金孝勤，龐素秋

(中國人民解放軍第180醫(yī)院，福建 泉州　362000)

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山芝麻中化學(xué)成分與抗腫瘤活性研究

金孝勤，龐素秋

(中國人民解放軍第180醫(yī)院，福建 泉州362000)

摘要：目的研究山芝麻中的化學(xué)成分及其抗腫瘤活性。 方法采用硅膠柱層析、制備薄層層析等色譜方法，對山芝麻乙醇提取物分離純化，用波譜和薄層方法進行化合物結(jié)構(gòu)鑒定。鑒定出的化合物，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法觀察化合物對人結(jié)腸癌細胞(HT-29)和卵巢癌細胞(OVCA429)的抑制增殖作用。結(jié)果分離出的9種化合物分別是葫蘆素B(cucurbitacin B)(Ⅰ)，葫蘆素E(cucurbitacin E)(Ⅱ)，迷迭香酸(rosmarinic acid)(Ⅲ)，十二硫醇(Dodecanethiol)(Ⅳ)，β-谷甾醇(β-sitosterol)(Ⅴ)，烏蘇酸(Ursolic acid)(Ⅵ)，細辛脂素(Asarinin)(Ⅶ)，麥角甾醇(Ergosterol)(Ⅷ)，2，6-二甲氧基對醌(2,6-dimethoxy-p-quinone)(Ⅸ)。以荷瘤小鼠 S180為模型，觀察其體內(nèi)抗腫瘤作用。山芝麻的乙醇提取物在高劑量組抑瘤率為54.73%，表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性。經(jīng)過MTT分析，化合物Ⅶ的IC50值顯示對HT-29細胞顯著抗增殖作用，對OVCA429細胞表現(xiàn)出微弱的抑制活性?；衔铫鯇T-29細胞和OVCA429細胞都只有輕中度抑制作用。此外，化合Ⅲ和Ⅳ只對OVCA429細胞表現(xiàn)為輕度抑制活性，其它化合物沒有顯示針對這兩種人癌細胞系的抗增殖作用(IC50>100 μmol·L-1)。結(jié)論山芝麻具有多種化學(xué)成分，部分具有較好的抗腫瘤活性，值得更加深入的研究。

關(guān)鍵詞：山芝麻；化學(xué)成分；抗腫瘤活性

山芝麻(HelicteresangustifoliaLinn.)為梧桐科植物，別名崗油麻(《生草藥性備要》)、崗脂麻(《嶺南采藥錄》)、山油麻(《廣州植物志》)、田油麻、仙桃草(《福建民間草藥》)，野芝麻、狗屎樹(《廣西中獸醫(yī)藥植》)、假芝麻(《廣西藥植圖志》)、山麻(《閩南民間草藥》)、假油麻、山芝麻頭(《嶺南草藥志》)、白頭公、油麻甲(江西《草藥手冊》)、野麻甲、假麻甲(《廣東中草藥》)[1]。山芝麻廣泛種植于中國南部，其干燥根入藥，被傳統(tǒng)中藥學(xué)視為滋補上品。山芝麻中富含亞油酸、維生素A、維生素B1、維生素E和鈣、鎂等礦物質(zhì)[2]。山芝麻有滋補養(yǎng)血、調(diào)經(jīng)補腎、護肝、潤腸、軟化皮膚，利尿、緩瀉等功用，用于輔助治療慢性便秘、耳鳴、齒齦炎、貧血，脫發(fā)、口角潰瘍和偏頭痛、視力減退、頭昏眼花等疾病，對于改善老年人常見的疾患大有幫助[3]。

山芝麻中已發(fā)現(xiàn)的抗癌活性成分主要是木脂素類。Miyahara等用山芝麻中提取分離到的木脂素類化合物作用于人類淋巴樣白血病Molt 4B細胞，發(fā)現(xiàn)其可使Molt 4B細胞產(chǎn)生寡核小體片段碎片，并呈現(xiàn)出濃度依賴性。實驗表明山芝麻中的木脂素類可抑制Molt 4B細胞的生長，并誘導(dǎo)細胞的程序性死亡。但上述只是體外實驗，山芝麻木脂素在生物體內(nèi)的抗癌效果如何，尚待進一步深入研究[4-5]。

本研究從山芝麻中分離、純化出9種化合物，分別是葫蘆素B(cucurbitacin B)(Ⅰ)、葫蘆素E(cucurbitacin E)(Ⅱ)、迷迭香酸(rosmarinic acid)(Ⅲ)、十二硫醇(Dodecanethiol)(Ⅳ)、β-谷甾醇(β-sitosterol)(Ⅴ)、烏蘇酸(Ursolic acid)(Ⅵ)、細辛脂素(Asarinin)(Ⅶ)、麥角甾醇(Ergosterol)(Ⅷ)、2，6-二甲氧基對醌(2,6-dimethoxy-p-quinone)(Ⅸ)，并采用MTT法檢測所分離化合物對HT-29人結(jié)腸癌細胞和OVCA429卵巢癌細胞的抗增殖活性。

1提取分離

1.1儀器與試劑Jasco P-1020旋光計；JascoV-550型可見/紫外分光光度計；Perkin-Elmer-983型紅外分光光度計(KBr壓片法)；VGZAB2F型質(zhì)譜儀；AM-400型核磁共振儀；硅膠(200～300目)(青島海洋化工廠)，葡聚糖凝膠LH-20(法瑪西亞生物技術(shù)AB公司)。所有溶劑都是分析純(天津市大茂化工廠，天津，中國)。山芝麻，購于泉州市醫(yī)藥公司，經(jīng)鑒定為梧桐科山芝麻的干燥根。

1.2實驗操作取干燥山芝麻5 kg,粉碎，室溫下以95%乙醇浸提24 h，回收乙醇得流浸膏，浸膏濃縮后以水溶解，分別用環(huán)己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯部分(30 g)用硅膠柱，二氯甲烷-甲醇體系梯度洗脫(100∶1→2∶1)得到A,B,C,D四個部分。A部分用硅膠柱，二氯甲烷-甲醇(20∶1～5∶1)梯度洗脫得化合物Ⅰ(10 mg)、Ⅱ(7 mg)和Ⅲ(19 mg)。B部分用硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯(10∶1～8∶1)梯度洗脫得化合物Ⅳ(20 mg)、Ⅴ(6 mg)、Ⅷ(17 mg)和Ⅸ(8 mg)。C部分用硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯(5∶1～3∶7)梯度洗脫得Ⅵ(11 mg)和Ⅶ(15 mg)。

1.3實驗結(jié)果化合物Ⅰ為白色粉末，易溶于氯仿。結(jié)合氫譜與碳譜數(shù)據(jù)與文獻[6-7]報道確定該化合物為葫蘆素B(cucurbitacin B)，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1　葫蘆素B結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅱ為白色粉末，易溶于氯仿。參照氫譜及碳譜的數(shù)據(jù)與文獻[6-8]報道確定該化合物為葫蘆素E(cucurbitacin E)，結(jié)構(gòu)式見圖2。

圖2　葫蘆素E結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅲ為白色無定形粉末，三氯化鐵-鐵氰化鉀為陽性，香莢蘭醛顯粉紅色。光譜數(shù)據(jù)與文獻[9]報道一致，故鑒定為迷迭香酸(rosmarinic acid),結(jié)構(gòu)式見圖3。

圖3　迷迭香酸結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅳ：淡黃色膠狀結(jié)晶。溶于乙酸乙酯、氯仿，微溶于甲醇，難溶水。薄層展開在紫外光下無熒光，5%濃硫酸顯紫紅色單斑。結(jié)合氫譜數(shù)據(jù)和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[10]記載，確定該化合物為十二硫醇(Dodecanethiol)，結(jié)構(gòu)式見圖4。

圖4十二硫醇結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅴ為無色針狀結(jié)晶。易溶于氯仿難溶于水。Liebermann-Burchard反應(yīng)陽性，10%濃硫酸顯紫紅色。與β-谷甾醇對照品TLC展開，在三種不同的展開系統(tǒng)中比較Rf值完全一致(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1，Rf=0.4；石油醚∶丙酮=8∶1，Rf=0.51；氯仿∶乙酸乙酯=10∶1， Rf=0.45)。故確認該化合物為β-谷甾醇(β-sitosterol),結(jié)構(gòu)式見圖5。

圖5　β-谷甾醇結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅵ為黃綠色粉末狀。可溶于氯仿，微溶于乙酸乙酯、丙酮、甲醇，不溶于石油醚、水。薄層在紫外光下無熒光，5%濃硫酸顯紫紅色單斑。Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽性。其氫譜數(shù)據(jù)和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[11]記載一致，確定該化合物為烏蘇酸(Ursolic acid)，結(jié)構(gòu)式見圖6。

圖6　烏蘇酸結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅶ為無色塊狀結(jié)晶。可溶于氯仿、丙酮、甲醇,不溶于水。薄層在紫外光下無熒光，5%濃硫酸顯紫紅色單斑。結(jié)合光譜數(shù)據(jù)與文獻[12]報道，化合物Ⅶ鑒定為細辛脂素(Asarinin)，結(jié)構(gòu)式見圖7。

圖7　細辛脂素結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅷ為無色針狀晶體，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈墨綠色。經(jīng)比較光譜數(shù)據(jù)[13]與麥角甾-5-烯-3β醇的光譜值一致。將該化合物與標(biāo)準的麥角甾醇進行薄層層析對照，兩者的Rf值一致，故鑒定該化合物為麥角甾醇(Ergosterol)。結(jié)構(gòu)式見圖8。

圖8　麥角甾醇結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅸ為紅色晶體。與文獻[11]比較，該化合物與2，6-二甲氧基對醌的物理性質(zhì)及碳譜和氫譜數(shù)據(jù)一致，由此鑒定該化合物為2，6-二甲氧基對醌。結(jié)構(gòu)式見圖9。

圖9　2，6-二甲氧基對醌結(jié)構(gòu)式

2藥理實驗

2.1體內(nèi)實驗

2.1.1荷瘤小鼠造模取腹腔接種S180生長良好的KM鼠，抽取其腹水，用無菌生理鹽水按1∶3比例稀釋成瘤細胞懸液，計活細胞率在95%以上。再用生理鹽水調(diào)整瘤細胞密度為每毫升1×107個。共取60只平均體質(zhì)量在(20.37±0.68)g的KM鼠進行種瘤，每只小鼠右前肢腋下皮下接種0.2 mL，整步操作盡量在1 h內(nèi)完成。

2.1.2給藥方法接種次日， 隨機分成5組，每組12只，體重?zé)o明顯差異。模型對照組灌胃每天定時給予等體積的蒸餾水；陽性對照組每天定時腹腔注射用環(huán)磷酰胺0.02 g·kg-1；山芝麻乙醇提取物按低、中、高劑量(0.1、0.25、0.5 g·kg-1)組分別灌胃，每日1次，連續(xù)8 d。最后一次給藥的24 h后稱重，頸椎脫臼處死小鼠。剪開腫瘤部位，完整剝離瘤塊、胸腺和脾臟，用濾紙吸凈血和液體，稱取質(zhì)量，計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。計算公式如下：

(公式1)

(公式2)

(公式3)

2.1.3結(jié)果計算得出結(jié)果如表1，低劑量組與中劑量組與環(huán)磷酰胺組之間的抑瘤率有顯著差異，而高劑量組則無明顯差異。由體質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)變化分析發(fā)現(xiàn)，隨著劑量增加，體質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均增加，而腫瘤質(zhì)量在三個劑量組均呈現(xiàn)降低。

表1　 體內(nèi)抗腫瘤相關(guān)指標(biāo)的對比分析

注：與模型對照組比較，*P<0.05,**P≤0.01。

2.2體外實驗化合物的抗增殖效應(yīng)通過MTT實驗評價。實驗采用人結(jié)腸癌細胞HT-29和卵巢癌細胞OVCA429(購于美國ATCC)。HT-29和OVCA 429細胞在含有10%胎牛血清(Hyclone)和抗生素(100 IU·mL-1的青霉素和100 g·L-1硫酸鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)中，于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞調(diào)成適宜濃度的細胞懸液進行實驗。

2.2.1細胞活力的測定4×104·mL-1HT-29細胞懸液和OVCA429細胞懸液分別接種在96孔板中，每孔加細胞懸液100 μL，5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞完全貼壁后取出，棄去上清，加入藥物。對照組：加入與加藥組同量的DMSO和無血清RPMI-1640培養(yǎng)基、加藥組：藥物用DMSO溶解后，分別以無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，終濃度為6.25,12.5,25和50 μmol·L-1。每組設(shè)4個復(fù)孔，96孔板在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入新配制的10 μL MTT(10 g·L-1)。37℃孵育4 h后吸掉培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，震蕩5 min，酶標(biāo)儀測490 nm處測吸光度值。

表2　　體外實驗各提取化合物的IC50值對比

2.2.2實驗結(jié)果在MTT分析中，多柔比星作為陽性對照，對HT-29細胞的IC50為(0.62±0.13)μmol·L-1，對OVA429細胞的IC50值(1.03±0.21)μmol·L-1?；衔铫鞯腎C50值顯示對HT-29細胞有顯著抗增殖作用，為(0.78±0.65)μmol·L-1，但對OVCA429細胞表現(xiàn)出微弱的抑制活性，IC50值僅為(89.36±5.60)μmol·L-1?；衔铫踔挥休p中度抑制，對HT-29細胞和OVCA429細胞的IC50值分別為(19.65±3.88)和(79.07±1.78)μmol·L-1。此外，化合物Ⅳ和Ⅲ對OVCA429細胞表現(xiàn)為輕度抑制活性，IC50值分別為(26.87±2.94)μmol·L-1和(43.97±2.63)μmol·L-1。其它化合物沒有顯示針對這兩種人癌細胞系的抗增殖作用(IC50>100 μmol·L-1)。見表2。

3討論

山芝麻為民間傳統(tǒng)草藥，其用途廣，資源豐富?，F(xiàn)代研究表明，山芝麻具有抗脂質(zhì)過氧化，保護肝臟，抗丙型肝炎病毒，聲帶息肉，非特異性結(jié)腸炎，抗炎和鎮(zhèn)痛等作用，是一味較好的治療保健中藥，具有廣闊的開發(fā)前景。

雖然山芝麻醫(yī)藥市場的需求量很大，但其化學(xué)成分研究尚處于初步階段，未建立有關(guān)活性成分的質(zhì)量標(biāo)準，化學(xué)成分的活性及毒性副作用還不清楚。鑒于此，我們應(yīng)該擴大其化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用的研究，提升藥品質(zhì)量、安全性評價，充分發(fā)揮其藥用價值，從而開發(fā)民族醫(yī)藥資源，促進民族醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展。

參考文獻：

[1]魏映柔,王國才,張曉琦,等.山芝麻化學(xué)成分[J].中國中藥雜志,2011,36(9):1193-1197.

[2]方春生,楊燕軍.酸漿苦素B的體外抗腫瘤活性研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2015,32(4):652-655，660.

[3]黃必奎.山芝麻化學(xué)成分與藥理作用研究概況[J].廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2013,30(2):129-131.

[4]Chen W,Tang W,Lou L,et al.Pregnane, coumarin and lupane derivatives and cytotoxic constituents from Helicteres angustifolia[J].Phytochemistry,2006,67(10):1041-1047.

[5]喬祎雪,牟伊,黃張建,等.新型CDDO-Me類似物的合成及抗腫瘤活性[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報,2015,46(3):289-293.

[6]高媛,宋聯(lián)強,樊梅,等.馬甲子葉提取物的抗腫瘤活性研究[J].華西藥學(xué)雜志,2015,30(3):303-305.

[7]蘇丹,高玉橋,黃增芳,等.山芝麻揮發(fā)油成分的GC-MS分析[J].中國藥房,2011,22(23):2173-2174.

[8]劉向輝,李鑫,趙兵,等.山芝麻屬藥學(xué)研究概況[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012,14(10):119-121.

[9]王志強,張秀英,李文廣,等.異甘草素抗腫瘤活性及初步機制研究[J].中國藥理學(xué)通報,2015,31(8):1159-1165.

[10] Guo XD,Huang ZS,Bao YD,et al.Two new sequiterpenoids from Helicteres angustifolia[J].Chinese Chemical Letters,2005,1:49-52.

[11] 郭新東,安林坤,徐迪,等.中藥山芝麻的化學(xué)成分研究(Ⅰ)[J].中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2003,42(2):52-55.

[12] 黃必奎.山芝麻化學(xué)成分與藥理作用研究概況[J].廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2013,16(2):129-131.

[13] 高玉橋,蘇丹,張泳義,等.山芝麻三萜類化合物抗UC多靶點作用的分子對接研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2014,25(6):1369-1371.

Studies on chemical constituents and their anti-tumor activities

in roots ofHelicteresangustifolia

JIN Xiao-qin，PANG Su-qiu

(The180thHospitalofPLA,Quanzhou,Fujian362000,China)

Abstract：ObjectiveTo study the chemical constituents and the anti-tumor activity in roots ofHelicteresangustifolia(HA). MethodsSilica gel column chromatography, preparative thin layer chromatography and other chromatographic methods were used to isolate the compounds from HA spectral and thin layer methods were used to identify the compound structures.Effects of these compounds on the proliferations of HT-29 cells and OVCA-429 cells were tested by MTT method.180 mice tumor model was established to observe anti-tumor activity in vivo of HA extracts.ResultsCucurbitacin B (I), cucurbitacin E (II), rosmarinic acid (III), dodecanethio(IV), β-sitosterol(V), ursolic acid (VI), asarinin (VII), ergosterol (VIII) and 2,6-dimethoxy-p-quinone (IX) were isolated from HA.Compound VII showed a significant inhibitory activity on HT-29 cells and a weak inhibitory activity on OVCA429 cells. Compound V showed little inhibitory activity on HT-29 cells and OVCA429. In addition, the compounds IV and III only showed mild inhibitory activity on OVCA429 cells. ConclusionSome of the compounds in HA have significant anti-tumor activity, which is worthy of further study.

Key words：Helicteresangustifolia;chemical constituents;anti-tumor activity

收稿日期：(2015-07-24，修回日期：2015-10-09)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.009