小體碎片加入溶液(50 mmol·L-1HEPES (pH7.4)，2 mmol·L-1EDTA，1×蛋白酶抑制劑混合物)，即為突觸小體蛋白提取物，檢測(cè)突觸膜蛋白表達(dá)變化。BCA法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品總蛋白濃度。SDS-PAGE膠單孔上樣量20 μg總蛋白，恒壓(80～120 V)電泳，恒流250 mA電轉(zhuǎn)膜后封閉PVDF膜1 h，一抗4℃冰箱搖床孵育過夜，二抗室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗脫3次后化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)發(fā)光。

1.6腦立體定位及雙側(cè)套管安置取實(shí)驗(yàn)用小鼠，稱重，用2%戊巴比妥鈉麻醉，劑量為40 mg·kg-1。待小鼠完全麻醉后，將其固定在立體定位儀上，使其頭部固定并盡量保持水平。將針管對(duì)準(zhǔn)前囟，以前囟為基點(diǎn)，按照需要定位的腦區(qū)坐標(biāo)，在顱骨表面找到相應(yīng)位置，做上記號(hào)。用鉆頭在記號(hào)處鉆孔，將針管按照定位坐標(biāo)的深度插入到需要的腦區(qū)。用牙托粉固定套管。雙側(cè)背側(cè)海馬具體坐標(biāo)如下：(前囟為基點(diǎn))前囟向后1.8 mm，中線旁開1.4 mm，向下2.2 mm。套管安放好之后，小鼠需休息1周再展后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行資料分析。試驗(yàn)觀測(cè)資料主要為計(jì)量數(shù)據(jù)，表示為多組間的比較，為單因素方差分析+LSD多重比較；重復(fù)測(cè)量的資料則行重復(fù)測(cè)量方差分析，其組間兩兩比較為成組t檢驗(yàn)，時(shí)點(diǎn)間兩兩比較為差值t檢驗(yàn)，并采用Bonferroni法進(jìn)行顯著性水準(zhǔn)的調(diào)整。

2結(jié)果

2.1漆黃素逆轉(zhuǎn)慢性束縛應(yīng)激導(dǎo)致的認(rèn)知減退Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)定向航行試驗(yàn)及探索試驗(yàn)結(jié)果見圖1。以單因素重復(fù)測(cè)量方差分析尋找平臺(tái)潛伏期資料，提示對(duì)照組、漆黃素+應(yīng)激組訓(xùn)練天數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而應(yīng)激組訓(xùn)練天數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第1天各組小鼠尋找平臺(tái)潛伏期無顯著差異(P>0.05)，第2～5天定向航行學(xué)習(xí)，漆黃素可使應(yīng)激鼠尋找平臺(tái)潛伏期明顯縮短(P<0.01)。探索試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，應(yīng)激組在目標(biāo)象限時(shí)間百分比明顯減少(P<0.05)，而漆黃素延長(zhǎng)應(yīng)激鼠目標(biāo)象限時(shí)間百分(P<0.05)。各組小鼠尋找平臺(tái)潛伏期差異可能由于小鼠游泳能力差異造成，統(tǒng)計(jì)學(xué)發(fā)現(xiàn)第1～5天各組小鼠平均游泳速度無顯著差異(P>0.05)，說明各組小鼠自發(fā)活動(dòng)能力均正常，提示漆黃素逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激鼠空間認(rèn)知損害。

圖1　漆黃素改善慢性束縛應(yīng)激鼠

注：A.Morris水迷宮定向航行試驗(yàn)逃離潛伏期；B.空間探索試驗(yàn)平臺(tái)象限游泳時(shí)間百分比；與對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與應(yīng)激組相比，#P<0.05；C.代表性航行試驗(yàn)軌跡圖(從左至右依次為對(duì)照組、應(yīng)激組、應(yīng)激+漆黃素組)。

2.2漆黃素提高慢性束縛應(yīng)激鼠海馬突觸蛋白表達(dá)經(jīng)單因素方差分析+兩兩比較：與對(duì)照組相比，應(yīng)激組海馬突觸前蛋白Synapsin I和突觸后蛋白PSD95均表達(dá)減少(P<0.05)，慢性漆黃素處理逆轉(zhuǎn)兩種蛋白的減少(P<0.05)。突觸膜蛋白的表達(dá)變化，常提示突觸形態(tài)和數(shù)量改變,即神經(jīng)可塑性的改變。見圖2。

圖2　漆黃素增加慢性束縛應(yīng)激

注：A.western blot檢測(cè)海馬膜蛋白表達(dá)變化；B.相對(duì)蛋白條帶強(qiáng)度；與對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與應(yīng)激組相比，#P<0.05。

2.3抑制海馬ERK活性阻斷漆黃素改善認(rèn)知功能經(jīng)比較：與對(duì)照組相比，應(yīng)激組海馬磷酸化ERK表達(dá)減少(P<0.05)。應(yīng)激組與漆黃素+應(yīng)激組海馬磷酸化ERK表達(dá)具有顯著差異(P<0.01)，因此,漆黃素逆轉(zhuǎn)應(yīng)激導(dǎo)致的磷酸化ERK水平降低。各組總ERK表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？紤]到漆黃素給藥后磷酸化ERK水平增高，可能漆黃素激活ERK通路發(fā)揮作用，為證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，漆黃素灌注口服前半小時(shí)海馬局部腦區(qū)微量注射ERK阻斷劑U0126，觀察兩者之間的關(guān)系。見圖3。Morris水迷宮檢測(cè)應(yīng)激鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，第1天各組小鼠尋找平臺(tái)潛伏期無顯著差異(P>0.05)，第2～5天定向航行學(xué)習(xí)，漆黃素可使應(yīng)激鼠尋找平臺(tái)潛伏期明顯縮短(P<0.01)，漆黃素+U0126組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。探索試驗(yàn)中，雙向方差分析示漆黃素處理存在主效應(yīng)(P<0.05)，漆黃素與U0126處理存在交互作用(P<0.05)，而U0126處理主效應(yīng)無顯著差異(P>0.05)。統(tǒng)計(jì)學(xué)發(fā)現(xiàn)第1～5天各組小鼠平均游泳速度無顯著差異(P>0.05)，說明漆黃素、U0126均不影響小鼠自發(fā)活動(dòng)。見圖4。

圖3　漆黃素提高慢性束縛應(yīng)激

注：A.western blot檢測(cè)海馬磷酸化蛋白水平變化；B.相對(duì)蛋白條帶強(qiáng)度；與對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與應(yīng)激組相比，#P<0.05。

3討論

慢性應(yīng)激常伴長(zhǎng)期糖皮質(zhì)激素增高，富含糖皮質(zhì)激素受體的海馬結(jié)構(gòu)易感于應(yīng)激，而海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要部位，因此，慢性應(yīng)激可損害海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶功能。慢性應(yīng)激損害海馬的可能機(jī)制包括CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞重塑、突觸活性的抑制和海馬體積的縮小[12]。應(yīng)激是不可避免的，并且會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知損害，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢性束縛應(yīng)激損害海馬依賴的水迷宮空間學(xué)習(xí)與記憶能力，而慢性口服漆黃素可逆轉(zhuǎn)其改變。過量糖皮質(zhì)激素或行為應(yīng)激導(dǎo)致海馬錐體神經(jīng)元樹突棘萎縮和退化，導(dǎo)致神經(jīng)纖維網(wǎng)的稀疏[13]。長(zhǎng)期過量糖皮質(zhì)激素也可能導(dǎo)致海馬錐體神經(jīng)元死亡[14]。慢性束縛應(yīng)激導(dǎo)致海馬突觸膜蛋白表達(dá)減少，而漆黃素增加其表達(dá)。而突觸膜蛋白的表達(dá)增加常意味著突觸數(shù)量和密度的增加。既往研究發(fā)現(xiàn)漆黃素可激活神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的ERK通路[7]，且通過激活ERK發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性和認(rèn)知增強(qiáng)效應(yīng)[9]，最近研究發(fā)現(xiàn)激活ERK通路是漆黃素發(fā)揮保護(hù)亨廷頓病模型PC12細(xì)胞所必需[15]，且是漆黃素改善阿爾茨海默病行為改變和減輕神經(jīng)病理所必需[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢性給予漆黃素后應(yīng)激鼠海馬ERK磷酸化水平增高，為證實(shí)海馬ERK通路參與漆黃素改善應(yīng)激導(dǎo)致的認(rèn)知損害，海馬微注射ERK抑制劑U0126完全阻斷漆黃素改善認(rèn)知，從而證實(shí)ERK通路參與漆黃素改善認(rèn)知?？傊緦?shí)驗(yàn)證實(shí)慢性束縛應(yīng)激損傷海馬空間認(rèn)知，而漆黃素改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的認(rèn)知損害，通過增加海馬突觸膜蛋白表達(dá)，且通過ERK通路改變神經(jīng)可塑性來發(fā)揮改善認(rèn)知功能。

圖4　ERK阻斷劑完全拮抗漆黃素改善慢性

注：A.Morris水迷宮定向航行試驗(yàn)逃離潛伏期；B.空間探索試驗(yàn)平臺(tái)象限游泳時(shí)間比；與應(yīng)激組對(duì)比，*P<0.05。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sharvit A,Segal M,Kehat O,et al. Differential modulation of synaptic plasticity and local circuit activity in the dentate gyrus and CA1 regions of the rat hippocampus by corticosterone[J].Stress,2015,18(3):319-327.

[2]Kim EJ,Pellman B,Kim JJ. Stress effects on the hippocampus: a critical review[J]. Learn Mem,2015,22(9):411-416.

[3]Biala YN,Bogoch Y,Bejar C,et al.Prenatal stress diminishes gender differences in behavior and in expression of hippocampal synaptic genes and proteins in rats[J].Hippocampus,2011,21(10):1114-1125.

[4]Sarabdjitsingh RA,Zhou M,Yau J,et al.Inhibiting 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 prevents stress effects on hippocampal synaptic plasticity and impairs contextual fear conditioning[J].Neuropharmacology,2014,81:231-236.

[5]Abush H,Akirav I.Cannabinoids ameliorate impairments induced by chronic stress to synaptic plasticity and short-term memory[J].Neuropsychopharmacology,2013,38(8):1521-1534.

[6]章亞兵,汪寧.中藥腦脊液藥理學(xué)研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥,2015,19(4):613-616.

[7]Ishige K,Schubert D,Sagara Y.Flavonoids protect neuronal cells from oxidative stress by three distinct mechanisms[J].Free Radic Biol Med,2001,30(4):433-446.

[8]Sagara Y,Vanhnasy J, Maher P.Induction of PC12 cell differentiation by flavonoids is dependent upon extracellular signal-regulated kinase activation[J].J Neurochem,2004,90(5):1144-1155.

[9]Maher P,Akaishi T,Abe K.Flavonoid fisetin promotes ERK-dependent long-term potentiation and enhances memory[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(44):16568-16573.

[10] Currais A,Prior M,Dargusch R,et al.Modulation of p25 and inflammatory pathways by fisetin maintains cognitive function in Alzheimer's disease transgenic mice[J].Aging Cell,2014,13(2):379-390.

[11] Stackman RW,Lora JC,Williams SB.Directional responding of C57BL/6J mice in the Morris water maze is influenced by visual and vestibular cues and is dependent on the anterior thalamic nuclei[J].J Neurosci,2012,32(30):10211-10225.

[12] BickJ,Nelson CA.Early adverse experiences and the developing brain[J].Neuropsychopharmacology,2015,133:2013-2019.

[13] Datson NA,van den Oever JM, Korobko OB,et al.Previous history of chronic stress changes the transcriptional response to glucocorticoid challenge in the dentate gyrus region of the male rat hippocampus[J].Endocrinology,2013,154(9):3261-3272.

[14] Dorey R,Pierard C,Chauveau F,et al.Stress-induced memory retrieval impairments: different time-course involvement of corticosterone and glucocorticoid receptors in dorsal and ventral hippocampus[J].Neuropsychopharmacology,2012,37(13):2870-2880.

[15] Maher P,Dargusch R,Bodai L,et al.ERK activation by the polyphenols fisetin and resveratrol provides neuroprotection in multiple models of Huntington's disease[J].Hum Mol Genet,2011,20(2):261-270.

◇藥學(xué)研究◇

Fisetin reverses cognitive impairment provoked by chronic stress

and mechanism in mice

TU Chuan-long, ZHUANG Cong-wen, SHI Xiao-lei,et al

(FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Fuzhou,Fujian350025,China)

Abstract:Objective To investigate whether fisetin treatment prevents cognitive deficits provoked by chronic stress and mechanism in mice.MethodsMice were subjected to chronic restraint stress for 21 days. Stressed mice received repeated gavage of 25 mg·kg-1fisetin once daily for 14 consecutive days. Morris water maze (MWM) task was conducted for evaluating hippocampus-associated learning and memory. The expression levels of proteins in the hippocampus of mice were analyzed by western blot. ResultsFisetin dramatically ameliorated the cognitive impairments in the stressed mice, rescued the decrease of hippocampal phospho-ERK level. Moreover, fisetin significantly improved synapse-associated proteins synapsin I and PSD95 expression. The ERK inhibitor, U0126, antagonize the fisetin-induced enhancement of cognitive function.ConclusionsFisetin improves cognitive deficits provoked by chronic stress in mice, which may attribute to ERK signaling pathway involved in the hippocampus.

Key words:fisetin;chronic restraint stress;Morris water maze;hippocampus

收稿日期：(2015-08-17，修回日期：2015-11-09)

通信作者：翁向群，女，副主任醫(yī)師，研究方向：老年病，E-mail：xqwengzj@163.com

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No 2009J01188)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.004