蘇治?！堛`應(yīng)　萬澤房　熊文林　杜昕如　雷　昕　俞　琦

貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州　貴陽　550025

?

桑菊飲抗菌及對小鼠免疫功能影響的初步研究

蘇治福張鉦應(yīng)萬澤房熊文林杜昕如雷昕俞琦*

貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550025

【摘要】目的：觀察桑菊飲的抗菌作用和對小鼠免疫功能的影響，探討其治療上呼吸道感染等病癥的機制。方法：采用體外抗菌試驗檢測桑菊飲對不同細菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)；將小鼠隨機分為生理鹽水對照組、桑菊飲高/低劑量組，以生理鹽水和不同劑量桑菊飲連續(xù)灌胃7d，檢測各組小鼠免疫器官指數(shù)、脾淋巴細胞增殖能力和腹腔巨噬細胞吞噬能力。結(jié)果：桑菊飲對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌均有抑制作用，對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌作用最強，MIC、MBC均為50mg/ml和100mg/ml。與生理鹽水對照組比較，桑菊飲能顯著提高小鼠胸腺、脾臟指數(shù)，增強淋巴細胞增殖能力和巨噬細胞的吞噬功能(P<0.05)。結(jié)論：桑菊飲具有抗菌和增強機體免疫功能的活性，該活性是防治上呼吸道感染等癥的作用之一。

【關(guān)鍵詞】桑菊飲；抗菌；免疫功能

桑菊飲出自清代《溫病條辨》，由桑葉、菊花、連翹、苦桔梗等八味中藥組成，為辛涼解表之劑，具有宣肺止咳、疏風(fēng)清熱的功效，臨床用于外感風(fēng)熱、咳嗽初起之證，如上呼吸道感染、急性氣管炎等均可加減運用。臨床研究表明，桑菊飲對上呼吸道感染、咳嗽、支氣管炎等病癥具有顯著療效[1-4]，但對其作用機制的研究報道較少。本研究擬通過桑菊飲的抗菌試驗和對小鼠免疫器官指數(shù)、脾淋巴細胞功能和吞噬細胞吞噬能力的檢測，探討該方藥防治上呼吸道感染的作用機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1材料

1.1藥材桑葉、菊花、薄荷、苦桔梗、杏仁、連翹、葦根、生甘草均購自同仁堂貴陽藥店，經(jīng)鑒定為正品。按常規(guī)方法用水提取、濃縮，調(diào)整濃度為0.8g生藥/ml，濾過除菌后置4℃冰箱備用。

1.2試劑營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號：131010)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號：130731)購自杭州天和微生物試劑有限公司；S.S瓊脂培養(yǎng)基(批號：120725，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國GIBCO公司)；刀豆蛋白A(美國Sigma公司)；MTT(美國Amkesco公司)。

1.3儀器AB135-S型電子天平(梅特勒托利多上海公司)；3131型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；DG3021酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BIO-TEK公司)；生物顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.4菌種金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸埃希菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、肺炎鏈球菌(ATCC49619)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603)均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.5實驗動物SPF級昆明種小鼠24只，體重(20±2)g，雌雄各半，購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，動物合格證：SCXK(軍)2012-0011。

2方法

2.1體外抗菌試驗

2.1.1菌液的制備[5]采取十倍稀釋法，肺炎鏈球菌以10% 胎牛血清營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18 h，以相同培養(yǎng)基1∶10稀釋為試驗菌液；其他細菌以營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，制成1×103細菌懸液。

2.1.2最低抑菌濃度(MIC)測定采用二倍稀釋法，用相應(yīng)液體培養(yǎng)基稀釋藥物，共8個藥物濃度，分別為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25mg/ml，依次加入24孔細胞培養(yǎng)板，1ml/每孔，各孔加入試驗菌液50 μl，并設(shè)菌液和培養(yǎng)基對照孔，37℃培養(yǎng)18 h，肉眼和倒置顯微鏡下觀察有無細菌生長。以能抑制細菌生長的藥物最高稀釋度為最低抑菌濃度(MIC)。

2.1.3最低殺菌濃度(MBC)測定[6]分別取上述無細菌生長孔內(nèi)的培養(yǎng)物100 μl接種于相應(yīng)固體瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。以菌落數(shù)少于5個的藥物最高稀釋度為該藥的最小殺菌濃度(MBC)。

2.2對小鼠免疫功能的影響

2.2.1動物分組及給藥小鼠購回適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為生理鹽水對照組、桑菊飲高劑量組、桑菊飲低劑量組，每組8只。高、低劑量組分別按10 g/kg 和5 g/kg(體重)灌胃，每天2次，連續(xù)7d。生理鹽水對照組代以等體積生理鹽水。

2.2.2免疫器官指數(shù)測定末次給藥5 h后，脫頸椎處死小鼠，稱量小鼠體重，取腹腔液后，無菌分離小鼠的胸腺和脾臟，于電子天平上稱重。免疫器官系數(shù)=免疫器官重量∕體重。

2.2.3脾淋巴細胞的制備將分離的脾臟置于200目的篩網(wǎng)研磨，收集細胞懸液，4℃，600r離心8 min，棄上清。用Hank's液重懸細胞，加5 ml紅細胞裂解液作用5 min，再用Hank's液離心洗滌2次，用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞，臺盼藍染色，鏡下計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為3×106個/ml。

2.2.4MTT法測定淋巴細胞增殖能力[7]取脾細胞懸液加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml，加入ConA液75 μl(同時設(shè)不加ConA的對照孔)，置37℃，5% CO2，相對濕度為100%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h，每孔加入MTT 50 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，加入酸性異丙醇，充分混勻，用酶標(biāo)儀于波長570nm處測光密度值(OD)。

2.2.5中性紅法檢測巨噬細胞吞噬功能[8]常規(guī)方法無菌取腹腔液，調(diào)整細胞濃度至5×106個/ml。將細胞置于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后，棄上清，加入含培養(yǎng)液的濃度為0.002 g /ml中性紅溶液200μl/孔，置37℃，5% CO2培養(yǎng)3 h，離心棄上清，PBS 洗2次，除去細胞外未被吞噬的中性紅，最后加細胞裂解液(乙酸∶乙醇=1∶1)200μl，待細胞全部裂解后，用全自動酶標(biāo)儀在 520 nm測OD值。

3結(jié)果

3.1體外抗菌作用由表1可知，桑菊飲對受試的5個菌種均有明顯的抑制作用。其中，對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌作用最強，MIC、MBC分別為50mg/ml、100mg/ml。

表1　桑菊飲MIC、MBC測定結(jié)果

注：+：有細菌生長；-：無細菌生長。

3.2 對小鼠免疫器官指數(shù)的影響 由表2可知，與生理鹽水對照組比較，桑菊飲高劑量組胸腺、脾臟指數(shù)均明顯升高，低劑量組能顯著提高脾臟指數(shù)(P<0.01)。

表2桑菊飲對小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響

±s，n=8)

注：與生理鹽水對照組比較，**P<0.01。

3.3對小鼠脾淋巴細胞和腹腔巨噬細胞功能的影響由表3可知，與生理鹽水對照組比較，桑菊飲高、低劑量組小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力和腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的能力均顯著提高(P<0.05)。

±s，n=8)

注：與生理鹽水對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

4討論

上呼吸道感染屬于中醫(yī)外感疾病范疇，與“感冒”、“傷風(fēng)”、“傷寒”、“冒暑”、“傷風(fēng)發(fā)熱”等多種中醫(yī)病證有關(guān)[9]，主要由病毒、細菌等微生物入侵引起上呼吸道炎癥，表現(xiàn)為頭痛、咳嗽、流涕、咽痛等局部癥狀及發(fā)熱、乏力等全身癥狀。西醫(yī)治療以對癥治療和支持治療為主，尚無特效藥。大量臨床研究表明，中醫(yī)藥防治上呼吸道感染具有療效好、副反應(yīng)小、不易耐藥等特點，臨床應(yīng)用越來越廣泛。桑菊飲為辛涼解表劑，具有宣肺止咳、疏風(fēng)清熱的功效。藥理研究表明，方中的桑葉、菊花、連翹等具有明顯抗菌作用；杏仁、苦桔梗、生甘草具有抗炎止咳等功效。但對其組成方藥后的藥理作用研究很少，為探索該方藥防治上呼吸道感染的作用機制，我們對桑菊飲的抗菌作用和對小鼠免疫功能的影響進行了初步研究。

金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌是上呼吸道感染常見的病原體，可經(jīng)外源性或內(nèi)源性感染途徑進入呼吸道，并大量繁殖產(chǎn)生毒力。研究結(jié)果顯示，桑菊飲對以上菌種均有抑制作用，尤其是對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌作用最強，表明桑菊飲能通過抑制細菌生長而減輕感染癥狀。胸腺是中樞免疫器官，脾臟是最大的外周免疫器官，其重量可在一定程度上反映機體的免疫功能；脾臟T淋巴細胞是介導(dǎo)特異性細胞免疫的主要細胞，巨噬細胞參與了非特異性免疫和特異性免疫，在其中發(fā)揮重要的吞噬效應(yīng)和抗原提呈作用。研究結(jié)果顯示，與生理鹽水對照組比較，桑菊飲能顯著提高小鼠胸腺、脾臟指數(shù)，增強淋巴細胞增殖能力和巨噬細胞的吞噬功能(P<0.05)，高劑量組作用最明顯。提示桑菊飲對機體的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用，其可通過增強免疫器官功能、加強特異性和非特異性免疫反應(yīng)，從而達到抗菌、抗感染的治療效果，其作用具有一定的量效關(guān)系。提示桑菊飲臨床防治上呼吸道感染的機制可能與其抗菌作用和增強機體的免疫力有關(guān)。

參考文獻

[1]姬改梅.中藥桑菊飲治療支氣管炎的臨床觀察[J].航空航天醫(yī)學(xué)雜志，2015，26(7)：884-885.

[2]莫柳芬，蔣文偉.桑菊飲治療感染后咳嗽(風(fēng)熱犯肺證)的療效觀察[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，20(7)：135-136.

[3]吳曉慧.桑菊飲加減治療上呼吸道感染40例[J].陜西中醫(yī)，2009，30(4)：401-402.

[4]婁國強，荀運浩，施軍平，等. 24例甲型H1N1流感的臨床特征及桑菊飲加減治療的療效[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28(2)：368-369.

[5]徐叔云，卞如濂，陳修，等.藥理實驗方法學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002: 1647.

[6]劉平，陳光暉，鄧淑華，等.金蓮花總黃酮抗菌作用的實驗研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(6)：207-210.

[7]段立群，姚曉東，張淵，等.石斛復(fù)方制劑對小鼠免疫功能的影響[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，38(1)：41-44.

[8]張智偉，蔡琨，吳瑪莉，等.紫花地丁含藥血清對巨噬細胞吞噬功能及TOLL樣受體表達的影響[J].中國免疫學(xué)雜志，2014，30(6)：759-762.

[9]刁娟娟，李燕寧.急性上呼吸道感染中醫(yī)藥研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，14(9)：154-156.

(收稿日期：2015.10.20)

【中圖分類號】R258.5

【文獻標(biāo)志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)01-0016-02

作者簡介：蘇治福(1991-)，男，貴州人，2011級中醫(yī)專業(yè)本科生。通信作者：俞琦(1978-)，女，貴州貴陽人，碩士，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合研究。E-mail:sgyq.a@163.com

基金項目：國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201310662013)。